专利名称：用于防止线粒体通透性改变的方法
技术领域：
本发明提供了一种芳香族阳离子肽在制备用于在有需要的哺乳动物中防止或减少细胞色素c从线粒体的释放的药物中的应用，其中所述芳香族阳离子肽由下式中的任何一种表示D-Arg-2’，6’ - 二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2，2’，6’ -二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)0
背景技术：
线粒体几乎存在于所有的真核细胞中，并且通过氧化磷酸化作用产生三磷酸腺苷(ATP)，因而对于细胞生存是必需的。阻断这一重要的功能可以导致细胞死亡。线粒体还通过积聚钙(Ca2+)而在细胞内的钙调节方面扮演重要的角色。通过膜电位驱动的单向转运体在线粒体基质内产生钙的积聚。钙的摄入激活了线粒体脱氢酶，而这在维持能量生成和氧化磷酸化方面可能是重要的。另外，线粒体可以作为过量胞浆Ca2+的储槽，从而保护细胞免受Ca2+过载和坏死。局部缺血或低血糖症可以导致线粒体功能失常，包括ATP水解和Ca2+过载。该功能失常引起线粒体通透性改变(线粒体渗透性转变，MPT)。MPT的特征有氧化磷酸化解偶联，线粒体膜电位丧失，内膜通透性增加以及肿胀。另外，线粒体膜间间隙是凋亡基因蛋白(apoptogenic proteins)的储库。因此，线粒体电位的丧失和MPT可以导致将凋亡基因蛋白释放到细胞质内。越来越多的证据表明MPT与坏死性和细胞凋亡性细胞死亡有关(Crompton, Biochem J. 341:233-249, 1999)，这并不令人奇怪。细胞的轻微损伤可能导致凋亡而不是坏死。环胞菌素可以抑制MPT。由环胞菌素A所致的MPT阻断可以抑制多种细胞类型的凋亡，包括经历局部缺血，缺氧，Ca2+过载和氧化应激的细胞(Kroemer et al. , Annu RevPhysiol. 60:619-642, 1998)。然而，环胞菌素A作为抗坏死性和凋亡性细胞死亡的治疗药物不是最好的。例如，环胞菌素A不能特异性地靶向线粒体。另外，它很难被递送到脑部。而且，由于它的免疫抑制活性减少了环胞菌素A的应用范围。四肽[DmtlDALDA (2’，6’-二甲基酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2;SS-02)分子量为640，并且在生理pH下带有3个净正电荷。[Dmt1=DALDA以非能量依赖的方式很容易穿过许多哺乳动物细胞类型的质膜(Zhao et al.，J PharmacolExp. Ther. 304:425-432, 2003)并且穿过血脑屏障(Zhao et al. , J Pharmacol Exp.Ther. 302:188-196，2002)。尽管[Dmt1] DALDA已经显示出是一种潜在的阿片样物质(U -类鸦片，opioid)受体激动剂，但它的应用还没有扩展到包括抑制MPT的方面。因此，在如局部缺血-再灌注、缺氧症、低血糖症以及由于线粒体膜通透性改变(线粒体渗透性转变)所导致的病理改变的其它的疾病和病症的情况下，需要抑制MPT。这样的疾病和病症包括多种常见的神经退行性疾病或病症。
发明内容
本发明提供一种用于在有需要的任何哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变·(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法，这些目的和其它目的可以通过本发明来实现。该方法包括给予该哺乳动物有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(C)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(P111)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3Pni是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中2a是小于或等于Pt+1的最大数，除非当a是I时，pt也可以是I。在另一具体实施例中，本发明提供一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷最小数目(Pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中，2a是小于或等于Pt+1的最大数，除非当a是I时，pt也可以是I。在又一具体实施例中，本发明提供一种在有需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该哺乳动物有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(C)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(Pni)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3Pni是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中3a是小于或等于Pt+1的最大数，除非当a是I时，pt也可以是I。在更进一步的具体实施例中，本发明提供一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(P111)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3Pni是·小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中，3a是小于或等于Pt+1的最大数，除非当a是I时，pt也可以是I。在又一具体实施例中，本发明提供了芳香族阳离子肽在制备用于在有需要的哺乳动物中防止或减少细胞色素c从线粒体的释放的药物中的应用，其中所述芳香族阳离子肽由下式中的任何一种表不D_Arg_2’，6’ - 二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2, 2’，6’ -二甲基酪氛酸-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)0在另外的实施例中，本发明提供了一种在哺乳动物的离体器官中防止或减少从线粒体的细胞色素c释放的方法，所述方法包括给予所述离体器官有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽由下式中的任何一种表示D-Arg-2’，6’ - 二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2, 2’，6’ - 二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)0
图I :线粒体中[Dmt^DALDA (SS-02)的细胞内化和聚集。(A)用荧光分光光度计测量SS-19的线粒体摄入(ex/em=320/420)。加入经分离的小鼠肝脏线粒体(0. 35mg/ml)导致SS-19荧光强度快速淬灭(灰线)。用FCCP (1.5u M)预处理的线粒体减少淬灭< 20% (黑线)。(B)经分离的线粒体用[3H]SS-02于37°C孵育(温育)2分钟。于4。。离心(16000Xg)5分钟中止摄入，测定沉淀中的放射性。用FCCP预处理的线粒体抑制[3H]SS-02摄入 20%。数据用平均值土标准误差表示；n=3,*,采用Student’s t_检验的P <0.05。(C)由丙甲甘肽诱导的线粒体肿胀使经分离的线粒体摄入的TMRM丢失，而摄入的SS-19则保持在高浓度。黑线为TMRM ;红线为SS-19。(D)如通过TMRM荧光测定的，在经分离的线粒体中加入SS-02 (200 iiM)不改变线粒体电位。加入FCCP (I. 5 iiM)引起快速去极化，而Ca2+(150 iiM)导致去极化和MPT渐进开始。图2. [Dmt1] DALDA (SS-02)保护线粒体免受Ca2+过载和3-硝基丙酸(3NP)诱导的线粒体通透性改变(MPT)。(A)经分离的线粒体用10 ii M的SS-02预处理(用下箭头表示加入)阻止了由Ca2+过载诱导的MPT的发生(上箭头)。黑线为缓冲液；红线为SS-02。(B)经分离的线粒体用SS-02预处理增加了在MPT发生前成倍加入Ca2+的线粒体耐受性。箭头指示加入缓冲液或SS-02。线I为缓冲液；线2为50 ii M的SS-02 ;线3为100 y M的SS-02。(C)SS-02剂量依赖性地延缓由ImM 3NP诱导的MPT的发生。箭头表示加入缓冲液或SS-02。线I为缓冲液，线2为0. 5 ii M的SS-02 ;线3为5 ii M的SS-02 ;线4为50 y M的SS-02。图3. [Dmt1JDALDA (SS-02)抑制线粒体肿胀和细胞色素C释放。(A)将经分离的线粒体用SS-02预处理，其剂量依赖性地抑制了由200 y M的Ca2+以剂量依赖方式诱导的线粒体肿胀。通过在540nm处的吸光度来测量肿胀。(B)SS_02抑制经分离的线粒体中由Ca2+诱导的细胞色素C的释放。细胞色素C的释放量用线粒体中总细胞色素C的百分数表示。数据用平均值土标准误差表示，n=3。(C) SS-02也能抑制由MPP+ (300 u M)诱导的线粒体肿胀。图4. D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨 酸-NH2 (SS_31)抑制线粒体肿胀和细胞色素C释放。(A)经分离的线粒体用SS-31 (10 PM)预处理阻止了由Ca2+诱导的MPT的发生。灰线为缓冲液；红线为SS-31。(B)线粒体用SS-31 (50iiM)预处理抑制了由200mM的Ca2+诱导的线粒体肿胀。通过测量在570nm处的光散射来测量肿胀。(C) SS-02和SS-31与环胞菌素(CsA)在抑制由Ca2+诱导的线粒体肿胀和细胞色素C释放的比较。细胞色素C释放量用线粒体中总细胞色素C的百分数表示。数据用平均值土标准误差表示，n=3。图5. [Dmt1] DALDA (SS-02)和 D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2 (SS-31)在经灌注的离体豚鼠心脏的局部缺血-再灌注过程中保护心肌收缩力。心脏用缓冲液或含有SS-02 (IOOnM)或SS-31 (InM)的缓冲液灌注30分钟，然后经受30分钟的全心(global)缺血。用同样的灌注溶液进行再灌注。发现在3个治疗组中存在显著的差异(双因素方差分析，P < 0. 001)。图6.向心脏停搏液中加入[Dmt^DALDA显著增强了经灌注的离体豚鼠心脏在延长的缺血之后的收缩功能。稳定30分钟后，心脏用St. Thomas心脏停搏液(CPS)或含有IOOnM的[Dmt1=DALDA的CPS灌注3分钟。通过完全阻断冠状动脉灌注90分钟来引发全心失血。随后用氧化的Krebs-Henseleit溶液进行60分钟再灌注。在接受[Dmt1]DALDA的组中缺血后收缩力被显著提高(P < 0. 001)。
具体实施例方式本发明是基于发明人的惊人发现某些芳香族阳离子肽显著地减少了经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量，甚至完全阻止了 MPT。减少经历MPT的线粒体数量以及阻止MPT是很重要的，因为MPT与哺乳动物中多种常见的疾病和病症相关。另外，哺乳动物的离体器官容易发生MPT。这些疾病和病症具有特殊的临床意义，因为在生命的某些阶段它们影响很大比例的人群。肽本发明中有用的芳香族阳离子肽是水溶性和高极性的。尽管有这些性质，但这些肽能够很容易穿过细胞膜。本发明中有用的芳香族阳离子肽包括最少3个通过肽键共价连接的氨基酸，并且优选包括最少4个通过肽键共价连接的氨基酸。本发明的芳香族阳离子肽中的氨基酸最大数目为通过肽键共价连接的约20个氨基酸。优选的氨基酸的最大数目为约12个，更优选为约9个，并且最优选为约6个。最佳的状况是，存在于该肽中的氨基酸数目为4。本发明中有用的芳香族阳离子肽中的氨基酸可以是任何氨基酸。术语“氨基酸”在本文中是指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。优选地，至少一个氨基位于相对于羧基的a位。这些氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如在哺乳动物蛋白质中自然发现的20种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gin)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(lieu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)Jf氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。其它天然存在的氨基酸包括例如在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，在产生尿的过程中哺乳动物代谢合成的鸟氨酸和瓜氨酸这些氨基酸。本发明中可用的肽可以含有一个或多个非天然存在的氨基酸。这些非天然存在的氨基酸可以是左旋(L)、右旋(D)或它们的混合物。最佳的状况是该肽不含有天然存在的氨基酸。
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非天然存在的氨基酸是那些通常不是在生物体正常代谢过程中合成，并且不是在蛋白质中天然存在的氨基酸。另外，本发明中优选的可用的非天然存在的氨基酸也不被普通的蛋白酶识别。非天然存在的氨基酸可以出现在该肽的任何位置。例如，该非天然存在的氨基酸可以位于N-末端，C-末端或在N-末端和C-末端之间的任何位置。例如，该非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基或烷芳基这些基团。烷基氨基酸的一些例子包括a-氨基丁酸、￠-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、S-氨基戊酸和e-氨基己酸。芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯乙酸，和Y-苯基-￠-氨基丁酸。非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括如向天然存在的氨基酸上添加一个或多个化学基团。例如，一个或多个化学基团可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’或6’位中的一个或多个位置上，或色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’或7’位中的一个或多个位置上。该基团是可以添加到芳香环上的任何化学基团。这些基团的一些例子包括支链或直链的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，C1-C4烃氧基(即烷氧基)，氨基，C1-C4烷基胺和C1-C4 二烷基胺(例如甲胺、二甲胺)，硝基，羟基，卤素(即氟基、氯基、溴基或碘基)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊例子包括正缬氨酸(Nva)，正亮氨酸(Nle)和羟脯氨酸(Hyp)。本发明的方法中在有用肽中的氨基酸修饰的另一个例子是该肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基衍生化。衍生化的一个例子是用氨或用如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺这些伯胺或仲胺酰胺化。衍生化的另一个例子包括用如甲醇或乙醇酯化。另外一种这样的修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基衍生化。例如，这些氨基可以被酰化。一些合适的酰基包括，例如包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷酰基，如乙酰基或丙酰基。优选的是非天然存在的氨基酸对普通蛋白酶是稳定的，更优选的是对其不敏感。对蛋白酶稳定或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-型非天然存在的氨基酸。D-氨基酸不是正常存在于蛋白质中的，尽管在某些抗菌肽中发现过它们，但它们是通过除细胞正常的核糖体蛋白合成器以外的工具合成的。本文中所使用的这些D-氨基酸可以认为是非天然存在的氨基酸。为了使对蛋白酶的敏感性降到最低，本发明的方法中有用的肽应该具有少于5个，优选少于4个，更优选少于3个，且最优选少于2个毗邻的可以被普通蛋白酶识别的L-氨基酸，无论这些氨基酸是否是天然存在的或非天然存在的。最佳的情况是，该肽仅含有D-氨基酸,而不含有L-氨基酸。如果该肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，则至少这些氨基酸中的一个优选为非天然存在的D-氨基酸(右旋精氨酸)，从而提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的例子包括容易被普通蛋白酶如肽链内切酶和胰蛋白酶切开的两个或多个毗邻的碱性氨基酸。碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在生理pH下该芳香族阳离子肽具有相对于该肽中氨基酸残基总数的最小数目的净正电荷是很重要的。生理PH下净正电荷的最小数目下文中表示为(Pm)。该肽中氨基酸残基总数下文中表示为(r)。下文讨论的净正电荷的最小数目都是在生理pH条件下。术语“生理pH”在本文中是指哺乳动物身体的组织和器官细胞中的正常pH。例如人的生理pH通常约为7. 4，但是哺乳动物中正常的生理pH可以是从约7. 0到约7. 8之间的任意pH。“净电荷”本文中是指由存在于该肽中的氨基酸所携带的正电荷数和负电荷数的差值。在本说明书中，应当理解为净电荷是在生理PH下测量的。在生理pH下具有正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。在生理pH下具有负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。通常，肽具有一个正电荷的N-末端氨基和一个负电荷的C-末端羧基。在生理pH下电荷彼此抵消。作为计算净电荷的一个例子，肽酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一个负电荷氨基酸(即，谷氨酸)和四个正电荷氨基酸(即，两个精氨酸残基，一个赖氨酸和一个组胺酸)。因此上述肽含有3个净正电荷。在本发明的一个实施例中，该芳香族阳离子肽在生理pH下净正电荷最小数目(Pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为其中3Pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷最小数目(Pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系如下
权利要求
1.芳香族阳离子肽在制备用于在有需要的哺乳动物中防止或减少细胞色素C从线粒体的释放的药物中的应用，其中所述芳香族阳离子肽由下式中的任何一种表示 D-Arg-2’，6’ - 二甲基酿氛酸-Lys-Phe-NH2, 2’，6’ - 二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)0
2.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成口服给药。
3.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成局部给药。
4.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成鼻内给药。
5.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成全身给药。
6.根据权利要求3所述的应用，其中所述肽被配制成静脉内给药。
7.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成皮下给药。
8.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成肌肉内给药。
9.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成脑室内给药。
10.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成鞘内给药。
11.根据权利要求I所述的应用，其中所述肽被配制成透皮给药。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述肽被配制成采用离子电渗疗法进行透皮给药。
13.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物正在经受局部缺血。
14.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物正在经受再灌注。
15.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物正在经受缺氧。
16.根据权利要求13所述的应用，其中所述局部缺血是由中风造成的。
17.根据权利要求13所述的应用，其中所述局部缺血是肠局部缺血。
18.根据权利要求13所述的应用，其中所述局部缺血存在于肌肉组织中。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述肌肉组织是心肌组织。
20.根据权利要求18所述的应用，其中所述肌肉组织是骨骼肌组织。
21.根据权利要求18所述的应用，其中所述肌肉组织是平滑肌组织。
22.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物正在经受缺氧。
23.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物正在患神经退行性疾病或病症。
24.根据权利要求23所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是帕金森氏症。
25.根据权利要求23所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是阿尔茨海默氏症。
26.根据权利要求23所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是亨廷顿氏症。
27.根据权利要求23所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
28.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物正在经受药物诱发的线粒体通透性改变(MPT)。
29.根据权利要求I所述的应用，其中所述哺乳动物是人类。
30.根据权利要求I所述的应用，其中细胞色素c释放由Ca2+过载导致。
31.一种在哺乳动物的离体器官中防止或减少从线粒体的细胞色素c释放的方法，所述方法包括给予所述离体器官有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽由下式中的任何一种表不: D-Arg-2^，6’ - 二甲基酷氛酸-Lys-Phe-NH2, .2，，6’ - 二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)0
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞色素c释放由Ca2+过载导致。
全文摘要
本发明提供了一种用于防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予有效量的芳香族阳离子肽，该肽具有至少一个净正电荷；最少四个氨基酸；最多约二十个氨基酸；净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及芳香基的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。本发明提供了一种如以下分子式的肽2’,6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。此外，本发明提供了一种组合物，包括如以下分子式的肽2’,6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2，以及药用载体。
文档编号C07K5/117GK102784383SQ20121017763
公开日2012年11月21日 申请日期2004年2月3日 优先权日2003年2月4日
发明者彼得·W·席勒, 赵克胜, 黑兹尔·H·塞托 申请人:科内尔研究基金会, 蒙特利尔临床研究学院