龙胆苦苷的应用及其制剂的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种化合物的用途，尤其涉及龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶(CAN)-NF-AT通路阻断剂的非治疗用途以及在制备钙调神经磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻断剂中的用途，还涉及龙胆苦苷在制备用于治疗或预防由免疫应答亢进引起的皮肤过敏性炎症发应中的日化品或外用制剂中的用途。【
背景技术：
】[0002]f丐调磷酸酶（calcineurin，CaN)又称蛋白磷酸酶2B(PP2B)，属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素（CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN参与多种细胞功能的调节，尤其在T细胞活化中起到调节枢纽的作用。CaN主要介导的T细胞核因子（NF-AT)的脱磷酸化反应，使NF-AT移位进入核中，进而启动T淋巴细胞生长分化的生长因子白细胞介素2(IL-2)的转录，促进T细胞的分化生长。钙调磷酸酶抑制剂（calcineurininhibitors，CNIs)是目前临床上最有效的免疫抑制药物，包括子囊霉素衍生物环孢素A(CyclosporineA，CsA)、他克莫司（tacrolimus，FK506)和匹美莫司(pimecrolimus，SDZ，ASM981)。如CsA通过与亲环素结合形成复合物，然后与CaN结合并抑制其活性，阻断它介导的NF-AT脱磷酸化反应，从而抑制该转录因子移位进入核中，抑制IL-2的转录，抑制T细胞的分化生长，发挥其免疫抑制作用。但CsA主要依赖进口、价格昂贵，而且在系统使用的情况下其严重的毒副作用也成为该类抑制剂应用的重要障碍。近年来研究人员发现他克莫司和吡美莫司等CNIs在局部皮肤外用条件下进入血循环的量极低而不会有全身性的副作用，安全性高。这些外用的CNIs除了抑制皮肤侵润的T细胞合成IL-2、IFN-y(Thl细胞来源）以及IL-4和IL-10(Th2细胞来源）以外，还同时抑制皮肤角质细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞释放炎性介质，对多种严重的炎症性皮肤病具有显著疗效。尽管他克莫司和吡美莫司等CNIs在临床治疗湿疹、接触性皮炎等皮肤病方面取得了很好的疗效，但仍有其局限性。首先，除原料药依赖进口，价格昂贵外，该类药物在治疗皮肤病方面只能局部外用，系统性使用则毒副作用太强；其次，湿疹等皮肤病常有皮肤屏障功能缺陷的问题，他克莫司和吡美莫司在有屏障功能缺陷的皮损部位使用有可能使其进入循环的量增多，可能导致系统性不良反应；而且最近有研究发现他克莫司和吡美莫司能影响皮肤角质细胞表达和皮肤屏障功能相关的基因，造成皮肤屏障功能受损或恢复减慢，而最新的研究进展皮肤屏障功能缺陷可能是湿疹发病的始动因素，因此他克莫司和吡美莫司的长期使用可能反而不利于疾病的最终康复。[0003]皮肤过敏性炎症反应是皮肤对于化学制剂、蛋白、细菌与真菌等种种物质的变应性反应，其病因复杂，临床表现多样，严重危害健康，影响正常的生活和工作。以湿疹为例，该病是一种由于免疫紊乱所导致的皮肤炎症，以皮肤起红斑、丘疹、水疱、甚至糜烂渗出，并伴有剧烈瘙痒为主要特征，发病率高，易反复发作，病程迀延难愈。采用传统的治疗方法，如激素、抗组胺药、抗炎药等，可以暂时缓解症状，但停药后往往复发，且病情加重，甚至转为慢性；外用糖皮质激素作用迅速且疗效显著，然而这类药物长期外用可能产生皮肤萎缩、毛细血管扩张、色素沉着、口周皮炎以及继发感染等不良反应，如果全身大面积使用，还可造成肾上腺皮质萎缩和全身系统性的不良反应，但由于长期以来没有与之疗效相当、不良反应少的替代药物，所以外用糖皮质激素一直作为皮肤科的首选药而广泛使用。目前已有逾7百万患者外用1丐神经素抑制剂（Pimecrolimus>5百万，Tacrolimus>l.7百万）显示安全并和皮质类固醇同样有效，但近年报道多例皮肤癌和淋巴瘤的发生，所以其远期效应及安全性尚需继续观察。因此当前仍亟待研发高效安全的新型抗过敏性炎症反应的药物。【
发明内容】[0004]本发明所要解决的技术问题在于本发明提供了龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶(CAN)-NF-AT通路阻断剂的用途。[0005]本发明还提供了龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻断剂的非治疗用途。[0006]本发明还提供了龙胆苦苷在制备钙调神经磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻断剂中的用途。[0007]优选的，所述的龙胆苦苷在钙在调神经磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻断剂中的含量为0·OOlwt%~0·00167wt%。[0008]本发明还提供了龙胆苦苷在预防或治疗皮肤过敏性炎症反应引起的湿疹、接触性皮炎的用途。[0009]本发明还提供了龙胆苦苷用于制备预防或治疗皮肤过敏性炎症反应引起的湿疹、接触性皮炎的日化品和外用制剂的用途。[0010]优选的，所述的日用品或外用制剂的剂型为喷雾剂、软膏、乳膏、膏霜、乳液或其他液态制剂。[0011]优选的，所述的日用品或外用制剂中龙胆苦苷的含量为0.00014wt%~0.2wt%。[0012]更优的，所述的日用品或外用制剂中龙胆苦苷的含量为0.0OOHwt%~0.067wt%。[0013]本发明的龙胆苦苷别名为龙胆苦戒，英文名为Gentiopicroside，分子式为C16H2()09,化学名为5-Ethenyl_6-(0-D-glucopyranosyloxy)_5,6-dihydr〇-lH，3H_pyrano[3,4-C]pyran-1-〇ne，CAS号为20831-76-9。[0014]本发明所述的日化品和外用制剂中除了龙胆苦苷以外，还可根据常识包含其它抗炎的活性成分，只要该活性成分与龙胆苦苷不产生明显的拮抗作用即可。[0015]本发明的积极进步效果在于：本发明的龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶(CAN)-NF-AT通路阻断剂的非治疗用途以及在制备钙调神经磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻断剂中的用途，以及其在制备预防或治疗由免疫反应亢进引起的皮肤过敏性炎症反应的制品的用途。使龙胆苦苷作为一种潜在的高效低毒药物，为预防或治疗湿疹和接触性皮炎提供了应用前景。另一方面，本发明使用的龙胆苦苷合成工艺已经成熟，制备成本较低，有利于推广应用，具有广泛的应用前景。【附图说明】[0016]附图1实施例1中龙胆苦苷对K562细胞存活率的影响。[0017]附图2实施例1中龙胆苦苷对CAN-NF-AT通路的抑制率。[0018]附图3实施例2中龙胆苦苷对小鼠抓痒次数的影响。【具体实施方式】[0019]以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明并不限于此。[0020]实施例1龙胆苦苷对（CAN)-NF-AT通路的阻断作用[0021]实验原理[0022]采用从美国affimatrix公司购买的稳定转染NFAT报告基因的细胞系NFATK562R印orterStableCellLine，以PMA(蛋白激酶CPKC激活剂）和A23187(钙通道激活剂）刺激K562细胞，检测转录因子NFAT驱动的荧光素酶基因表达水平，反应钙调磷酸酶（CaN)通路的活化水平。[0023]PMA和A23187分别活化蛋白激酶C(PKC)和钙离子通道，模拟T淋巴细胞激活时必须的两条信号通路，细胞内钙离子浓度提高后与钙调蛋白（CaM)结合，激活钙调磷酸酶，激活的钙调磷酸酶使其特异性底物转录因子NFAT脱去磷酸，移位进入细胞核内，通过活化的PKC进一步修饰，激活NFAT的促转录活性，驱动荧光素酶报告基因的表达。因此，荧光素的表达水平可以反映细胞内钙调磷酸酶（CaN)通路的活化水平。[0024]实验方法[0025]1.龙胆苦苷对K562细胞存活率影响[0026]采用MTT法。稳定转染NFAT报告基因的K562细胞常规传代培养于含10%肽牛血清的RPMI-1640培养基中，实验采用生长健康、处于对数增长期的细胞，将上述细胞按2XIO5/孔接种于96孔细胞培养板，4h后加入待测样品龙胆苦苷（购买于成都曼斯特生物科技有限公司）1〇1^、2(^]\1、3(^]\1(相当于1\10^^%)、4(^]\1、5(^]\1、6(^]\1(相当于2X103wt%)，每个样品浓度分别设置三个平行，同时设置空白对照组。孵育24h~48h，直接加入MTT(5mg/ml)20μL/每孔，轻微振荡混匀，放入培养箱中继续孵育4h。弃去上清液，每孔加^甲基亚讽100IiL，振荡溶解。酶标仪测定A57。。[0027]2.CAN-NF-AT通路抑制率测定[0028]稳定转染NFAT报告基因的K562细胞常规传代培养于含10%肽牛血清的RPMI-1640培养基中，实验采用生长健康、处于对数增长期的细胞，将上述细胞按2XIO5/孔接种于24孔细胞培养板，加入待测样品待测样品龙胆苦苷10μM、20μM、30μM、40μM、50μM培养当前第1页1 2