专利名称：抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。特别地，本发明涉及ー种在Fe区的氨基酸序列中具有修饰并且表现出增强的ADCC活性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。
背景技术：
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)是ー种存在于细胞表面的硫酸こ酰 肝素蛋白聚糖家族，并且提示GPC3可能參与癌细胞发展和生长中的细胞分化，但是它的功能仍然没有被很好地阐明。已经发现某种结合GPC3的抗体通过其ADCC(抗体依赖的细胞毒性)活性和⑶C(补体依赖的细胞毒性)具有细胞生长抑制效果(W02003/000883，在此全文引入作为參考)。在发展利用抗体的细胞毒性活性的抗癌症剂时，期望利用的抗体具有增强的ADCC活性。因此，对于GPC3-识别抗体而言，具有增强的细胞毒性的抗-GPC3抗体是所期望的。本发明的ー个目的是提供ー种与普通抗体相比具有增强的细胞毒性的抗-GPC3抗体。发明概沭发现了ー种具有增强的ADCC活性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体可通过修饰抗体的Fe区的氨基酸序列而获得。在ー个方面，本发明提供了ー种包含在Fe区引入的一个或多个氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。在另一方面，本发明提供了ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其中Fe区的位点239、298、326、330和332处的ー个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。在另一方面，本发明提供了ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自(a) Fe区的位点332处的氨基酸残基被另ー氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。在另一方面，本发明提供了ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自(a)在Fe区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(b)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(c)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(d)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；
(e)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。在另一方面，本发明提供了ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自(a)Fe区的位点332处的氨基酸残基被谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。在另一方面，本发明提供了 ー种包含本发明的杭-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和药学上可接受的载体的抗癌剂，以及一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用本发明的抗癌剂。在另一方面，本发明提供了一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方法，包括(i)培养ー种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的多核苷酸，其中所述抗体的Fe区的位点239、298、326、330和332处的ー个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代；和(ii)从培养物中分离抗体。在另一方面，本发明提供了一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方法，包括(i)培养ー种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自(a) Fe区的位点332处的氨基酸残基被另ー氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c) Fe区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；和(ii)从培养物中分离抗体。在另一方面，本发明提供了一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方法，包括(i)培养ー种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自 (a)在Fe区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(b)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(c)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(d)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(e)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；和(ii)从培养物中分离抗体。在另一方面，本发明提供了ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自(a)具有包含SEQ ID NO :34所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(b)具有包含SEQ ID NO 35所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(c)具有包含SEQ ID NO 36所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(d)具有包含SEQ ID NO 37所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和(e)具有包含SEQ ID NO 38所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。本发明提供了 第I项.ー种包含在Fe区导入的一个或多个氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。第2项.ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其中Fe区的位点239、298、326、330和332处的ー个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。第3项.ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自(a)Fe区的位点332的氨基酸残基被另ー氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。第4项.ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自 (a)在Fe区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(b)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(c)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(d)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(e)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。第5项.ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自(a)Fe区的位点332处的氨基酸残基被谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体。第6项.ー种包含第1-5项任ー项所述的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体和药学上可接受的载体的抗癌剂。第7项.一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用如第6项所述的抗癌剂。第8项.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方法，包括(i)培养ー种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的多核苷酸，其中所述抗体的Fe区的位点239、298、326、330和332处的ー个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代；和(ii)从培养物中分离所述抗体。
第9项.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方法，包括(i)培养ー种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自(a) Fe区的位点332处的氨基酸残基被另ー氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；和(ii)从培养物中分离所述抗体。第10项.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方法，包括(i)培养ー种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自(a)在Fe区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(b)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(c)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(d)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；(e)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体；和(ii)从培养物中分离所述抗体。第11项.ー种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，其选自(a)具有包含SEQ ID NO :34所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(b)具有包含SEQ ID NO 35所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(C)具有包含SEQ ID NO 36所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(d)具有包含SEQ ID NO 37所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(e)具有包含SEQ ID NO 38所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
图I显示了制备本发明的Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的方案。图2显示了纯化的本发明的Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的SDS-PAGE分析結果。图3显示了通过凝胶滲透柱分析的纯化的Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的色谱图。图4显示了利用来源于人外周血的PBMC，Fe-修饰的和野生型人源化抗-磷脂酰 肌醇蛋白聚糖_3抗体对SK-03细胞的ADCC活性。图5显示了利用来源于小鼠骨髄的效应细胞，Fe-修饰的和野生型人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体对HepG2细胞的ADCC活性。发明详沭本发明提供了ー种在Fe区具有修饰的抗体。图I显示了本发明的Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的结构和制备方案。通常，抗体是大约150，000道尔顿的异四聚体，包含两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)。每条轻链通过一个共价ニ硫键与重链结合，并且重链之间的ニ硫键数目根据抗体的同种型而改变。重链和轻链均具有相隔一定间距的链内ニ硫键。每条重链在其ー个末端具有可变区(VH)，并且具有与其连接的多个恒定区。每条轻链在其ー个末端具有可变区(VL)，并且在另一端具有恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区平行，轻链的可变区与重链的可变区平行。确信特定氨基酸残基组成了轻链和重链可变区的界面(Clothia等人，J. Mol. Biol.，186 :651-666 (1985) ；Novotny 和 Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 4592-4596 (1985)，在此全文引入作为參考)。来源于脊椎动物的抗体的轻链基于其恒定区氨基酸序列可分为两种不同的类型，称为kappa(K)和IambdaO )。另外，抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列可分为不同的类别。抗体包括至少五种主要类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的ー些可分为亚类(同种型)，例如，IgG-l、IgG-2、IgG-3和IgG-4 ;IgA-l和IgA-2。不同类别的重链恒定区称为α、δ、ε、Y和μ。每ー类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维结构是本领域已知的。也已知在 IgG-I 的 Fe 区的序列中存在同种异型，例如，Glm(I)、nGlm(l)、Glm(2)、Glm(3)、nGlm(17)Φ (M. S. Schanfield 和 E. van Loghem, “Human Immunoglobulin Allotypes，，Handbook ofExperimental Immunology, Vol. 3, ch94, ppl-18, Blackwe丄丄 Scientific Publishers.Oxford, U. K. 1986,4th Edition，在此全文引入作为參考)。Fe区表示抗体分子的Fe片段区域，包含铰链区、CH2和CH3结构域的一部分，并且具有大约50，000的分子量。在分子用木瓜蛋白酶消化时，人IgG重链Fe区是从第225位的苏氨酸到 C 末端(Burton, D. R. 1985. Immunoglobulin G !functional sites. Mol.Immunol. 22 :161_206，在此全文引入作为參考)。此处使用的氨基酸位点的编号參照Kabat等人的“EU指数”方法(Kabat EA等人，1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. NIH,在此全文弓I入作为參考)。Fe区与效应细胞例如巨噬细胞和NK细胞的细胞表面上存在的Fe受体(FcR)结合。Fe受体參与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、过敏反应、id反应,等等。Fe受体的类型根据免疫球蛋白的亚型而改变。例如，IgG的Fe受体是Fe Y受体；IgE的Fe受体是Fe ε受体；IgA的Fe受体是Fe α受体。CH2-CH3域由CH2域和CH3域组成。人IgG重链的CH2-CH3域从第233位的丙氨酸到C-末端。Fe-修饰的杭体本发明的抗体是Fe-修饰的抗体，其中Fe区的氨基酸序列被修饰。本发明中使用的“修饰”或“位点特异性诱变(诱变)”包括用任何其他的氨基酸残基取代原始(未修饰的)氨基酸残基，删除原始氨基酸残基，和添加其他氨基酸残基，但是优选地指用任何其他 的氨基酸残基取代原始的氨基酸残基。在此所指的原始(未修饰的)氨基酸序列通常是天然Fe区序列。在上下文中，氨基酸残基的“修饰”和“诱变”以相同意义使用。在本发明中，氨基酸残基的修饰可通过使编码抗体的DNA突变而完成。在本发明中，“DNA突变”表示DNA以可能相应于待修饰的氨基酸残基的方式被突变。更特别地，其表示编码原始氨基酸残基的DNA突变为编码待修饰的氨基酸残基的DNA。通常，它表示插入、缺失或取代原始DNA中的至少ー个核苷酸以产生编码目的氨基酸残基的密码子的基因工程或诱变处理。特别地，编码原始氨基酸残基的密码子用编码待修饰的氨基酸残基的密码子取代。本领域技术人员按照已知技术可以容易地进行所述DNA突变，例如，按照位点特异性诱变方法例如PCR诱变方法(Hashimoto-Gogoh，Τ.等人，(1995)Gene 152,271-275 ；Zoller, MJ 和 Smith, Μ.，(1983)Methods EnzymoI.，100,468-500 ；Kramer, ff.等人，(1984)Nucleic Acids, Res.,12,9441-9456 ；Kramer ff.和 Fritz HJ,(1987)Methods EnzymoI. ,154,350-367 ；Kunkel,TA, (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,488-492 ；KunkeI, (1988)Methods EnzymoI.，85，2763-2766，均在此全文引入作为參考)。本发明中待修饰的Fe区的氨基酸残基的数目没有特别限制，可以修饰一个或多个(例如，从I到30个，或2、3、4或5个)氨基酸残基。优选地，Fe区的位点239、298、326、330和332处的ー个或多个氨基酸残基用其他氨基酸残基取代。另外，Fe区的任意氨基酸残基可用IgGl的任意同种异型的氨基酸残基取代，例如，用Glm(I)和nGlm⑴的氨基酸残基取代。本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体没有特别限制，只要它与磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3结合，但是优选地，该抗体特异性地与磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3结合。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的基因序列和氨基酸序列是已知的(Lage，H.等人，Gene 188 (1997)，151-156，在此全文引入作为參考)。本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体优选地是IgG，更优选 IgGl。细胞毒件本发明的包含修饰的Fe区的杭-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体与具有天然或野生型Fe区的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体相比显示出增强的细胞毒性。细胞毒性活性包括，例如，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，和补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。在本发明中，CDC活性表示由补体系统引起的细胞毒性活性；ADCC活性表示，当特异性抗体粘附到靶细胞的细胞表面抗原上，具有Fe Y受体的细胞(例如，免疫细胞)通过Fe Y受体与Fe区结合，以此损伤靶细胞。确定抗体是否具有ADCC活性或⑶C活性可根据已知方法进行(例如，见CurrentProtocols in Immunology, Chapter 7， Immunologic Studies in Humans， Eaitor, JohnE. Coligan 等人，John Wiley&Sons, Inc. (1993)，在此全文引入作为参考)。例如，ADCC活性可以如下确定混合效应細胞、靶细胞和抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体,然后分析其ADCC活性的程度。效应细胞可包括，例如，小鼠脾细胞，或分离自骨髓或人外周血的单核细胞。靶细胞可包括建立的人细胞系，例如人肝细胞系HuH-7。将抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体加入到预先用51Cr标记并孵育的靶细胞中，然后以适当的比例将效应细胞加入到靶细胞中。孵育之后，收集上清液并分析放射活性，以确定抗体的ADCC活性。 ⑶C活性可如下确定混合上述标记的靶细胞和抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体，添加补体到混合物中并孵育，然后分析上清液的放射性。技述此处所述的术语“抗体”以其最广泛的含意使用，表示任何和每种抗体，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体突变体、抗体片段、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体等，只要其显示出期望的生物学活性。抗体和免疫球蛋白是具有相同结构特征的蛋白质，并且本发明的抗体包括免疫球蛋白。此处所述的术语“单克隆抗体”表示从实质上均质的抗体组中获得的抗体，或者说，除了可能自然发生的少数突变体之外，该抗体组中的所有特定抗体是一致的。单克隆抗体是高度特异性的，通常作用于单个抗原位点。而且，与一般包括针对不同表位的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对ー种抗原上的单个表位。除了其特异性之外，单克隆抗体还具有另外ー个优点，即，它通过培养杂交瘤而合成，不会污染任何其他抗体。修饰语“单克隆”表示从实质上一致的抗体组中获得的抗体的性质，不需要通过特定方法生产抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可根据(例如)杂交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature 256 :495 (1975)，在此全文引入作为參考)或重组方法(USP4，816，567，在此全文引入作为參考)生产。本发明使用的单克隆抗体也可从噬菌体抗体文库中分离(Clackson 等人,Nature352 :624-628 (1991) ;Marks 等人，J. Mol. Biol. , 222 581-597(1991)，均在此全文引入作为參考)。术语“抗体片段”表示全长抗体的一部分。本发明中使用的抗体片段优选地是保持抗体结合活性并且保持全长抗体的细胞毒性的抗体片段。多特异性抗体是对至少两种不同抗原具有特异性的抗体。通常，这种类型的分子可与两种抗原结合(即，双特异性抗体)，但是在本说明书中，“多特异性抗体”包括对两种以上的(例如，三种)抗原具有特异性的抗体。多特异性抗体可以是全长抗体或所述抗体的片段。例如，双特异性抗体可识别两种不同的抗原或可识别ー个抗原的不同表位。另外，其可识别细胞毒性物质。本发明的抗体也可以是嵌合抗体或人源化抗体。通常，嵌合抗体包含源于非人哺乳动物抗体的可变区，和源于人抗体的恒定区。另ー方面，人源化抗体包含源于非人哺乳动物的互补决定区，和源于人抗体的框架区和恒定区。嵌合抗体中的可变区的来源和人源化抗体中的CDR的来源没有特别限制，可来源于任何动物。例如，可以利用源于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体或骆驼抗体的任何序列(CookWJ等人，Protein Eng. 1996Jul 9(7) :623-8 ;Tsurushita N等人，J Tmmunol Methods. 2004Dec295(l_2) :9-19 ；Sato K 等人，Mol Tmmunol. 1994 Apr 31(5) :371-81 ；Preparationof genetically engineered monoclonal antibodies for human immunotherapy. HumAntibodies Hybridomas. 1992 Jul 3(3) :137-45 ;Genetically engineered antibodies progress and prospects. Crit Rev Immunol. 1992 ; 12 (3-4) :125-68,均在此全文引入作为參考)。对于嵌合抗体和人源化抗体的恒定区，可利用源于人抗体的恒定区。例如，H-链可利用C Y 1> C Y 2> C Y 3> C Y 4, L-链可利用Ck和CA。嵌合抗体是通过组合源于不同动物的序列而构建的抗体，例如，它是包含小鼠抗 体的重链和轻链可变区以及人抗体的重链和轻链恒定区的抗体。所述嵌合抗体可用任何已知的方法构建。例如，连接编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA，然后将其插入到ー种表达载体中，并且导入到宿主中，以产生目标抗体。人源化抗体，也被称为重构人抗体，通过将非人哺乳动物的抗体例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区之中而构建。制备人源化抗体的常用遗传重组方法是本领域已知的(见EP 125023 ;W096/02576，在此全文引入作为參考)。特别地，为了将小鼠抗体的⑶R与人抗体的框架区(FR)连接而设计的DNA序列可通过PCR方法合成，该PCR方法使用构建为具有与⑶R和FR末端区域重叠部分的几种寡核苷酸作为引物(见W098/13388中描述的方法，在此全文引入作为參考)。选择将要与CDR连接的人抗体的框架区，以使互补决定区可形成良好的抗原结合位点。如果期望，抗体可变区的框架区的氨基酸可被取代，以使重构人抗体的互补决定区可形成适合的抗原结合位点(Sato, K.等人,Cancer Res. (1993) 53,851-856,在此全文引入作为參考)。另外，本发明的抗体也包括在上述Fe区特定位点之外的区域或⑶R区中具有ー个或多个氨基酸突变的抗体，和与本发明抗体功能等价的抗体。为了制备包含与某种多肽不同的氨基酸序列但功能等价的多肽，本领域技术人员公知向多肽中导入突变的方法。例如，本领域技术人员可按照位点特异性诱变或类似方法向本发明的抗体中导入突变，以制备与该抗体功能等价的抗体。氨基酸突变也可自发发生。优选地，一种氨基酸残基被突变为具有与原始残基接近的侧链性质的另一氨基酸残基。例如，关于其性质，氨基酸侧链包括疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、侧链含羟基的氨基酸(S、T、Y)、侧链含硫原子的氨基酸(C、M)，侧链含羧酸和氨基的氨基酸(D、N、E、Q)、侧链含碱基的氨基酸(R、K、H)，具有芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号中的字母是氨基酸的单字母代码)。已知具有通过ー个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/用任何其他氨基酸取代而从原始氨基酸序列修饰的氨基酸序列的多肽仍然实质上保持了原始多肽的生物学活性(Mark, D. F.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 ；Zoller,M. J.和 Smith, Μ· , Nucleic Acids Research (1982) 10,6487-6500 ；ffang, A.等人，Science224，1431-1433 ；Dalbadie-McFarland, G.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79，6409-6413，全部在此全文引入作为參考)。用于本发明的抗体可以是与不同类型的分子例如非肽聚合物如聚こニ醇(PEG)、放射性物质和毒素结合的偶联抗体。所述偶联抗体可通过抗体的化学修饰而获得。化学修饰方法在本领域中已经建立。本发明的抗体可包括这些偶联抗体(D. J. King.，Applications and Engineering of Monoclonal antibodies. ,1998 T.J.Internationa丄Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer. ,1998 Marcel Dekker Inc ；Chari等人，Cancer Res.，1992 Vol 152 :127 ;Liu 等人，Proc Natl Acad Sci USA.，1996 Vol 93 8681，均全文在此引入作为參考)。杭体制各 本发明的抗体可根据本领域技术人员已知的方法制备。具体而言，将编码目标抗体的DNA插入到ー种表达载体中。在此步骤中，DNA以可在表达控制区例如增强子和启动子的控制之下表达的方式插入到表达载体中。接下来，用表达载体转染宿主细胞，并且在宿主细胞中表达抗体。在这ー过程中，可利用适合的宿主和适合的表达载体的组合。载体的例子包括M13 载体、pUC 载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script。对于cDNA的亚克隆和分离，例如，也可利用pGEM-T、pDIRECT和pT7。表达载体对于抗体生产是特别有用的。当大肠杆菌例如JM109、DH5 α、HBlOl或XLl-Blue用作宿主时，表达载体必须不可缺少地具有驱动载体在大肠杆菌中有效表达的启动子，例如，IacZ 启动子(Ward 等人，Nature (1989) 341，544-546 ；FASEB J. (1992)6，2422-2427，在此全文引入作为參考)、araB启动子(Better等人，Science (1988) 240，1041-1043，在此全文引入作为參考)或T7启动子。这种类型的载体也包括PGEX-5X-1 (Pharmacia)、QIA表达系统(QIAGEN)、pEGFP和pET (在此情况中，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)。载体可包括用于多肽分泌的信号序列。对于用于多肽分泌的信号序列，例如，pelB信号序列(Lei,S. P.等人，Bacteriol. (1987) 169，4397，在此引入作为參考)可用于在大肠杆菌周质中生产。载体向宿主细胞中的导入可(例如)按照氯化钙方法或电穿孔方法来实现。除了大肠杆菌表达载体，本发明中用于多肽生产的载体包括，例如，来源于哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3 (Invitrogen)、pEGF_B0S (Nucleic acids, Res.，1990,18 (17)，p.5322，*l$A,*.,)、pEF、pCDM8);来源于昆虫细胞的表达载体(例如，Bac-toBAC杆状病毒表达系统(GIBC0 BRL)、pBacPAK8);来源于植物的表达载体(例如，pMHl、pMH2)；来源于动物病毒的表达载体(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)，来源于逆转录病毒的表达载体(例如，pZIPneo),来源于酵母的表达载体(例如，毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen)、pNVlUSP-QOl);来源于枯草杆菌的表达载体(例如，pPL608、pKTH50)。对于在动物细胞例如CHO细胞、COS细胞或NIH3T3细胞中的表达，载体必须不可缺少地具有细胞内表达所需的启动子，例如，SV40启动子(Mulligan等人，Nature (1979) 277，108，在此全文引入作为參考)、MMTV-LTR启动子、EFla启动子(Mizushima等人，NucleicAcids Res. (1990) 18，5322，在此全文引入作为參考)、CAG 启动子(Gene (1991) 108，193，在此全文引入作为參考)、CMV启动子。优选地，载体具有用于筛选被转化细胞的基因(例如，能够用药物(例如，新霉素，G418)区别的抗药性基因)。具有所述特性的载体包括，例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13。进ー步，为了在细胞中稳定基因表达和提高基因拷贝数，将具有互补的DHFR基因的载体(例如，pCHOI)导入核酸合成途径缺陷的CHO细胞中以补救该缺陷，并应用氨甲喋呤(MTX)扩增。为了基因瞬时表达的目的，用具有SV40复制起点的载体(例如，pcd)转化在染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞。复制起点也可来源于多瘤病毒、腺病毒、牛多瘤病毒(BPV)，等等。进ー步，为了在宿主细胞系统中增加基因拷贝数，表达载体可包含选择性标记物，例如氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、ニ氢叶酸还原酶(dhfr)基因。药物纟目合物本发明也涉及ー种包含本发明抗体的药物组合物。由于本发明的抗体表现出增强 的细胞毒性活性，因此它适合用于药物组合物中，并且特别地，它作为抗癌剂是有用的。由于已经表明抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体对来源于肝癌的细胞系具有细胞毒性(例如，W003/00883，在此全文引入作为參考)，本发明的抗体作为治疗肝癌的药物是特别有用的。当本发明的抗体在药物组合物中使用时，考虑到对人的抗原性，优选人源化抗体。本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括，例如，无菌水、生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、缓冲液(例如，磷酸、柠檬酸、其他有机酸)、防腐剂、表面活性剂(例如，PEG、Tween)、螯合剂(例如，EDTA)或粘合剤。另外，本发明的药物组合物可进ー步包含任何其他低分子多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸；糖，例如多糖、单糖；碳水化合物；糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇。当组合物制备为注射用水溶液吋，它可与等渗溶液组合，该等渗溶液包含，例如，生理盐水、葡萄糖或其他任何辅剂，例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，并且与适当的溶解助剂组合，例如醇(例如，こ醇)、多元醇(例如，丙ニ醇、PEG)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80、HC0-50)。如果期望，可将组合物包封到微胶囊中(羟甲基纤维素、明胶、聚(甲基丙烯酸甲酷)等的微胶囊)，或可形成为胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒、纳米胶囊)(见 Remington' s Pharmaceutical Science, 16th edition, Oslo Ed.,1980，在此全文引入作为參考)。而且，配制缓释药物的方法是已知的并可应用于本发明(Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res.，1981,15 :167-277 ；Langer, Chem. Tech.，1982,12 98-105 ；USP 3, 773, 919 ；EP 58，481 ;Sidman 等人，Biopolymers 1983，22 :547-556 ;EP133，988)。组合物可通过ロ服或肠胃外施用于患者，但优选肠胃外途径。本发明药物组合物的形状(制剂剂型)没有特别限制，包括，例如，注射剂、经鼻制剂、经肺制剂、经皮制剂、冻干制剂、溶液。优选的是冻干制剂。冻干可以采用本领域技术人员公知的任何方法实现(Pharm. Biotechnol. , 2002,13，109-133 ；Int.J. Pharm.，2000，203(1-2)，1-60 ；Pharm. Res.，1997，14(8)，969-975，均在此全文引入作为參考)。例如，将组合物溶液适当地等分到冻干小瓶或类似容器中，井置于冰箱或冻干机中，或浸入冷冻剂例如丙酮/干冰和液氮中。当抗体制剂形成为高浓度溶液制剂时，它可根据本领域技术人员公知的方法制备。例如，可采用J. Pharm. Sci. , 2004,93 (6)，1390-1402(在此全文引入作为參考)描述的利用TFF膜的膜浓缩法。注射制剂可以全身或局部给药，例如，以静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射的方式。根据施用组合物的患者的年龄和状况，可适当地选择给药方法。剂量可选自，例如，单元剂量为从O. 0001mg/kg体重到1000mg/kg体重的范围。可选地,剂量可选自O. 001到IOOOOOmg/体重的范围。然而，本发明不应局限于上述剂量和给药方法。本发明将參考下面的实施例进行更详细的描述，但本发明不应局限于这些实施例。
实施例实施例I :Fc_修饰的抗-GPC3抗体的产生
实施例1-1 :用于诱变的Fe盒的制备Fe修饰的人源化抗-GPC3抗体在SEQ ID NO : 19所示的H-链氨基酸序列中具有下表所示的氨基酸取代。图I显示了本发明的Fe-修饰的抗体的结构和制备策略。
V22「 I332E
V209S239D/A330L/I332E
V212S239D/S298A/I332E
V922S239D/K326T/I332E
V1608S239D/S298A/K326T/I332E
V209nGlm(l) S239D/A330L/I332E/D356E/L358M利用SEQ ID NO 1到NO 9所示的引物，根据PCR步移法产生了用于构建五种名为V22、V209、V212、V922和V1608的Fe-修饰抗体的Fe-突变盒。具体地，通用引物Fl和通用Rl用于V22、V209和V922 ;引物212-F1和212-F1用于V212和V1608。在下述的PCR反应溶液中进行第一阶段PCR 混合5 μ I的X 10K0D缓冲液、分别5 μ I和2 μ I的dNTPs和MgCl2 (附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(2(^11101/1，各1“1)、(1!120 35. 5 μ I和5单位/μ IKOD聚合酶0. 5 μ 1，以产生50 μ I的总量。PCR在下述条件下进行。96 0C I 分钟；(98 0C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 15 秒)X 2 循环；74°C 30 秒；4°C。取出一微升的第一阶段扩增产物，用于接下来的第二阶段PCR反应。具体地，通用引物F2和212-R2用于V22和V212 ;通用引物F2和209-R2用于V209 ;通用引物F2和922-R2用于V922 ;通用引物F2和1608-R2用于V1608。第二阶段PCR在下述PCR反应溶液中进行混合X 10K0D缓冲液5 μ I、dNTPs和MgCl2分别5 μ I和2 μ I (附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(20μπιΟ1/1，各1μ 1)、1μ I的第一阶段扩增产物作为模板、dH20 35. 5 μ I和5单位/ μ I KOD聚合酶0. 5 μ 1，以产生51 μ I的总量。PCR在下述条件下进行。
96 °C I 分钟；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 15 秒)X 5 循环；74°C 30 秒；4°C。取出一微升的第二阶段扩增产物，用于接下来的第三阶段PCR反应。具体地，通用引物F3和通用R3用于V22、V209、V212、V922和V1608，第三阶段PCR在下述PCR反应溶液
中进行。混合X 10K0D缓冲液5 μ I、dNTPs和MgCl2分别5 μ I和2 μ I (附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(2(^11101/1，各1レ1)、1レ1的第二阶段扩增产物作为模板、dH20 35. 5 μ I和5单位/μ IKOD聚合酶O. 5μ1，以产生51 μ I的总量。利用这些，在下述条件下进行PCR。960C I 分钟；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 20 秒)X 35 循环；74°C I 分钟；4°C。·
将获得的每个片段亚克隆入pBluescriptSK+中并确认其序列。正向引物212-F1(SEQID NO 1)agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacgccacgtaccgtgtggtcagcgtcc正向引物通用F2(SEQ ID NO 2)tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggagg正向引物通用F3(SEQ ID NO 3)gcacctgagctcctggggggaccggacgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg反向引物212-R1(SEQID NO 4)ggagaccttgcacttgtactccttgccattcagccagtcctggtgcaggacggtgaggacgctgaccacacggtacgtggcgttgtactgctcc反向引物209-R2(SEQID NO 5)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggcagtgggagggctttgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物212-R2(SEQID NO 6)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggctttgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物922-R2(SEQID NO 7)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcggtgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物1608-R2(SEQID NO 8)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcctcgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物通用R3 (SEQ ID NO 9)gagctccccgggatgggggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgg实施例1-2 :表达Fe-修饰的抗-GPC3抗体的载体的制备根据发明人先前制备的编码人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的基因(H-链，SEQ ID NO :10 ;L-链，SEQ ID NO :11)，构建ー种用于表达本发明的Fe-修饰的抗-GPC3抗体的载体，其在下面的实施例中被称为“野生型”。野生型人源化抗-GPC3抗体的H-链可变区和L-链可变区的氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NO 21 (ver. k)和 SEQ ID NO 22 (ver. a)中。野生型人源化抗-GPC3 抗体的 CDR序列显示如下。H-链CDRl DYEMH (SEQ ID NO 23)CDR2 ALDPKTCDTAYSQKFKG(SEQ ID NO :24)CDR3 FYSYTY(SEQ ID NO 25)
L-链CDRl RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO 26)CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO 27)CDR3 SQNTHVPPT(SEQ ID NO 28)利用SEQ ID NO : 10所示的杭-人GPC3抗体H-链基因作为模板，利用预先引入作为沉默突变的ー个SacI位点的SEQ ID NO :11的引物和SEQ ID NO : 12的引物，在下述条件下进行PCR。混合X 10K0D缓冲液5 μ I、dNTPs和MgCl2分别5 μ I和2 μ I (附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入如上所述的引物组合(2(^11101/1，各14 1)、14 1的GPC3抗体H-链基因作为模板、dH20 34. 5 μ I和5单位/ μ I KOD聚合酶O. 5 μ 1，以得到50 μ I的总量。在下述条件下进行PCR。960C I 分钟；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 30 秒)X 35 循环；74°C 30 秒；4°C。将获得的片段导入到pBluescriptSK+(pB-Sacless)的SmaI位点内，其中SacI位点已经事先用DNA平端化试剂盒(Takara Bio)补平，并且确认其序列(pB-GPCSacmt)。接下来，从包含SEQ ID NO 10所示抗-GPC3抗体H-链基因的载体上切下大约290bp的SmaI-BamHI片段，该片段对应于抗-人GPC3抗体H-链的C-末端序列，将该片段导入到pB-GPCSacmt (pB-GPCSacmtC)的相应位点中。接下来，将实施例1-1中产生的V22、V209、V212、V922或V1608的Fe-突变盒导入到pB-GPCSacmtC的SacI-SmaI位点中，并且确认pB-GPCSacmtC的序列。进一歩，为了完成突变的H-链的构建，将SEQ ID NO 10所示GPC3抗体H-链基因的大约415bp的EcoRI-NheI片段与其连接，以获得编码Fe-突变的H-链的基因。获得的编码突变H-链的基因用EcoRI-NotI酶切，并导入到动物细胞表达载体pCXND3(pC-aGPCh)的相应位点中。接下来，用HindIII酶切包含SEQ ID N0:13所示的抗-GPC3抗体L-链基因和启动子区的大约3. Ikb的片段，并且与pC-aGPCh的相应位点连接，以获得抗-GPC3抗体表达载体(pC-aGPChl)。V22、V209、V212、V922和V1608的载体 pC-aGPChl 被分别命名为 pC-aGPChl (22)、pC-aGPChl (209)、pC-aGPChl (212)、pC-aGPChl(922)和 pC-aGPChl(1608)。V22、V209、V212、V922和V1608的H链的氨基酸序列分别显示于V22(SEQ ID NO:29)、V209(SEQ ID NO :30)、V212 (SEQ ID NO :31)、V922 (SEQ ID NO :32)和 V1608(SEQ IDNO 33)中。V22、V209、V212、V922和V1608的CH2-CH3结构域的氨基酸序列分别显示于〔021 ￡ ATTACTGTACAAGATTCTACTCCTATACTTACTGGGGCCAGGGAA〔0220U 000^00^0>000^0^00^0>00^>00>00 000000>^000^0〔0221U TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGOI--10222U GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA〔0223Uoggtgtogtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacao
I--10224U OTTOCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG—0225U 00^00^0>000^0000^00>00>00^^0000>000>0>00^>0>
I--10226I——I^0^00 00^0 ^0>0 0000>00 0>00 00^00>0
I--10227I——Io >o1o>ooooaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccao
I--10228Uoosooo>oo>oo,po o,poo,pooggggaccgtcagtcttcctcI--10229U joooooo ooo oo>o>oCCTCATGATCTCCCGGACCCC
〔023s TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT〔0231U ^^OTCMGTTCMCTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATMI--10232U hooo o>o> oooooooc)aggagcagtacaacagcacgtaoI--10233Uο ο ο>οο ο3ο>οο οο,ροο>οο>οο>οτοοοτ6αα
I--10234I——I^000 00>0^>0 0^00 00^0^00 0 >0000^000>
I--10235I——I000000>^00>0 00>^0^00 >000 >0000>00000
〔0232 GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGI--10237U >oo o oo>oojoagcctgacctgcctggtcaaaggcttcta
I--10238I——I
I--1023S 0>0 0 0^>0 0>00>0000^0000^00^00>0^000>00
I--10240UOOTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG
〔0241U hoooagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggo〔0242U hotgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg
I--10243I——I
〔0244〕 I蓉NSIF (SEQ ID NO :11)
〔02私O」 gcr+agcaccaagggcccar+cggr+cr+r+cccccr+ggcacccr+ccr+cc
19
反向引物NS_R(SEQID NO :12)gagctcaggtgctgggcacggtgggcatgtgtgagttttgtcac杭-人GPC3 抗体 L-链(SEQ ID NO : 13)AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATT
AGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGT
GCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTC
CAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGAGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACA GTAATAGGAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAAATACACATGTTCCTCCTACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA
GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAGGTCGAGGAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACA
TATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTT实施例1-3 V209nGlm(l)同种异型的产生为获得V209的同种异型nGlm(l)、其Glm(I)同种异型，形成了用于nGlm(l)同种异型的盒。具体地，利用SEQ ID NO :14和NO :15所示的正向引物HerSmaF和反向引物HerNotR,并且利用SEQ ID NO 10所示的并且在实施例1_2中产生的抗-GPC3抗体H-链基因作为模板，在下述条件下进行PCR。
混合X 10K0D缓冲液5 μ I、dNTPs和MgCl2分别5 μ I和2 μ I (附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(2(^11101/1，各1レ1)、6 03抗体!1-链基因I μ l、dH2034. 5 μ I和5单位/ μ I KOD聚合酶O. 5 μ 1，以获得50 μ I的总量。在下述条件下进行PCR。960C I 分钟；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 30 秒)X 35 循环；74°C 30 秒；4°C。将获得的片段亚克隆入pBluescriptSK+(pBher)中，确认其序列。接下来，从实施例1-2描述的pC-aGPChl (209)中切下大约290bp的SmaI-NotI片段。另ー方面，以同样的方式从PBher中切下SmaI-NotI片段，将大约290bp的片段导入到pC-aGPChl (209)的相应位点中进行替换，以获得nGlm (I)同种异型表达载体(pC-aGPChl (209Her))。正向引物HerSmaF(SEQ ID NO :14)gggaggagatgaccaagaaccaggtcaccctgacctgcc 反向引物HerNotR(SEQ ID NO :15)tttgcggccgcttatcatttacccggagacagggagaggctc实施例2 =Fc-修饰的抗-GPC3抗体的制备实施例2-1 =Fc-修饰的抗-GPC3抗体在CHO细胞中的表达用PvuI酶切十微升的Fe-修饰的抗-GPC3抗体表达载体pC_aGPChl (22)、pC-aGPChl (209)、pC-aGPChl (212)、pC-aGPChl(922)、pC-aGPChl (1608)或pC-aGPChl (209Her)以产生线性DNA。将其通过电穿孔法在I. 5kV和25 μ F的条件下导入到2 X106/0. 6ml PBS (-)的CHO细胞(DXB11S株)中。细胞在37°C、8% CO2的培养箱中培养。在包含400 μ g/ml遗传霉素的CH0-S-SFMII培养基(Invitrogen)中筛选细胞。选择的细胞以O. 4细胞/100 μ I/孔的密度接种到96孔板中包含400 μ g/ml遗传霉素的CH0-S-SFMII培养基中，通过限制稀释法克隆细胞。用BIAC0RE 3000分析培养上清液。抗原利用其上固定有融合蛋白GST-GPC3(SEQ ID NO :16所示的抗原GST和人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的芯片定量，选择高表达的细胞。GPC3 肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK实施例2-2 =Fc-修饰的抗-GPC3抗体的纯化将表达Fe-修饰的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的CHO细胞的培养上清液加样到用包含150mM NaCl的IOmM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7. 5)平衡的rProtein ASepharose Fast Flow柱上。该柱用相同的缓冲液、用包含IM NaCl的IOmM朽1檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7. 5)、然后用IOmM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7. 5)洗涤，吸附到柱子上的蛋白质用20mM的こ酸洗脱。向包含Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的20mMこ酸级分中加入IMtris-HCl缓冲液(pH 8. 5)以将pH从5调节到6，并且通过0. 22 μ m的滤器过滤。向过滤的级分中加入相当量的MilliQ水，加样到用20mMこ酸缓冲液(PH6. 0)平衡的SP Sepharose Fast Flow柱上。该柱用相同的缓冲液洗涤，然后用包含20mM NaCl的20mMこ酸缓冲液(PH6. 0)洗脱吸附于柱子上的蛋白质，以获得纯化的Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体。图2显示了利用已知方法(Nature，227，680，1970，在此全文引入作为參考)进行的，纯化的本发明Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)結果，以分析抗体的分子量和纯度。每种纯化的Fe-修饰的人源化杭-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体在非还原条件下显示大约150KDa分子量的单一条带，在还原条件下显示大约50kDa和大约25kDa的两条条带。这些分子量与根据抗体H-链和L-链cDNAs的核苷酸序列预测的基本一致，并且进一歩与以下报道一致IgG型抗体在非还原条件下具有大约150kDa的分子量，在还原条件下H-链具有大约50kDa的分子量，L-链具有大约25kDa分子量,其中其分子内ニ硫键被切开(Antibodies, Chapter 14, Monoclonal Antibodies,在此全文引入作为參考)。已经证实，每种Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体表达为具有正确结构的抗体分子，并且同样地纯化。图3 显不了通过凝胶渗透柱(Superdex 200PC3. 2/30,GE Amersham Biosciences)分析，纯化的Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体的色谱图。实施例3 =Fc-修饰的抗-GPC3抗体的ADCC活性的测定实施例3-1 :人磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3 (GPC3)的cDNA克隆
以按照通常方法从结肠癌细胞系Caco2中制备的第一链cDNA作为模板，利用Advantage〗试剂盒(CL0NETECH)通过PCR扩增了编码人GPC3的全长cDNA。具体地，50 μ I包含2 μ I Caco2衍生的cDNA的反应溶液，I μ I的正义引物(GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT, SEQ ID NO : 17)，I μ I 反义引物(GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC，SEQ IDNO : 18)，5 μ I 的 Advantage〗10 X PCR 缓冲液，8 μ I 的 dNTX 混合物(I. 25mM)和 I. O μ I 的Advantage聚合酶混合物，进行94°C I分钟；63°C 30秒；68°C 3分钟的35个循环。利用pGEM-T Easy载体系统I (Promega)将PCR扩增产物插入到TA载体pGEM_Teasy中。产物的序列利用ABI3100 DNA测序仪进行确认。以这种方式，分离编码全长人GPC3的cDNA。人GPC3基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO : 19中，人GPC3蛋白的氨基酸序列显示于SEQ IDNO 20 中。实施例3-2 :表达全长GPC3的人肝癌细胞系(SK-03)的制备为了获得评价抗-GPC3抗体的生物学活性的细胞系，建立了一种能够表达全长GPC3的人肝癌细胞系。用PvuI处理的Iyg全长人GPC3基因表达载体与2 μ I FuGENE (Roche)混合，形成一种复合物，然后将其加入到SK-HEP-I细胞(购自ATCC)中进行基因导入。细胞在CO2培养箱中培养24小时，然后，利用含有终浓度lmg/ml的遗传霉素(Invitrogen)和10% FBS的Dulbecco MEM(D-MEMjSIGMA)选择GPC3-表达细胞。收集获得的遗传霉素抗性菌落，按照有限稀释法克隆细胞。通过利用嵌合GC33抗体和FITC-标记的山羊杭-人IgG抗体(ICN)的流式细胞术确定每个细胞克隆中人GPC3的表达，以获得稳定表达细胞系SK-03。实施例3-3 :用来源于人外周血的PBMC测定ADCC活性实施例3-3-1 :人PBMC溶液的制备从一名健康人中采集添加了肝素的外周血，用PBS(-)稀释2倍，并且覆盖于Ficol 1-Paque PLUS (Amersham)之上。离心(500 X g，30 分钟，20°C )之后，收集单核细胞部分的间层。将单核细胞洗涤三次，并且在10% FBS/RPMI中悬浮，以制备人PBMC溶液。实施例3-3-2 :靶细胞的制备SK-03细胞保存在含有lmg/ml遗传霉素和10 % FBS (ThermoTrace)的D-MEM培养基(SIGMA)中。利用细胞分离缓冲液(InvitiOgen)使细胞从培养皿上脱落，并且以IXlO4细胞/孔转移到96孔U形底板(Falcon)的每个孔中，培养I天。培养之后，加入5. 55MBq铬-51，细胞在37°C、5% CO2培养箱中进ー步培养4小吋。细胞用培养液洗涤一次，悬浮于50μ I的10% FBS/RPMI1640培养基中，以制备靶细胞。实施例3-3-3 :铬释放实验(ADCC活性)将50 μ I制备为预定浓度的抗体溶液倍加入到靶细胞中，并且在室温下反应15分钟。接下来，加入100μ I人PBMC溶液(5Χ105细胞/孔)，并且离心，然后在37°C、5% CO2培养箱中培养4小吋。培养之后，离心培养板，用Y计数器计数100 μ I培养上清液的放射性。样品的比铬释放率根据下式获得比铬释放率(％ ) = (A-C) X 10(V(B-C)，其中A表示每孔中放射性(cpm)的平均值；B表示每孔中放射性(cpm)平均值，其中100 μ 12% ΝΡ-40水溶液(Nonidet Ρ_40，编号252-23，Nacalai Tesque)和50 μ I的10% FBS/RPMI培养液加入到靶细胞中；C表示每孔中的放射性(cpm)平均值，其中150 μ I的10% FBS/RPMI培养液加入到靶细胞中。
实验重复进行三次，计算样品的ADCC活性)平均值。结果显示于图4中。Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体V22、V209、V922、V1608和V209(nGlm(l))相对于野生型抗体(WT)都具有增强的ADCC活性。其中，V22的活性比其他的低，但是在V209、V922、V1608和V209(nGlm(l))之间只发现很小的活性差别。实施例3-4 :利用来源于小鼠骨髓的效应细胞测定ADCC活性实施例3-4-1 :来源于小鼠骨髓的效应细胞悬浮液的制备从SCID小鼠(来自Nippon Clea，雄性，10周龄)的股骨中收集骨髓细胞，以5X IO5细胞/ml的密度悬浮于10% FBS/RPMI1640培养液中。小鼠GM-CSF(P印ro Tech)和人IL-2 (Pepro Tech)分别以终浓度10ng/ml和50ng/ml加入。细胞在37°C>5% CO2培养箱器中培养5天。培养之后，用刮刀使细胞脱落，用培养液洗涤一次，以5X IO6细胞/ml的密度悬浮于10% FBS/RPMI1640培养液中，以制备来源于小鼠骨髓的效应细胞悬浮液。实施例3-4-2 :靶细胞的制备人肝癌细胞!fepG2(购自 ATCC)保持在含有 10 % FBS (Thermo Trace)的 RPMI1640培养液(SIGMA)中。利用细胞分离缓冲液(InvitiOgen)使细胞从培养皿上脱落，并以
IX IO4细胞/孔的密度转移到96孔U形底培养板(Falcon)的每个孔中，培养I天。培养之后，加入5. 55MBq的铬_51，细胞在37°C、5% CO2培养箱中继续培养4小时。细胞用培养液洗涤一次，并且悬浮于50μ I的10% FBS/RPMI1640培养液中，以制备靶细胞。实施例3-4-3 :铬释放实验(ADCC活性)向靶细胞中加入50 μ I的制备为预定浓度的抗体溶液，在室温下反应15分钟。接下来，加入100 μ I来源于小鼠骨髓的效应细胞悬浮液(5Χ105细胞/孔)，离心，然后在37°C、5% CO2培养箱中培养4小时。培养之后，离心培养板，利用Y计数器计数100μ1的培养上清液的放射性。根据下式获得样品的比铬释放率比铬释放率(％ ) = (A-C) X 10(V(B-C)，其中A表示每孔中放射性(cpm)的平均值；B表示每孔中放射性(cpm)平均值，其中100 μ 12% ΝΡ-40水溶液(Nonidet P_40，编号252-23，Nacalai Tesque)和50 μ I的10% FBS/RPMI培养液加入到靶细胞；C表示每孔中的放射性(cpm)平均值，其中150 μ I的10% FBS/RPMI培养液加入到靶细胞。实验重复进行三次，计算样品的ADCC活性)平均值。
结果显示于图5中。Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体V22、V209和V1608相对于野生型抗体(WT)都具有增强的ADCC活性。エ业实用件Fe-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体在治疗癌症例如肝癌中是有用的。·
权利要求
1.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其中Fe区的位点239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。
2.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自 (a)Fe区的位点332的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
3.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自 (a)在Fe区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体； (b)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (c)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (e)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
4.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自 (a)Fe区的位点332处的氨基酸残基被谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (C)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
5.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自 (a)具有包含SEQID NO:34所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (b)具有包含SEQID NO 35所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；(C)具有包含SEQ ID NO :36所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)具有包含SEQID NO 37所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (e)具有包含SEQID NO 38所示氨基酸序列的CH2-CH3结构域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
6.权利要求1-5任一项的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其中所述抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体包含具有如SEQ ID NO: 23所示的CDRljBSEQ ID NO :24所示的CDR2和如SEQ ID NO :25所示的CDR3的H链，和具有如SEQ ID NO : 26所示的CDRl、如SEQ ID NO:27所示的CDR2和如SEQ ID NO 28所示的CDR3的L链。
7.糖-3上的同-表位，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合包含具有如SEQ ID N0:23所示的CDRU SEQ ID NO 24所示的CDR2和如SEQ ID NO 25所示的CDR3的H链和具有如SEQID NO 26 所示的 CDRUn SEQ ID NO 27 所示的 CDR2 和如 SEQ ID NO 28 所示的 CDR3 的 L链且其中Fe区的位点239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗体。
8.一种包含如权利要求1-7任一项所述的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和药学上可接受的载体的抗癌剂。
9.一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用如权利要求8所述的抗癌剂。
10.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的方法，包括 (i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体的Fe区的位点239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代；和( )从培养物中分离所述抗体。
11.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的方法，包括 (i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自 (a)Fe区的位点332处的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和 ( )从培养物中分离所述抗体。
12.—种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的方法，包括(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自 (a)在Fe区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗体； (b)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (c)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (d)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体； (e)在Fe区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和 ( )从培养物中分离所述抗体。
全文摘要
公开了一种包含在Fc区导入的一个或多个氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。优选地，在该抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体中，Fc区的位点239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。由于本发明的Fc-修饰的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体显示出增强的ADCC活性，其在治疗癌症例如肝癌中是有用的。还公开了一种包含本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和药学上可接受的载体的抗癌剂，以及一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用本发明的抗癌剂。
文档编号C07K16/18GK102850455SQ20121017800
公开日2013年1月2日 申请日期2006年10月11日 优先权日2005年10月14日
发明者G·A·拉扎尔, B·I·达希雅特, 冈部尚文, 杉本正道, 饭岛成幸, 周乡泉 申请人:中外制药株式会社, 赞科股份有限公司