抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及了一株高亲和性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(glypican-3，GPC3)的全人源抗体的筛选、制备方法及其潜在的用于肝癌和黑色素瘤治疗 中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是危害很广泛的一种恶性肿瘤，在世界范围内肝癌位居全部恶性肿瘤发病男 性第5位、女性第7位，为恶性肿瘤死亡男性第2位，女性第6位。在发展中国家，其居男性 恶性肿瘤发病第3位，女性第6位，居男性恶性肿瘤死亡第2位，居女性第5位。我国的乙型 肝炎病人位居世界第一，这也直接导致我国肝癌病人高居全球榜首。调查显示，1973-1975 年、1990-1992年及2004-2005年我国肝癌死亡分别位居全部恶性肿瘤死因顺位的第3、2、 和2位（张思维等：中国肝癌发病的趋势分析和预测.《中华预防医学杂志》，2012,46(7): 588-592)。未来很长一段时间肝癌仍将是危害国内各大群众主要恶性肿瘤。阿霉素是传统 的用于肝癌治疗的药物，但缓解率仅为10-15%且不能延长患者的生存时间。近年来，随着 分子生物学、基因组学及蛋白质组学的进展，陆续问世了一系列的分子靶向药物可以用于 肝癌的救治。分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为靶点，选择针对性 的阻断剂，可有效地干预该标志性分子调控和密切相关的信号传导通路，从而达到抑制肿 瘤生长、进展及转移的效果。相对于手术、放疗、化疗三大传统治疗手段，其具有较好的分子 选择性，能高效并选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。分子靶向药物的选择性 高，广谱有效，不易发生耐药，同时安全性优于细胞毒性化疗药物，是目前肿瘤治疗领域发 展的新方向。目前，针对肝癌靶向治疗的主要研究有：以表皮生长因子受体（EGFR)为靶点 的肝癌治疗研究，目前主要包括大分子的单克隆抗体（如西妥昔单抗、尼妥珠单抗）和小分 子的化合物如吉非替尼、厄罗替尼等药物；以抗血管生成为靶点的肝癌治疗研究，VEGF单 克隆抗体Becacizumab ;多激酶抑制剂索拉非尼对原发性肝癌的治疗研究；以肝细胞生长 因子及其受体为靶点的肝癌治疗研究等。
[0003] 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican_3, GPC3)是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白。 glypican-3蛋白通过硫酸乙酰肝素葡萄糖胺聚糖链连接于核心蛋白，核心蛋白羧基末端 通过GPI锚定于细胞膜表面。glypican-3与肝癌、黑素瘤及卵巢透明细胞癌的发生和发 展密切相关。GPC3表达具有较高的特异性，在肝癌中高表达，在黑素瘤、卵巢透明细胞癌、 卵黄囊瘤、成神经细胞瘤、肝母细胞瘤和Wilm肉瘤细胞等肿瘤中少量表达，而在乳腺癌、 间皮瘤、卵巢上皮癌和肺癌中则不表达表达，在正常人组织中几乎不表达，因此其有望成 为肝癌免疫治疗的理想靶点之一（阮健等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在恶性肿瘤中的表达 及其临床应用?肿瘤，2011，31(9) :863-866)。目前，共有4个glypican-3抗体进入不 同的研究阶段。GC33(Ishiguro T，et al.Anti-glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer. Cancer Res. 2008 ；68 (23) ：9832-9838. Nakano K，et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 ；21 (10) :907_916)为 第一个进入临床研究的人源化抗体。GC33为对鼠源性母本抗体进行人源化改造后得到 的抗体，GC33识别glypican-3的羧基端（542-563)的多肽表位，主要通过抗体依赖的细 胞毒作用（ADCC)以及募集肿瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TIL)发挥抗肿瘤作用。目前完成与 索拉非尼（sorafenib)联合用药的I期临床研究（NCT00976170)，II期临床研究患者正 在招募中（NCT01507168)。YP7为高亲和力人源化抗体（Phung Y，Gao W，Man YG，Nagata S，Ho M. High-affinity monoclonal antibodies to cell surface tumor antigen glypican-3 generated through a combination of peptide immunization and flow cytometry screening. MAbs. 2012Sep_0ct ;4 (5) :592_9)，YP7 与 glypican-3 的亲和力的 KD为0.3nM，识别glypican-3的羧基端（510-560)的多肽表位。具有较强的肿瘤抑制活 性。HN3 为人源单域抗体（Feng M，et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A.2013;110(12) :E1083-1091.)。该抗体可直接抑制 HCC 细胞的增殖。 该抗体是通过菌体抗体库技术筛选得到。HN3高亲和性结合glypican-3的核心蛋白部 位。在体内、体外均对glypican-3阳性肝癌细胞有很好的抑制作用。HN3的独特性在于它 可直接抑制肿瘤细胞的增殖，参与YAP信号通路，使细胞周期阻滞。MDX-1414为全人源抗体 (Feng M, Ho M. Glypican-3 antibodies ：a new therapeutic target for liver cancer. FEBS Lett.2014 Jan 21 ;588(2) :377-82.)。MDX-1414 由 Medarex 公司从多株全人源抗体 中筛选得到，具有亲和力高，特异性强，有内在化特性，体内外研究显示有较好的抑制肿瘤 细胞生长的作用，且无明显的毒副作用。目前还处于临床前研究阶段。
[0004] 检索国内专利数据库与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican_3)治疗抗体相关专利 共12件，为中外制药株式会社（【申请号】038210576、2012101528190、2012101548137授权 公告号：CN102046200B、授权公告号：CN102850455B、授权公告号：CN101287492B、授权公告 号：CN101809162B、授权公告号：CN101186650B、授权公告号：CN101014367B、授权公告号： CN1842540B、授权公告号：CN1314803C)，其中授权公告号：CN102850455B与赞科股份有限 公司共有；米德列斯公司（授权公告号：CN101815726B)等3家国外公司所有，尚未见国内 由关单位和个人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的专利申报。在glypican-3抗体研究方面 有王玉亮等所做的一个glypican-3鼠源性单克隆的报道（王玉亮，刘涛，穆红.癌胚抗原 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备及应用。天津医药，2014,42(3) :235-238.)。本 发明所公布的是一株高亲和性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3, GPC3)的全人源抗 体的筛选、制备方法及其潜在的用于肝癌和黑色素瘤治疗中的应用。
【发明内容】
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[0005] 本发明首先人工合成了一段位于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3) C末端40个 氨基酸的（524A-563K)多肽。利用该多肽经多轮筛选，从已构建的人源大容量Fab噬菌体 抗体库中筛选到的与该多肽结合的Fab抗体。经ELISA和分子相互作用仪Biacore 3000 检测，在大肠杆菌表达的Fab抗体与该glypican-3多肽有较好的结合活性，Biacore 3000 检测二者亲和常数为6. 54X 10 SM。在此基础上，利用分子生物学的方法构建完整的抗体， 并在真核细胞中实现表达，所表达的抗体经纯化后证实与肝癌细胞株膜表面的磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3具有很好的结合活性。构建的全抗体为一种全人源抗体，用于人体治疗具有免 疫原性低、毒副作用小的特性，具有用于肝癌和黑色素瘤治疗的潜在价值。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供了一种可与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的全人源单克隆抗体，由可变 区和恒定区构成，可变区包含CDR和框架区，所述抗体的重链CDR区氨基酸序列为：
[0008] CDR1 ：GESISSGYY ；
[0009] CDR2 :MWHNGTT ;
[0010] CDR3 ：ATRGMFSPLPff ；
[0011] 所述抗体的轻链⑶R区氨基酸序列为：
[0012] CDR1:HDIRNY;
[0013] CDR2 :AESTLQN ;
[0014] CDR3 :QQLNSYPLT〇
[0015] 本发明同时提供了所述抗体的重链DNA序列为：
[0016] CDR1:GGTGAATCCATCAGTAGTGGCTACTAC ;
[0017] CDR2 :ATGTGGCACAATGGGACCACC ;
[0018] CDR3 :ACTAGAGGGATGTTTAGTCCACTGCCCTGG ;
[0019] 所述抗体的轻链DNA序列为：
[0020] CDR1 :CACGACATTAGGAATTAT ;
[0021] CDR2 :GCTGAATCCACTTTACAGAAT ;
[0022] CDR3 :CAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTC。
[0023] 本发明所述抗体的全抗体重链类别可为IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的任意一种，优选 IgGl，所述IgGl的序列为：
[0024] QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSGYYffGffIRQPPGRGLEffIGTMffHNGTTYSSPSLTGRVT ISVDRSRNRFSLKLTSVTAADTAMYYCATRGMFSPLPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0025] 本发明所述抗体的全抗体轻链类别可为k和A，优选为k，其序列为：
[0026] ELVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHDIRNYLGWYQQKPGKAPNPLISAESTLQNGVPSRFSGTGSGT EFTLTISSLQPEDFATYHCQQLNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC〇
[0027] 本发明所述抗体的表达细胞可为CHO、HEK293、NS0和Per 6哺乳动物细胞的任意 一种，优选为CH0细胞。
[0028] 本发明同时提供了所述的单克隆抗体用于制备治疗具有潜在的肝癌和黑色素瘤 疾病的药物中的用途。
【附图说明】：
[0029] 图1 :ELISA方法检测glypican-3多肽与Fab抗体结合；
[0030] 图2 :Biacore 3000检测Fab抗体和glypican-3多肽的亲和力；
[0031] 图3 :BY20 SDS-PAGE电泳；1，BY20非还原电泳；2,蛋白分子量标准；3, BY20非还 原电泳。
[0032] 图4 :免疫荧光检测BY20抗体与肝癌细胞IfepG2的结合
【具体实施方式】：
[0033] 本发明参考下述实施例进行更详细的描述。然而，本发明不局限于这些实施例。
[0034] 实施例1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican_3)C末端多肽的合成
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