（FK506为已知的通路阻断剂，在实验中用作阳性药物参考），孵育lh，加入PMA 和A23187 (通路刺激剂），刺激18h，收集细胞，采用荧光素酶检测试剂盒按说明书操作，测 定荧光强度Lum值（反映细胞内反应钙调磷酸酶通路活化水平）。同时设置空白组和刺激 对照组。
[0029] 实验结果
[0030] 1.龙胆苦苷对细胞存活率影响
[0031] 如附图1所示，龙胆苦苷对K562细胞增殖的影响中，在浓度< 60 μΜ时，龙胆苦苷 对Κ562细胞没有明显的细胞毒性，细胞存活率>80 % ;同时，从图中也可以看出，龙胆苦苷 对Κ562细胞也不具有明显的细胞增殖作用，具有很好的药物安全性。
[0032] 2.龙胆苦苷对CAN-NF-AT通路抑制率
[0033] 如附图2所示，龙胆苦苷浓度小于50 μM时，对CAN-NF-AT通路抑制率随着龙胆 苦苷的浓度增加而上升；龙胆苦苷浓度为30, 40, 50 μM时，对CAN-NF-AT通路抑制率同 FK506 (5 μ Μ)对CAN-NF-AT通路抑制率相当。可见，龙胆苦苷对CAN-NF-AT通路具有较强的 抑制作用。
[0034] 实施例2龙胆苦苷对小鼠皮肤过敏的抑制作用
[0035] 实验方法
[0036] 选体重18_22g的昆明小白鼠110只雌雄各半，随机分为11组，每组10只且每组 中雌雄各5只。测试样品为50%乙醇（空白模型对照），复方醋酸地塞米松乳膏组（阳性 对照，图表中简称A组）和复方酮康唑软膏（阳性对照，图表中简称B组），龙胆苦苷。龙胆 苦苷的浓度设为8个梯度，为0· 2 μ M、1 μ M、2 μ M、4 μ M、8 μ M、12 μ M、16 μ M、20 μ M。将小鼠 背部毛用剪刀剪掉，再用脱毛膏洗干净使其露出皮肤，然后分别对11组小鼠给药：复方醋 酸地塞米松乳膏组和复方酮康唑软膏组的给药量为0. 2g/只，50%乙醇组和龙胆苷组的给 药量为0. 2mL/只。11组均是涂抹给药，每天各给药1次，连续给药5天，每次给药Ih后，对 每只小鼠尾静脉注射0. 02 %右旋糖酐生理盐水注射液0. 2ml，观察小鼠出现以瘙痒、咬尾、 挠背等为瘙痒特征的潜伏期以及30min内的搔抓次数。
[0037] 实验结果 表1龙胆苦苷对小鼠抓痒次数抑制作用比较
[0038] 分析统计各组小鼠30min内的搔抓次数，计算抑制率，并作比较，见附图3,表1。与 空白模型组（50%酒精组）比较，阳性对照组复方醋酸地塞米松乳膏和复方酮康唑软膏能 够显著减少右旋糖酐所致小鼠瘙痒次数。同时，龙胆苦苷能显著减少右旋糖酐所致小鼠瘙 痒次数，且高浓度的龙胆苦苷优于复方醋酸地塞米松乳膏、复方酮康唑软膏的止痒效果。随 着用药浓度的提高，龙胆苦止痒苷效果明显增强，具有明显的正相关关系。龙胆苦苷的起效 浓度大约在4 μ M，此时对瘙痒的抑制率在48 %左右，接近对照药复方醋酸地塞米松乳膏， 稍优于复方酮康唑软膏的作用；龙胆苦苷的浓度在8 μΜ(相当于2. 7Χ 10 4wt% )时，优于 对照药复方醋酸地塞米松乳膏、复方酮康唑软膏的作用。
[0039] 由实施例1及实施例2可知：对小鼠皮肤过敏的抑制作用试验中，随着用药浓度的 提高，龙胆苦止痒苷效果明显增强，具有明显的正相关关系，龙胆苦苷大约在4 μΜ(相当于 L 4 X 10 4Wt % )对小鼠瘙痒具有抑制作用，并在20 μ M (相当于6. 7 X 10 4Wt % )时药效明显 优于市售复方醋酸地塞米松乳膏、复方酮康唑软膏等。龙胆苦苷在浓度为30~50 μΜ(相 当于IX 10 3Wt %~1.67 X 10 3Wt %)时对（CAN)-NF-AT通道的进行有效抑制，且在30~ 60 μ M(相当于I X 10 3Wt%~2X 10 3Wt% )具有很好的药物安全性。因为龙胆苦苷一般应 用于外敷，如应用在护肤品或外用制剂中，会涉及到皮肤的透皮吸收等问题，一般而言，在 实际应用时需要将龙胆苦苷的添加量增加1~100倍，因此在制备外用制剂时龙胆苦苷的 浓度应在0.00014￥丨％~0.2￥丨％，可优选在0.00014￥丨％~0.067￥七％。
[0040] 应用实施例1洁面膏的制备 表2洁面膏配方
[0041] 生产工艺： 1. 将A相，B相加热至80°C，搅拌使溶解完全； 2. 70-75°C、将B相加入A相，搅拌； 3. 加入预混好的D相，均质使皂化完全； 4. 65°C以下加入C相，搅拌均匀； 5. 45°C下加入E相，搅拌均匀出料。
[0042] 应用实施例2膏霜的制备 表3膏霜配方
[0043] 制备工艺： 1. 将A相加热至80°C，混合均匀；将B相混合均匀；将C相加热至80°C，混合均匀；将 D相混合均匀； 2. 将A相加入到C相中，均质搅拌1-2分钟后，将B相和D相加入，继续均质2-3分钟； 3. 均质完成后，将料体放入水浴锅中自然冷却，同时低速搅拌，消泡5-10分钟； 4. 当料体温度降至45°C以下时，依次加入E相各组分； 5. 产品制作完成后，放置24小时后测其pH值，pH控制在5. 5~7. 0。
[0044] 应用实施例3乳液的制备 表4乳液配方
[0045] 制备工艺： 1. 将A相加热至80°C，混合均匀；将B相加热至80°C，混合均匀； 2. 将A相加入到B相中，均质搅拌3-4分钟； 3. 均质完成后，将料体放入水浴锅中自然冷却，同时低速搅拌，消泡5-10分钟； 4. 当料体温度降至45°C以下时，依次加入C相中各组分； 5. 产品制作完成后，放置24小时后测其pH值，pH控制在5. 5~7. 0。
[0046] 应用实施例4喷雾剂制备
[0047] 乙醇 20%、（70% )山梨醇 10%、甘油 5%、RH-601. 5%、鼠尾草酸 2. 0%、NaF 0. 03%、香精1. 0%、糖精0. 1%、苯甲酸纳0. 1%、柠檬酸适量、去离子水余量。 表5喷雾剂配方
[0048] 制备工艺： 1. 将A相加热温度至80°C，加入各物质混合均匀； 2. 降温至45°C，依次加入B相中各物质，搅拌均匀； 3. 产品制作完成后，放置24h后测pH值，pH控制在5. 5~7. 0。
[0049] 应用实施例5软膏的制备 表6软膏配方
[0050] 制备工艺： 1. A相：将透明质酸钠分散至甘油和丁二醇中，加水搅拌，将烧杯置于75°C水浴锅中， 搅拌溶解，依次加入EDTA-2Na和尼泊金甲酯，搅拌15min至无色透明液体； 2. B相：将除EMT 10外的其他物品，称量至干燥烧杯中，置于75°C水浴锅中，手动搅拌 约15min，外观为淡黄色透明液体，然后将EMT 10加入，搅拌均匀，备用； 3. 开启均质，将B相快速倒入A相，均质3-5min ; 4. 低速降温消泡，搅拌速度为50r/min，温度降至45°C以下后，依次加入PMX0345和 PE9010，补水至恒重，搅拌均匀后出料。
【主权项】
1. 龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶（CAN) -NF-AT通路阻断剂的用途。2. 龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶（CAN) -NF-AT通路阻断剂的非治疗用途。3. 龙胆苦苷在制备钙调神经磷酸酶（CAN) -NF-AT通路阻断剂中的用途。4. 龙胆苦苷作为制备预防或治疗由免疫应答亢进引起的皮肤过敏性炎症反应的日化 品或外用制剂的用途。5. 根据权利要求4所述的龙胆苦苷的用途，其特征在于：所述的皮肤过敏性炎症反应 为湿疹或接触性皮炎。6. 根据权利要求4所述的龙胆苦苷的用途，其特征在于：所述的龙胆苦苷在日化品或 外用制剂中的含量为〇. 〇〇〇14wt%~0. 2wt%。7. 根据权利要求6所述的龙胆苦苷的用途，其特征在于：所述的龙胆苦苷在日化品或 外用制剂中的含量为〇. 〇〇〇14wt%~0. 067wt%。8. 根据权利要求4所述的龙胆苦苷的用途，其特征在于：所述的日化品或外用制剂为 喷雾剂、软膏、乳膏、膏霜、乳液或其他液态制剂。
【专利摘要】龙胆苦苷的应用及其制剂，本发明公开了龙胆苦苷作为钙调神经磷酸酶（CAN）-NF-AT通路阻断剂的非治疗用途以及在制备钙调神经磷酸酶（CAN）-NF-AT通路阻断剂中的用途。还公开了龙胆苦苷用于制备成预防或治疗皮肤过敏性炎症反应的外用制剂或日化品中的用途，龙胆苦苷可有效的预防或治疗由免疫应答过度引起的如湿疹、接触性皮炎等皮肤过敏症状。龙胆苦苷来源于龙胆科植物条叶龙胆（Gentiana？lutea）的干燥根及根茎，能阻断CAN-NF-AT通路，预防或治疗皮肤过敏，能够制成各种日化品和外用药剂，本发明使用的龙胆苦苷合成工艺已经成熟，制备成本较低，有利于推广应用，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61K8/60, A61P17/00, A61P37/08, A61K31/7048
【公开号】CN105560260
【申请号】CN201510718614
【发明人】胡瑞连, 李子安, 孙常磊, 朱丽平
【申请人】完美（中国）有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年10月28日