专利名称：用于防止线粒体通透性改变的方法
本申请要求于2003年2月4日提交的美国临时申请第60/444,777号和于2004年1月8日提交的美国临时申请第60/535,690号的优先权。将美国临时申请第60/444,777号和第60/535,690号的内容以引用的方式结合于本文中，作为参考。
本发明是在由国家药物滥用研究所提供的批准号为PO1DA08924-08的政府资助下完成的。在本发明中美国政府拥有一定的权利。
背景技术：
线粒体几乎存在于所有的真核细胞中，并且通过氧化磷酸化作用产生三磷酸腺苷(ATP)，因而对于细胞生存是必需的。阻断这一重要的功能可以导致细胞死亡。
线粒体还通过积聚钙(Ca2+)而在细胞内的钙调节方面扮演重要的角色。通过膜电位驱动的单向转运体在线粒体基质内产生钙的积聚。
钙的摄入激活了线粒体脱氢酶，而这在维持能量生成和氧化磷酸化方面可能是重要的。另外，线粒体可以作为过量胞浆Ca2+的储槽，从而保护细胞免受Ca2+过载和坏死。
局部缺血或低血糖症可以导致线粒体功能失常，包括ATP水解和Ca2+过载。该功能失常引起线粒体通透性改变(线粒体渗透性转变，MPT)。MPT的特征有氧化磷酸化解偶联，线粒体膜电位丧失，内膜通透性增加以及肿胀。
另外，线粒体膜间间隙是凋亡基因蛋白(apoptogenic proteins)的储库。因此，线粒体电位的丧失和MPT可以导致将凋亡基因蛋白释放到细胞质内。越来越多的证据表明MPT与坏死性和细胞凋亡性细胞死亡有关(Crompton，Biochem J.341233-249，1999)，这并不令人奇怪。细胞的轻微损伤可能导致凋亡而不是坏死。
环胞菌素可以抑制MPT。由环胞菌素A所致的MPT阻断可以抑制多种细胞类型的凋亡，包括经历局部缺血，缺氧，Ca2+过载和氧化应激的细胞(Kroemer et a1.，Annu Rev Physiol.60619-642，1998)。
然而，环胞菌素A作为抗坏死性和凋亡性细胞死亡的治疗药物不是最好的。例如，环胞菌素A不能特异性地靶向线粒体。另外，它很难被递送到脑部。而且，由于它的免疫抑制活性减少了环胞菌素A的应用范围。
四肽[Dmt1]DALDA(2’，6’-二甲基酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2；SS-02)分子量为640，并且在生理pH下带有3个净正电荷。[Dmt1]DALDA以非能量依赖的方式很容易穿过许多哺乳动物细胞类型的质膜(Zhao et a1.，J Pharmacol Exp.Ther.304425-432，2003)并且穿过血脑屏障(Zhao et al.，J Pharmacol Exp.Ther.302188-196，2002)。尽管[Dmt1]DALDA已经显示出是一种潜在的μ-阿片样物质(μ-类鸦片，opioid)受体激动剂，但它的应用还没有扩展到包括抑制MPT的方面。
因此，在如局部缺血-再灌注、缺氧症、低血糖症以及由于线粒体膜通透性改变(线粒体渗透性转变)所导致的病理改变的其它的疾病和病症的情况下，需要抑制MPT。这样的疾病和病症包括多种常见的神经退行性疾病或病症。
发明内容
本发明提供一种用于在有需要的任何哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法，这些目的和其它目的可以通过本发明来实现。该方法包括给予该哺乳动物有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
在另一具体实施例中，本发明提供一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；
(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中，2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
在又一具体实施例中，本发明提供一种在有需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该哺乳动物有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
在更进一步的具体实施例中，本发明提供一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽
(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中，3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
图1线粒体中[Dmt1]DALDA(SS-02)的细胞内化和聚集。(A)用荧光分光光度计测量SS-19的线粒体摄入(ex/em＝320/420)。加入经分离的小鼠肝脏线粒体(0.35mg/ml)导致SS-19荧光强度快速淬灭(灰线)。用FCCP(1.5μM)预处理的线粒体减少淬灭＜20％(黑线)。(B)经分离的线粒体用[3H]SS-02于37℃孵育(温育)2分钟。于4℃离心(16000×g)5分钟中止摄入，测定沉淀中的放射性。用FCCP预处理的线粒体抑制[3H]SS-02摄入～20％。数据用平均值±标准误差表示；n＝3，*，采用Student’s t-检验的P＜0.05。(C)由丙甲甘肽诱导的线粒体肿胀使经分离的线粒体摄入的TMRM丢失，而摄入的SS-19则保持在高浓度。黑线为TMRM；红线为SS-19。(D)如通过TMRM荧光测定的，在经分离的线粒体中加入SS-02(200μM)不改变线粒体电位。加入FCCP(1.5μM)引起快速去极化，而Ca2+(150μM)导致去极化和MPT渐进开始。
图2.[Dmt1]DALDA(SS-02)保护线粒体免受Ca2+过载和3-硝基丙酸(3NP)诱导的线粒体通透性改变(MPT)。(A)经分离的线粒体用10μM的SS-02预处理(用下箭头表示加入)阻止了由Ca2+过载诱导的MPT的发生(上箭头)。黑线为缓冲液；红线为SS-02。(B)经分离的线粒体用SS-02预处理增加了在MPT发生前成倍加入Ca2+的线粒体耐受性。箭头指示加入缓冲液或SS-02。线1为缓冲液；线2为50μM的SS-02；线3为100μM的SS-02。(C)SS-02剂量依赖性地延缓由1mM 3NP诱导的MPT的发生。箭头表示加入缓冲液或SS-02。线1为缓冲液，线2为0.5μM的SS-02；线3为5μM的SS-02；线4为50μM的SS-02。
图3.[Dmt1]DALDA(SS-02)抑制线粒体肿胀和细胞色素C释放。(A)将经分离的线粒体用SS-02预处理，其剂量依赖性地抑制了由200μM的Ca2+以剂量依赖方式诱导的线粒体肿胀。通过在540nm处的吸光度来测量肿胀。(B)SS-02抑制经分离的线粒体中由Ca2+诱导的细胞色素C的释放。细胞色素C的释放量用线粒体中总细胞色素C的百分数表示。数据用平均值±标准误差表示，n＝3。(C)SS-02也能抑制由MPP+(300μM)诱导的线粒体肿胀。
图4.D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(SS-31)抑制线粒体肿胀和细胞色素C释放。(A)经分离的线粒体用SS-31(10μM)预处理阻止了由Ca2+诱导的MPT的发生。灰线为缓冲液；红线为SS-31。(B)线粒体用SS-31(50μM)预处理抑制了由200mM的Ca2+诱导的线粒体肿胀。通过测量在570nm处的光散射来测量肿胀。(C)SS-02和SS-31与环胞菌素(CsA)在抑制由Ca2+诱导的线粒体肿胀和细胞色素C释放的比较。细胞色素C释放量用线粒体中总细胞色素C的百分数表示。数据用平均值±标准误差表示，n＝3。
图5.[Dmt1]DALDA(SS-02)和D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(SS-31)在经灌注的离体豚鼠心脏的局部缺血-再灌注过程中保护心肌收缩力。心脏用缓冲液或含有SS-02(100nM)或SS-31(1nM)的缓冲液灌注30分钟，然后经受30分钟的全心(global)缺血。用同样的灌注溶液进行再灌注。发现在3个治疗组中存在显著的差异(双因素方差分析，P＜0.001)。
图6.向心脏停搏液中加入[Dmt1]DALDA显著增强了经灌注的离体豚鼠心脏在延长的缺血之后的收缩功能。稳定30分钟后，心脏用St.Thomas心脏停搏液(CPS)或含有100nM的[Dmt1]DALDA的CPS灌注3分钟。通过完全阻断冠状动脉灌注90分钟来引发全心失血。随后用氧化的Krebs-Henseleit溶液进行60分钟再灌注。在接受[Dmt1]DALDA的组中缺血后收缩力被显著提高(P＜0.001)。
具体实施例方式
本发明是基于发明人的惊人发现某些芳香族阳离子肽显著地减少了经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量，甚至完全阻止了MPT。减少经历MPT的线粒体数量以及阻止MPT是很重要的，因为MPT与哺乳动物中多种常见的疾病和病症相关。另外，哺乳动物的离体器官容易发生MPT。这些疾病和病症具有特殊的临床意义，因为在生命的某些阶段它们影响很大比例的人群。
肽本发明中有用的芳香族阳离子肽是水溶性和高极性的。尽管有这些性质，但这些肽能够很容易穿过细胞膜。
本发明中有用的芳香族阳离子肽包括最少3个通过肽键共价连接的氨基酸，并且优选包括最少4个通过肽键共价连接的氨基酸。
本发明的芳香族阳离子肽中的氨基酸最大数目为通过肽键共价连接的约20个氨基酸。优选的氨基酸的最大数目为约12个，更优选为约9个，并且最优选为约6个。最佳的状况是，存在于该肽中的氨基酸数目为4。
本发明中有用的芳香族阳离子肽中的氨基酸可以是任何氨基酸。术语“氨基酸”在本文中是指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。优选地，至少一个氨基位于相对于羧基的α位。
这些氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如在哺乳动物蛋白质中自然发现的20种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
其它天然存在的氨基酸包括例如在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，在产生尿的过程中哺乳动物代谢合成的鸟氨酸和瓜氨酸这些氨基酸。
本发明中可用的肽可以含有一个或多个非天然存在的氨基酸。这些非天然存在的氨基酸可以是左旋(L)、右旋(D)或它们的混合物。最佳的状况是该肽不含有天然存在的氨基酸。
非天然存在的氨基酸是那些通常不是在生物体正常代谢过程中合成，并且不是在蛋白质中天然存在的氨基酸。另外，本发明中优选的可用的非天然存在的氨基酸也不被普通的蛋白酶识别。
非天然存在的氨基酸可以出现在该肽的任何位置。例如，该非天然存在的氨基酸可以位于N-末端，C-末端或在N-末端和C-末端之间的任何位置。
例如，该非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基或烷芳基这些基团。烷基氨基酸的一些例子包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯乙酸，和γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括如向天然存在的氨基酸上添加一个或多个化学基团。
例如，一个或多个化学基团可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’或6’位中的一个或多个位置上，或色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’或7’位中的一个或多个位置上。该基团是可以添加到芳香环上的任何化学基团。这些基团的一些例子包括支链或直链的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，C1-C4烃氧基(即烷氧基)，氨基，C1-C4烷基胺和C1-C4二烷基胺(例如甲胺、二甲胺)，硝基，羟基，卤素(即氟基、氯基、溴基或碘基)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊例子包括正缬氨酸(Nva)，正亮氨酸(Nle)和羟脯氨酸(Hyp)。
本发明的方法中在有用肽中的氨基酸修饰的另一个例子是该肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基衍生化。衍生化的一个例子是用氨或用如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺这些伯胺或仲胺酰胺化。衍生化的另一个例子包括用如甲醇或乙醇酯化。
另外一种这样的修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基衍生化。例如，这些氨基可以被酰化。一些合适的酰基包括，例如包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷酰基，如乙酰基或丙酰基。
优选的是非天然存在的氨基酸对普通蛋白酶是稳定的，更优选的是对其不敏感。对蛋白酶稳定或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-型非天然存在的氨基酸。D-氨基酸不是正常存在于蛋白质中的，尽管在某些抗菌肽中发现过它们，但它们是通过除细胞正常的核糖体蛋白合成器以外的工具合成的。本文中所使用的这些D-氨基酸可以认为是非天然存在的氨基酸。
为了使对蛋白酶的敏感性降到最低，本发明的方法中有用的肽应该具有少于5个，优选少于4个，更优选少于3个，且最优选少于2个毗邻的可以被普通蛋白酶识别的L-氨基酸，无论这些氨基酸是否是天然存在的或非天然存在的。最佳的情况是，该肽仅含有D-氨基酸，而不含有L-氨基酸。
如果该肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，则至少这些氨基酸中的一个优选为非天然存在的D-氨基酸(右旋精氨酸)，从而提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的例子包括容易被普通蛋白酶如肽链内切酶和胰蛋白酶切开的两个或多个毗邻的碱性氨基酸。碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
在生理pH下该芳香族阳离子肽具有相对于该肽中氨基酸残基总数的最小数目的净正电荷是很重要的。生理pH下净正电荷的最小数目下文中表示为(pm)。该肽中氨基酸残基总数下文中表示为(r)。
下文讨论的净正电荷的最小数目都是在生理pH条件下。术语“生理pH”在本文中是指哺乳动物身体的组织和器官细胞中的正常pH。例如人的生理pH通常约为7.4，但是哺乳动物中正常的生理pH可以是从约7.0到约7.8之间的任意pH。
“净电荷”本文中是指由存在于该肽中的氨基酸所携带的正电荷数和负电荷数的差值。在本说明书中，应当理解为净电荷是在生理pH下测量的。在生理pH下具有正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。在生理pH下具有负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有一个正电荷的N-末端氨基和一个负电荷的C-末端羧基。在生理pH下电荷彼此抵消。作为计算净电荷的一个例子，肽酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一个负电荷氨基酸(即，谷氨酸)和四个正电荷氨基酸(即，两个精氨酸残基，一个赖氨酸和一个组胺酸)。因此上述肽含有3个净正电荷。
在本发明的一个实施例中，该芳香族阳离子肽在生理pH下净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为其中3Pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系如下
在另一实施例中，该芳香族阳离子肽在净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为其中2pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系如下
在一个实施例中，净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)相等。在另一实施例中，该肽含有3或4个氨基酸残基并且具有最少一个净正电荷，优选为最少2个净正电荷以及更优选为最少3个净正电荷。
该芳香族阳离子肽具有相对于净正电荷总数(pt)最少量的芳香基团也很重要。芳香基的最小数目在下文中表示为(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这些氨基酸。例如，六肽赖氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸含有2个净正电荷(由赖氨酸和精氨酸残基贡献)和3个芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基贡献)。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽在芳香基最小数目(a)和生理pH下净正电荷总数(pt)之间的关系为其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当pt是1，a也可以是1。在该实施例中，芳香基的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系如下
在另一个实施例中，该芳香族阳离子肽在芳香基最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系为其中2a是小于或等于pt+1的最大数。在该实施例中，芳香族氨基酸残基的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系如下
在另一个实施例中，芳香基数目(a)和净正电荷总数(pt)是相等的。
羧基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，优选用例如氨进行酰胺化形成C-末端酰胺。另一种可选的方案是，C-末端氨基酸的末端羧基可以用任何伯胺或仲胺酰胺化。该伯胺或仲胺可以是，例如烷基，尤其是支链或直链C1-C4烷基、或芳基胺。相应地，该肽C-末端的氨基酸可以转化成酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。
即使天冬酰胺残基、谷酰胺残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基的自由羧基基团不位于本发明的芳香族阳离子肽的C-末端，不论它们位于该肽的任何位置都可以被酰胺化。这些内部位置的酰胺化可以用氨或任何上述的伯胺或仲胺进行。
在一个实施例中，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽是一种具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在一个具体的实施例中，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽是一种具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽包括但不限于下述肽的实例赖氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Lys-D-Arg-Tyr-NH2)，苯丙氨酸-右旋精氨酸-组氨酸(Phe-D-Arg-His)，
右旋酪氨酸-色氨酸-赖氨酸-NH2(D-Tyr-Trp-Lys-NH2)，色氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2)，酪氨酸-组氨酸-右旋甘氨酸-蛋氨酸(Tyr-His-D-Gly-Met)，苯丙氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-天冬氨酸(Phe-Arg-D-His-Asp)，酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2)，蛋氨酸-酪氨酸-右旋赖氨酸-苯丙氨酸-精氨酸(Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg)，右旋组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸(D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg)，赖氨酸-右旋谷氨酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2(Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2)，苯丙氨酸-右旋精氨酸-赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-组氨酸(Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His)，甘氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2)，缬氨酸-右旋赖氨酸-组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2)，色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸(Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys)，赖氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-NH2(Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2)，苏氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸(Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys)，
天冬氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-赖氨酸-NH2(Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2)，右旋组氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋组氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2(D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2)，丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋色氨酸-组氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe)，酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸(Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe)，苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-NH2(Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2)，苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-组氨酸-右旋赖氨酸-右旋赖氨酸-谷氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-苏氨酸(Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr)，酪氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-右旋酪氨酸-组氨酸-赖氨酸(Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys)，谷氨酸-精氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-右旋缬氨酸-苯丙氨酸-右旋组氨酸-色氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋蛋氨酸-NH2(Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2)，精氨酸-右旋亮氨酸-右旋酪氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-右旋苯丙氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-甘氨酸(Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly)，右旋谷氨酸-精氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋缬氨酸-酪氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2)，天冬氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe)，组氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-丙氨酸-精氨酸-半胱氨酸-右旋酪氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-NH2(His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2)，甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-谷氨酸-精氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-色氨酸-组氨酸-右旋赖氨酸-天冬氨酸(Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp)，以及苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-右旋组氨酸-精氨酸-酪氨酸-NH2(Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-NH2)。
在一个实施例中，本发明的方法中有用的肽具有μ-阿片样物质受体激动剂活性(即，激活μ-阿片样物质受体)。μ-阿片样物质受体的激活通常具有止痛作用。
在一些情况下，优选的是具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽。例如，在如急性疾病和病症这样的短期治疗过程中，使用可激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽是有益的。这些急性疾病和病症通常与中度或重度疼痛相关。在这些情况下，该芳香族阳离子肽的止痛作用在对病人或其它哺乳动物的治疗方案中是有益的，尽管其不能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽，但是也可以根据临床需要与或不与止痛剂结合使用。
在其它情况下，另一种可选方案优选的是不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽。例如，在如慢性疾病和病症这样的长期治疗过程中，使用能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽可能是禁忌的。在这些情况下，该芳香族阳离子肽潜在的副作用或成瘾作用可能会妨碍具有μ-阿片样物质受体激活作用的芳香族阳离子肽在对病人或其它哺乳动物的治疗方案中的使用。
潜在的副作用可以包括镇静、便秘和呼吸抑制。在这些情况下，不能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽可能是一种恰当的治疗药物。
急性病症的实例包括心脏病发作、中风(脑卒中)和外伤。外伤可以包括脑外伤和脊髓外伤。
慢性疾病和病症的例子包括如下所述的冠状动脉疾病和任何神经退行性疾病。
本发明的方法中有用的具有μ-阿片样物质受体活性的肽通常是的含有酪氨酸残基或酪氨酸N-末端(即，第一个氨基酸位置)衍生物的那些肽。优选的酪氨酸衍生物包括2’-甲基酪氨酸(Mmt)；2’，6’-二甲基酪氨酸(2’6’Dmt)；3’，5’-二甲基酪氨酸(3’5’Dmt)；N，2’，6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；以及2’-羟基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在一特别优选的实施例中，具有μ-阿片样物质受体活性的肽具有分子式为酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(为了方便以首字母缩写表示为DALDA，在本文中称作SS-01)。DALDA具有由酪氨酸、精氨酸和赖氨酸这些氨基酸提供的3个净正电荷，以及由苯丙氨酸和酪氨酸提供的2个芳香基团。DALDA的酪氨酸可以是被修饰的酪氨酸衍生物如2’，6’-二甲基酪氨酸，从而生成具有分子式为2’，6’-二甲基酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Dmt1-DALDA，在本文中称作SS-02)的化合物。
不具有μ-阿片样物质受体活性的肽通常在N-末端(即，氨基酸的位置1)不含有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物。在N-末端的氨基酸可以是除酪氨酸以外的任意天然存在的或非天然存在的氨基酸。
在一个实施例中，N-末端氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。优选的苯丙氨酸衍生物包括2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’，6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2’，6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2’-羟基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。
另一种不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽的分子式为苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Phe1-DALDA，在本文中称作SS-20)。可选替换地，该N-末端苯丙氨酸可以是苯丙氨酸的衍生物如2’，6’-二甲基苯丙氨酸(2’6’Dmp)。在氨基酸位置1含有2’，6’-二甲基苯丙氨酸的DALDA的分子式为2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(2’，6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，2’6’Dmp1-DALDA)。
在一优选实施例中，Dmt1-DALDA(SS-02)的氨基酸序列是重新排列的，使得Dmt不位于N-末端。这样不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽的例子具有的分子式为右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2)(在本说明书中称作SS-31)。
DALDA、Phe1-DALDA、SS-31、和它们的衍生物可以进一步包括功能类似物。如果该类似物具有与DALDA、Phe1-DALDA或SS-31类似的功能，则该肽被称作是DALDA、Phe1-DALDA或SS-31的功能类似物。例如，该类似物可以是DALDA、Phe1-DALDA或SS-31的取代变体，在该取代变体中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代。
DALDA、Phe1-DALDA或SS-31适宜的取代变体包括保守的氨基酸取代。氨基酸按照它们的物理化学性质可以分组如下(a)非极性氨基酸丙氨酸(A)丝氨酸(S)苏氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G)(Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G))；(b)酸性氨基酸天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q)(Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q))；(c)碱性氨基酸组氨酸(H)精氨酸(R)赖氨酸(K)(His(H)Arg(R)Lys(K))；(d)疏水性氨基酸甲硫氨酸(M)亮氨酸(L)异亮氨酸(I)缬氨酸(V)(Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V))；以及
(e)芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)酪氨酸(T)色氨酸(W)组氨酸(H)(Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H))。
肽中的一个氨基酸被同组的另一个氨基酸取代称作保守取代，并且这种可以保留原始肽的物理化学性质。相反，肽中的一个氨基酸被不同组的另一个氨基酸取代一般更有可能改变原始肽的性质。
在本发明的实践中，能激活μ-阿片样物质受体有用的类似物的例子包括但不限于表1中所示的芳香族阳离子肽。
表1
Dab＝二氨基丁酸Dap＝二氨基丙酸Dmt＝二甲基酪氨酸Mmt＝2’-甲基酪氨酸Tmt＝N，2’，6’-三甲基酪氨酸Hmt＝2’-羟基-6’-甲基酪氨酸dnsDap＝β-丹磺酰基-L-α，β-二氨基丙酸atnDap＝β-邻氨基苯甲酰基-L-α，β-二氨基丙酸Bio＝生物素。
在本发明的实践中不能激活μ-阿片样物质受体的有用的类似物的例子包括但不限于表2所示的芳香族阳离子肽。
表2
Cha＝环己基表1和表2中所示的肽中的氨基酸既可以是L-构象也可以是D-构象。
治疗方法上文所述的肽可用于治疗与MPT相关的任何疾病或病症。这些疾病和病症包括但不限于组织或器官的局部缺血和/或再灌注，缺氧症和众多的神经退行性疾病中的任意一种。需要治疗或防止MPT的哺乳动物是患这些疾病或病症的那些哺乳动物。
哺乳动物组织或器官中的局部缺血是一种由氧缺乏(缺氧)和/或葡萄糖(即，底物)缺乏所引起的多方面的病理症状。组织或器官细胞中的氧和/或葡萄糖缺乏导致能量生成能力的降低或完全丧失以及随后发生的活性离子跨膜运输的功能的丧失。氧和/或葡萄糖缺乏还可导致其它细胞膜中的病理变化，包括线粒体膜内的通透性改变。另外一些分子，如通常被封闭在线粒体中的凋亡蛋白可以泄露到细胞质中并且引起编程性细胞凋亡(apoptotic cell death)。严重的局部缺血可以导致细胞坏死。
特定组织或器官中的局部缺血或缺氧可以由对该组织或器官的血液供应的丧失或严重减少而引起。血液供应的丧失或严重减少可以由例如血栓栓塞性脑卒中、冠状动脉硬化或外周血管疾病引起。受局部缺血或缺氧影响的组织通常是肌肉，如心肌、骨骼肌或平滑肌。
受局部缺血或缺氧影响的器官可以是遭受局部缺血或缺氧的任何器官。受局部缺血或缺氧影响的器官的例子包括脑、心脏、肾和前列腺。例如，心肌缺血或缺氧通常是由动脉硬化或血栓阻塞引起的，它们导致通过心脏动脉和毛细血管血液供应输送到心肌组织的氧减少或丧失。这样的心肌缺血或缺氧可以导致受影响的心肌疼痛和坏死，并且最终可以导致心力衰竭。
骨骼肌或平滑肌中的局部缺血或缺氧可以由类似的原因引起。例如，在小肠平滑肌或四肢骨骼肌中的局部缺血或缺氧也可以由动脉硬化或血栓阻塞引起。
再灌注是向减少或阻断血流的任意组织或器官中恢复血流。例如，可以对任何受局部缺血或缺氧影响的组织或器官恢复血流。血流的恢复(再灌注)可以通过本领域技术人员已知的任意方法来实现。例如，局部缺血的心脏组织的再灌注可以通过血管成形术(血管重建术)、冠状动脉旁路移植或使用溶栓药物来实现。
本发明的方法还可以用于治疗或预防与MPT相关的神经退行性疾病。与MPT相关的神经退行性疾病包括例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化病(ALS，也称作洛盖赫里格病)。本发明的方法可以用于延缓与MPT相关的这些或其它神经退行性疾病的发生或减慢其进程。本发明的方法在治疗与MPT相关的神经退行性疾病的早期患者和易感人员时是特别有用的。
本发明中有用的肽也可以用于在移植前保存哺乳动物的器官。例如，离体器官由于缺乏血流可能易受到MPT。因此，该肽能用于在离体器官中防止MPT。
可以将离体器官置于如那些在本领域中常用的标准缓冲液中。例如，离体心脏可以置于含有上述肽的心脏停搏液中。肽在标准缓冲液中的浓度可以很容易被本领域技术人员测定。例如，该浓度可以是约0.1nM到约10μM之间，优选为约1μM到约10μM。
该肽还可以给予正在进行药物治疗疾病和病症的哺乳动物。如果该药物的副作用包括MPT，则正在使用该药物的哺乳动物将会从本发明的肽中获得极大的益处。
通过影响MPT来诱导细胞毒性的药物的例子是化疗药物阿霉素。
肽的合成本发明的方法中有用的肽可以通过本领域公知的任何方法来化学合成。合成该蛋白适宜的方法包括例如由Stuart和Young在“Solid Phase Peptide Systhesis，”第二版，Pierce Chemical Company(1984)，以及在“Solid Phase Peptide Systhesis，”Methods Enzymol.289，Academic Press，Inc，New York(1997)中所描述的方法。
给药方法在本发明的方法中，将有用的肽以减少遭受线粒体MPT的数量或阻止MPT的有效量给予哺乳动物。该有效量在临床前期测试和临床测试中用医师和临诊医师熟悉的方法来测定。
在本发明的方法中，有效量的有用肽，优选在药物组合物中，可以通过给予药物化合物的众多公知方法中的任意一种来给予有需要的哺乳动物。
该肽可以全身给药或局部给药。在一个实施例中，该肽是静脉内给药的。例如，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽可以通过快速静脉推注来给药。然而，优选的是该肽以恒速静脉灌输的方式来给药。
该肽可以在例如血管成形术或冠状动脉旁路手术中直接注射到冠状动脉中，或涂布到冠状动脉支架上。
该肽也可以口服给药、局部给药、鼻内给药、肌肉内给药、皮下给药或透皮给药。在一个优选实施例中，本发明方法中的芳香族阳离子肽的透皮给药是通过离子电渗疗法实现的，其中带电荷的肽是通过电流来透过皮肤输送的。
其它的给药途径包括脑室内或鞘内给药。脑室内给药是指给予到脑的腔室系统中。鞘内给药是指给予到脊髓的蛛网膜下的间隙中。因此，脑室内或鞘内给药可以优选用于影响中枢神经系统器官或组织的疾病和病症。在一优选实施例中，鞘内给药用于脊髓外伤。
本发明的方法中有用的肽还可以通过持续释放的方式给予哺乳动物，这在本领域是公知的。持续释放给药是在特定时间段达到一定药物水平的药物输送方法。该水平通常是由血清或血浆浓度测定的。
制药领域中已知的任何剂型都适用于本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽的给药。对于口服给药，可以使用液体或固体剂型。剂型的一些例子包括片剂、凝胶胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂、口嚼剂(chewing gum)等等。该肽可以与本领域技术人员公知的适宜的药物载体(媒介物)或赋形剂混合。载体或赋形剂的例子包括淀粉、牛奶、蔗糖、某些类型的粘土、凝胶、乳酸、硬脂酸或其盐(包括硬脂酸镁或硬脂酸钙)、滑石、植物油脂或植物油、树胶和乙二醇。
对于全身给药、脑室内给药、鞘内给药、局部给药、鼻内给药、皮下给药、或者透皮给药，本发明方法中有用的芳香族阳离子肽的剂型可以利用传统的如可以用于本领域的已知的稀释剂、载体或赋形剂等输送该肽。例如，该剂型可以含有一种或多种下述物质稳定剂，表面活性剂，优选为非离子表面活性剂，以及任选的盐和/或缓冲液。该肽可以以水溶液或冻干品的形式输送。
稳定剂可以是，例如甘氨酸这样的氨基酸；或如蔗糖、四元糖、乳糖或葡聚糖这样的寡糖。另一种可选的方案是，该稳定剂可以是，例如甘露醇这样的糖醇；或者是它们的组合物。优选的是，稳定剂或稳定剂组合物构成了肽的重量的约0.1％到约10％。
表面活性剂优选为非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯。适宜的表面活性剂的例子包括吐温20、吐温80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(醚)，如约0.001％(w/v)到约10％(w/v)的PluronicF-68。
盐或缓冲液可以分别是任意如氯化钠或磷酸钠/钾的盐或缓冲液。优选地，缓冲液使药物组合物的pH维持在约5.5到约7.5的范围内。盐和/或缓冲液也用来将摩尔渗透压浓度维持在适于给人或动物给药的水平。优选的是盐或缓冲液呈现约150μM到约300μM的粗略的等渗浓度。
在本发明的方法中，有用的肽的剂型可以另外含有一种或多种常用的添加剂。这些添加剂的一些例子包括如甘油这样的增溶剂；如苯扎氯铵(季铵化合物的混合物，称作“季铵化合物”)、苯甲醇、氯惹酮或氯丁醇这样的抗氧化剂；如吗啡衍生物这样的麻醉剂；或上述的等渗剂等。为了进一步防止氧化或其它腐败，该药物组合物可以用不渗透的塞子封装在小瓶中在氮气下保存。
该哺乳动物可以是任意哺乳动物，包括如农场动物，如羊、猪、牛和马；宠物，如狗和猫；实验动物，如大鼠、小鼠和兔。在一优选实施例中，该哺乳动物是人。
实施例实施例1[Dmt1]DALDA穿透细胞膜利用人类肠上皮细胞系(Caco-2)研究[3H][Dmt1]DALDA的细胞摄入，并且用SH-SY5Y细胞(人类神经母细胞瘤细胞)、HEK293细胞(人类胚胎肾细胞)及CRFK细胞(肾上皮细胞)进行确认。在涂布有胶原的12孔板上(5×105细胞/孔)将单层细胞培养三天。在第四天，用预热的HBSS洗涤两次细胞，然后用0.2ml含有250nM[3H][Dmt1]DALDA的HBSS于37℃或4℃孵育不同的时间直至1小时。
早在5分钟时，在细胞裂解液中即可以观察到[3H][Dmt1]DALDA，并在30分钟时达到稳态水平。孵育1小时后在细胞裂解液中回收的[3H][Dmt1]DALDA的总量占总药量的大约1％。虽然[3H][Dmt1]DALDA的摄入在4℃时比37℃时变慢，但是在45分钟时可达到76.5％并在1小时时达到86.3％。[3H][Dmt1]DALDA的内化并不限于Caco-2细胞，在SH-SY5Y细胞、HEK293细胞和CRFK细胞中也可以观察到。[3H][Dmt1]DALDA的细胞内浓度估计比细胞外浓度大约高50倍。
在一独立的实验中，用一定浓度范围(1μM-3mM)的[Dmt1]DALDA于37℃下孵育细胞1小时。在孵育期结束后，用HBSS洗涤细胞4次，向各个孔中加入0.2ml含有1％SDS的0.1N NaOH。然后将细胞内容物转移到闪烁管中，并且进行放射性计数。为了将内化的放射性和表面结合的放射性区分开，引入了酸洗步骤。在细胞裂解之前，将细胞用0.2ml的0.2M醋酸/0.05M NaCl于冰上孵育5分钟。
DALDA摄入到Caco-2细胞中是通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)使用一种[Dmt1]DALDA的荧光类似物(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2)来确认的；其中dnsDap为β-丹磺酰基-1-α，β-二氨基丙酸)。细胞培养如前所述，并且于(35mm)玻璃底培养皿上(MatTek Corp.，Ashland，MA)平铺两天。弃去培养液(基)，将细胞用1ml含有0.1μM至1.0μM该荧光肽类似物的HBSS于37℃孵育1小时。然后用冰冷的HBSS洗涤细胞3次，并且用200μl的PBS覆盖，然后于室温下用具有C-复消色差63×/1.2W校正物镜的Nikon共聚焦激光扫描显微镜在10分钟内完成显微成像。在340nm通过UV激光进行激发，并于520nm处测量发射光。为了进行Z-方向上的光学断层显微成像，将每2.0μm切5-10帧。
CLSM确认了用0.1μM的[Dmt1，DnsDap4]DALDA于37℃孵育1小时后，荧光Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2摄入到Caco-2细胞中。37℃时与4℃时荧光肽的摄入是类似的。虽荧光在整个胞质中出现了扩散，但是被完全排除于细胞核之外。
实施例2[Dmt1]DALDA靶向定位到线粒体为了检测[Dmt1]DALDA的亚细胞分布，制备荧光类似物[Dmt1，AtnDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-atnDap-NH2；其中atn为β-邻氨基苯甲酰基-1-α，β-二氨基丙酸)。该类似物含有β-邻氨基苯甲酰-1-α，β-二氨基丙酸以替代位置4上的赖氨酸残基。细胞培养如实施例1所述，并且于(35mm)玻璃底培养皿(MatTek Corp.，Ashland，MA)上平铺2天。弃去培养液，并且用1ml含有0.1μM[Dmt1，AtnDap4]DALDA的HBSS于37℃孵育细胞15分钟至1小时。
细胞也可以用四甲基若丹明甲酯(TMRM，25nM)，一种着染线粒体的染料，37℃下孵育15分钟。然后用冰冷的HBSS洗涤细胞3次，并且用200μl的PBS覆盖，并且于室温下用具有C-复消色差63×/1.2W校正物镜的Nikon共聚焦激光扫描显微镜在10分钟内完成显微成像。
对于[Dmt1，AtnDap4]DALDA，通过UV激光器于350nm处进行激发，在520nm处测量发射光。对于TMRM，在536nm处进行激发，并于560nm处测量发射光。
在37℃孵育至少15分钟后，CLSM显示荧光[Dmt1，AtnDap4]DALDA摄入到Caco-2细胞内。虽然染料的摄入完全排除在细胞核之外，然而该蓝色染料在细胞质中显示出条纹状分布。用TMRM将线粒体标记成红色。通过叠加[Dmt1，AtnDap4]DALDA的分布和TMRM的分布来显示[Dmt1，AtnDap4]DALDA的线粒体分布。
实施例3[Dmt1]DALDA摄入到线粒体中为了从鼠肝中分离线粒体，通过断头术处死小鼠。将肝脏取出并快速置于冷却的肝脏匀浆液中。用剪刀将小鼠肝脏剪成细小的碎块，然后用玻璃匀浆器手动匀浆。
将匀浆液于4℃、1000×g下离心10分钟。吸出上清液并转移到聚碳酸酯管中，于4℃、3000×g下再次离心10分钟。弃去上清液，并小心除去管侧壁上的油脂。
将沉淀再悬浮于肝脏匀浆液中，并反复匀浆两次。将最终纯化的线粒体沉淀再悬浮于匀浆液中。线粒体制备过程中的蛋白浓度用Bradford方法检测。
将在400μl缓冲液中的大约1.5mg的线粒体用[3H][Dmt1]DALDA于37℃孵育5-30分钟。然后将线粒体离心下来，测定线粒体部分和缓冲液部分的放射性的量。假设线粒体基质容积为0.7μl/mg蛋白(Lim et a1.，J.Physiol 545961-974，2002)，则发现[3H][Dmt1]DALDA在线粒体中的浓度比缓冲液中的高200倍。因此，[Dmt1]DALDA在线粒体内得到了浓缩。
基于这些数据，当用[Dmt1]DALDA灌注离体的豚鼠心脏时，[Dmt1]DALDA在线粒体中的浓度可以估计为[Dmt1]DALDA在冠状动脉灌注液中的浓度 0.1μM[Dmt1]DALDA在肌细胞中的浓度 5μM[Dmt1]DALDA在线粒体中的浓度 1.0mM实施例4经分离的线粒体对[Dmt1]DALDA的积聚(图1)为了进一步证明[Dmt1]DALDA是选择性分布于线粒体中，我们检测了[Dmt1，AtnDap4]DALDA和[3H][Dmt1]DALDA摄取进入经分离的鼠肝脏线粒体的情况。加入线粒体后可以观察到荧光迅速淬灭，表明[Dmt1，AtnDap4]DALDA的快速摄取(图1A)。用一种可以导致线粒体迅速去极化的解偶联剂FCCP(对-(三氟甲氧基)-苯腙羰基氰化物)预处理线粒体，[Dmt1，AtnDap4]DALDA的摄取仅仅减少＜20％。因此，[Dmt1，AtnDap4]DALDA的摄取不是电位依赖性的。
为了确认线粒体靶向定位不是荧光团的人为假象(artifact)，我们还检测了[3H][Dmt1]DALDA的线粒体摄入。经分离的线粒体用[3H][Dmt1]DALDA孵育，并在线粒体沉淀和上清液中检测放射性。从2分钟至8分钟，沉淀中的放射性的量不改变。用FCCP处理的线粒体仅仅减少了与线粒体沉淀连接的[3H][Dmt1]DALDA量的～20％(图1B)。
FCCP对[Dmt1]DALDA摄取的微弱影响表明[Dmt1]DALDA可能与线粒体膜连接或位于膜间间隙而不是位于基质中。我们随后通过使用丙甲甘肽以诱导肿胀和外膜破裂检测了线粒体肿胀对[Dmt1，AtnDap4]DALDA在线粒体中积聚的影响。与TMRM不同，[Dmt1]DALDA的摄入仅部分被线粒体肿胀逆转(图1C)。因此，[Dmt1]DALDA是与线粒体膜连接的。
实施例5[Dmt1]DALDA不改变线粒体呼吸或电位(图1D)[Dmt1]DALDA在线粒体中的积聚不改变线粒体功能。用100μM的[Dmt1]DALDA孵育经分离的鼠肝脏线粒体不改变阶段3和阶段4过程中的氧消耗、或改变呼吸率(阶段3/阶段4)(6.2/6.0)。线粒体膜电位用TMRM来测量(图1D)。加入线粒体导致TMRM信号迅速淬灭，该信号通过加入FCCP可以快速恢复，表明线粒体去极化。加入Ca2+(150μM)导致迅速去极化，同时伴随着逐步失去MPT的淬灭指示。单独加入[Dmt1]DALDA，甚至在200μM时，也不引起线粒体去极化或MPT。
实施例6[Dmt1]DALDA保护线粒体免受由Ca2+和3-硝基丙酸诱导的MPT(图2)除了对线粒体膜电位不具有直接影响之外，[Dmt1]DALDA还能够保护线粒体免受由于Ca2+过载引起的MPT。在加入Ca2+之前，用[Dmt1]DALDA(10μM)预处理经分离的线粒体2分钟，仅仅导致短暂的去极化同时阻止了MPT的开始(图2A)。[Dmt1]DALDA剂量依赖性增加了线粒体对积累的Ca2+刺激的耐受力。图2B表明[Dmt1]DALDA增加了经分离的线粒体在MPT之前能够耐受的加入的Ca2+的量。
3-硝基丙酸(3NP)是电子传递链复合体II中的琥珀酸脱氢酶的一种不可逆抑制剂。在经分离的线粒体中加入3NP(1mM)引起了线粒体电位的下降，并且引发了MPT的开始(图2C)。用[Dmt1]DALDA预处理线粒体剂量依赖性地延缓了由3NP诱导的MPT的开始(图3C)。
为了证明[Dmt1]DALDA能够穿过细胞膜并且保护线粒体免受由3NP引起的线粒体去极化，在不存在或存在[Dmt1]DALDA(0.1μM)的情况下用3NP(10mM)处理Caco-2细胞4小时，然后用TMRM孵育并且在LSCM下检测。在对照细胞中，可以清楚地看到线粒体在整个细胞质中呈现细条纹状。在用3NP处理的细胞中，TMRM荧光大大减少，表明普遍的去极化。与之相反，同时用[Dmt1]DALDA处理，保护线粒体免受由3NP引起的线粒体去极化。
实施例7[Dmt1]DALDA保护线粒体免受线粒体肿胀和细胞色素C释放MPT孔开放导致线粒体肿胀。我们通过测量540nm处吸光度(A540)的降低来检测[Dmt1]DALDA对线粒体肿胀的影响。然后将线粒体悬浮液离心，并用商购的ELISA试剂盒检测线粒体沉淀和上清液中的细胞色素C。用SS-02预处理经分离的线粒体抑制了由Ca2+过载所引起的肿胀(图3A)和以及细胞色素C的释放(图3B)。除了抑制由Ca2+过载所引起的MPT，SS-02还可以抑制由MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓(phenylpyridium)离子)引起的线粒体肿胀，MPP+是线粒体电子传递链的复合体I的一种抑制剂(图3C)。
实施例8右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)能够保护线粒体免受MPT、线粒体肿胀和细胞色素C释放。
非类鸦片肽SS-21具有同样的保护线粒体免受由Ca2+引起的MPT(图4A)、线粒体肿胀(图4B)和细胞色素C释放(图4C)的能力。研究方法如前对SS-02的研究方法。在本实施例中，线粒体肿胀通过监测570nm处的光散射来检测。
实施例9[Dmt1]DALDA(SS-02)和右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)保护心肌免受由局部缺血-再灌注所引起的心肌顿抑。
快速分离豚鼠心脏，随后在原位插管到主动脉并用氧化的Krebs-Henseleit溶液(pH7.4)于34℃以逆行的方式灌注。然后将心脏切除，置于一经改进的Langendorff灌注设备上，并在恒压下灌注(40cm水柱)。用一插入到左心室心尖的小钩子和牢固连接到力-位移换能器(传感器)上的丝带来测量收缩力。冠状动脉流量通过定时收集肺动脉的流出物来检测。
将心脏用缓冲液、[Dmt1]DALDA(SS-02)(100nM)或右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)(1nM)灌注30分钟，然后进行30分钟的全身缺血。用缺血之前所使用的同样溶液进行再灌注。
双因素方差分析显示出三个处理组在收缩力(P＜0.001＝)、心率(P＝0.003)和冠状动脉流速(P＜0.001)方面具有显著的差异。在缓冲液组中，再灌注期间收缩力比缺血前大大降低(图5)。用SS-02和SS-31处理的心脏比用缓冲液处理的心脏具有好得多的缺血耐受能力(图5)。尤其是SS-31能够完全抑制心脏顿抑。另外，在再灌注的整个过程中冠状动脉流速很好地保持了稳定，没有心率降低。
实施例10[Dmt1]DALDA(SS-02)改善了器官保存对于心脏移植，在运输过程中将供体心脏保存在心脏停搏液中。该保存液含有高钾，可以有效地停止心脏搏动并且保存能量。然而，离体心脏的存活时间仍然是非常有限的。
我们对[Dmt1]DALDA是否延长器官的存活进行了试验。在这些研究中，将[Dmt1]DALDA加入到常用的心脏停搏液中(St.Thomas)来检测在延长的缺血之后，[Dmt1]DALDA是否能够改善心脏的存活(体内器官体外存活的模型)。
经分离的豚鼠心脏用氧化的Krebs-Henseleit溶液于34℃以逆行的方式灌注。稳定30分钟后，心脏用含有或不含有100nM[Dmt1]DALDA的心脏停搏液CPS(St.Tohomas)灌注3分钟。接着通过完全阻断冠状动脉灌注90分钟以引发全身缺血。随后用氧化的Krebs-Henseleit溶液进行60分钟再灌注。整个试验中连续监测收缩力、心率和冠状动脉流速。
心脏停搏液中加入[Dmt1]DALDA显著改善了延长的缺血之后的收缩功能(图6)。
权利要求
1.一种在有需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有(a)至少一个净正电荷；(b)最少4个氨基酸；(c)最多大约20个氨基酸；(d)所述净正电荷数的最小数目(pm)与所述氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)所述芳香基团的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系为其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
2.根据权利要求1所述的方法，其中2pm是小于或等于r+1的最大数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中a等于pt。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少2个正电荷。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少3个正电荷。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽是水溶性的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括一个或多个D-氨基酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基酸的C-末端羧基在所述的C-末端被酰胺化。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括一个或多个非天然存在的氨基酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少4个氨基酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约12个氨基酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约9个氨基酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约6个氨基酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有μ-阿片样物质受体激动剂活性。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽不具有μ-阿片样物质受体激动剂活性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽具有分子式D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的酪氨酸残基。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的2’，6’-二甲基酪氨酸残基。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的D-精氨酸残基。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的苯丙氨酸氨酸残基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的2’，6’-二甲基苯丙氨酸残基。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽具有分子式酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(DALDA)。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述肽具有分子式2’，6’-Dmt--D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述肽具有分子式苯丙氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述肽具有分子式2’，6’-Dmp-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经口服给药。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经局部给药。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经鼻内给药。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经全身给药。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述肽经静脉内给药。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经皮下给药。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经肌肉内给药。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经脑室内给药。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经鞘内给药。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经透皮给药。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述透皮给药采用离子电渗疗法。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受局部缺血。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受再灌注。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受缺氧。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述局部缺血是由中风造成的。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述局部缺血是肠局部缺血。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述局部缺血存在于肌肉组织中。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述肌肉组织是心肌组织。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述肌肉组织是骨骼肌组织。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述肌肉组织是平滑肌组织。
46.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受缺氧。
47.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在患神经退行性疾病或病症。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是帕金森氏症。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是阿尔茨海默氏症。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是亨廷顿氏症。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
52.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受药物诱发的MPT。
53.依据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
54.一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或阻止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予所述离体器官有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有(a)至少一个净正电荷；(b)最少4个氨基酸；(c)最多大约20个氨基酸；(d)净正电荷数的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)所述芳香基团的最小数目(a)与所述净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
55.一种在需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或阻止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多大约20个氨基酸；(d)净正电荷数的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)所述芳香基团的最小数目(a)与所述净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
56.一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或阻止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予所述离体器官有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多大约20个氨基酸；(d)净正电荷数的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及(e)所述芳香基团的最小数目(a)与所述净正电荷的总数(pt)之间的关系为其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
57.一种具有序列D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2的肽。
全文摘要
本发明提供了一种减少或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予有效量的芳香族阳离子肽，该肽具有至少一个净正电荷；最少四个氨基酸；最多约二十个氨基酸；净正电荷的最小数目(p
文档编号C07K5/00GK1787831SQ200480009297
公开日2006年6月14日 申请日期2004年2月3日 优先权日2003年2月4日
发明者黑兹尔·H·塞托, 赵克胜, 彼得·W·席勒 申请人:科内尔研究基金会, 蒙特利尔临床研究学院