抗人白介素-6受体β链单克隆抗体、其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种单克隆抗体，具体来说是一种抗人白介 素-6受体3链单克隆抗体及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 分子量为130kD，其细胞外部由6个连续的0片层结构域组成，分别为免疫球蛋 白样结构域（功能域1)，CHR分子（功能域2,功能域3)及3个纤连蛋白III样结构域（功 能域4-6)，不同的结构域在配体连接及信号转导中均发挥重要作用。白介素-6受体@链 作为白介素-6家族细胞因子-白介素_6,细胞抑制因子（LIF)、抑癌素M(OSM)、睫状神 经营养因子（CNTF)、白介素-11、心肌营养因子l(cardiotrophin-l)及白介素-27的共受 体，通过介导不同炎症因子的信号转导而参与到多种疾病中，例如在类风湿性关节炎（RA)， 巨大淋巴增生病，炎症性肠病，多发性骨髓瘤，银屑病，糖尿病，哮喘，肥胖及肿瘤等疾病的 发生发展中扮演重要角色。随着研究的深入，人们逐渐关注到白介素-6受体0链相关信 号通路可能会成为临床免疫干预和治疗的新靶点。2009年在美国举行的国际抗体会议已有 研究者报告和提出白介素-6受体P链的诊断和治疗性抗体具有良好的应用前景，因此无 论是从免疫药理还是药物开发角度，针对白介素-6受体3链系统中白介素_6受体3链、 其相应配体或信号转导相关蛋白的调控分析都是目前研究热点。
[0003] 白介素_6是白介素-6受体0链的重要配体之一，与慢性炎症性疾病、自身免疫 性疾病及肿瘤等的发生密切相关。白介素-6受体包括特异性白介素-6受体a链（gp80) 及白介素-6受体P链（gpl30)。白介素-6受体ct链的表达主要局限于肝细胞，白细胞 亚群，巨核细胞等细胞表面，而白介素-6受体3链则表达于所有细胞表面。白介素_6通 过传统途径及反式信号途径两种方式向细胞内传导信号。经典途径中白介素-6先与膜连 接白介素_6受体a链结合，之后诱导白介素-6受体3链同源二聚化，形成高亲和力白介 素-6/白介素-6受体a /白介素-6受体0链复合体，从而进行信号转导。反式途径中可 溶性形式的游离白介素-6受体a链与白介素-6结合后直接与白介素-6受体3链形成 复合体，因此在不表达膜连接白介素-6受体a链的细胞仍可通过白介素-6起反应。研究 者认为游离白介素-6受体a链及反式信号的存在使得白介素-6成为参与炎症过程中最 为重要的细胞因子之一，其参与多种自身免疫疾病及肿瘤的发生发展，尤其是白介素-6在 类风湿性关节炎中的作用机制，一直是临床研究的热点。
[0004] 类风湿性关节炎是一种以滑膜增生及关节进行性破坏为特征的自身免疫性疾病， 在我国的发病率约为0.4% -1.0%，重症类风湿性关节炎患者最终罹患以四肢关节为主的 全身各关节严重损伤，致残率高达15%。传统制剂甲氨蝶呤、来氟米特等药物的针对性不 强，疗效常常不尽如人意。近年来免疫学新的干预手段与临床经典治疗方法的协同对于抑 制类风湿性关节炎的发生、发展起到了一定效果。现今进入临床前或临床研究的治疗类风 湿性关节炎相关免疫抑制剂主要可分为两大类：1)细胞因子干预制剂：主要是肿瘤坏死因 子（TNF)阻断剂（阿达木单抗等）、白介素-6受体a链阻断剂（塔西单抗TCZ) ;2)蛋白激 酶抑制剂：如JAK抑制剂、SYK抑制剂。然而由于类风湿性关节炎患者的个体化差异，对现 有的生物制剂反应不一，大部分患者还是经历了从骨关节炎症向类风湿性关节炎发展，最 终罹患严重的关节损伤而致残。因此亟需我们继续深入研究类风湿性关节炎的发病机制， 研制新的药物靶点。
[0005] 大量研究表明：白介素_6信号系统与类风湿性关节炎存在密切关联性。类风湿性 关节炎患者血清及滑液中白介素-6及游离白介素_6受体链a的浓度升高，且白介素-6 水平与疾病活动性因子（类风湿因子，血沉，C反应蛋白）的表达水平，类风湿性关节炎患 者临床表现（如X线改变，受累关节数量，晨僵的持续时间）密切相关。缓解关节骨破坏是 治疗类风湿性关节炎患者最关键问题，而破骨细胞比例增高被认为是类风湿性关节炎患者 骨关节损害的重要因素。类风湿性关节炎患者中相关炎症细胞因子激活破骨细胞前体细胞 的增殖分化，破骨细胞生成比例增高，造成患者骨代谢失衡，而白介素-6信号系统在对破 骨细胞调控中发挥着重要作用。
[0006] 已有研究工作证明：抑制白介素-6过表达或白介素-6信号系统异常的拮抗剂可 有效地调控白介素-6介导的免疫紊乱性疾病。临床研究显示，针对白介素-6信号系统的 拮抗剂，在一定程度上能缓解类风湿性关节炎患者/类风湿性关节炎样动物模型的发病进 程。以白介素-6为靶点的拮抗剂（如lokizumab)，由于抗白介素-6抗体结合游离的白介 素-6不能从体循环中被清除，然而发生白介素-6堆积（近毫克水平）所带来的副作用，一 直限制和阻碍了其在的临床广泛应用。以白介素-6受体链a为靶点的单抗药物塔西单抗 是唯一通过临床III期试验的白介素-6信号通路相关生物制剂。临床实验中，类风湿性关 节炎患者使用塔西单抗治疗后，可观察到患者疾病活性指标显著持续性降低，局部关节症 状及体征改善明显，C反应蛋白快速恢复至正常水平，并且对有些肿瘤坏死因子治疗无效的 患者有高反应性，因此被认为是晚期类风湿性关节炎患者的有效治疗手段。然而深入研究 发现塔西单抗同时作用于经典信号以及反式信号，全面阻断了白介素-6的活性，因而也带 来了一系列的副作用，如感染的发生，血中谷丙转氨酶水平升高，血总胆固醇、高密度脂蛋 白及低密度脂蛋白水平升高，心血管疾病发生风险增加等，也因此阻碍了其在临床上的广 泛应用。另一种以游离白介素6受体链0为靶点的单抗制剂（sgpl30)，由于在体内会形成 大量聚集物，目前仅停留在实验研究。
[0007] 考虑到白介素_6信号在类风湿关节炎中的多重作用及白介素-6受体链a的单 克隆抗体（塔西单抗）对TNF拮抗剂无效患者、晚期类风湿性关节炎患者的改善作用，抗人 白介素_6受体链P功能域单抗的研制可能成为治疗类风湿性关节炎患者新手段。随着 白介素_6受体P链与其配体的偶联位点的进一步明确，并证实白介素_6家族不同细胞 因子需通过与各自的特有受体连接后再与白介素-6受体链0不同的结构域结合而发挥 功能，抗白介素-6受体P链不同功能域的单克隆抗体具有不同的生物学功能，也使制备白 介素-6受体P链单一配体信号的拮抗剂成为可能，并有望为治疗单抗药物的研发提供有 力工具。为了验证上述科学问题，我们通过抗胶原II功能域抗体诱导建立类风湿性关节炎 样小鼠模型（collagen antibody induce arthritis, CAIA)，结果表明抗人白介素-6受体 3链单抗能抑制模型小鼠的疾病发生发展，维持小鼠骨平衡等；应用鼠抗人/抗鼠的单克 隆抗体，分析其针对抗人白介素-6受体3链单抗不同功能域和表位的效价、竞争抑制、亲 和力和针对不同抗原靶点的生物学特性；完成了针对鼠抗人/抗鼠的单克隆抗体进行全基 因测序；初步揭示了上述单抗调控类风湿性关节炎样模型小鼠发病与转归的免疫病理学机 制；同时应用已建立的类风湿性关节炎患者病灶滑膜滑膜成纤维细胞细胞介导破骨细胞前 体细胞向破骨细胞分化技术，初步阐明了抗人白介素-6受体0链单抗调控类风湿性关节 炎患者免疫学功能紊乱和骨代谢失衡的实质表明本专利申请的抗人白介素-6受体3链单 抗的有效生物学活性和具有干预类风湿性关节炎患者发病的潜在临床应用前景。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述科学和技术问题，本发明提供了一种抗人细胞表面或血清游离的单 克隆抗体，所述抗体分子Fab段抗原结合部位的轻链可变区的cDNA及氨基酸序列如下所 示，重链可变区的cDNA及氨基酸序列如下所示。
[0009] 所沭抗人白介素-6夸体13链单克降抗体分子的cDNA及氨某酸序列如下，并分别 对应序列表中的序列1、2、3和4 :
[0010] 轻链可变区(cDNA序列1和氨某酸序列2):
[0011]
[0013] 重链可夺区（cDNA序列