专利名称：与猪免疫性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪免疫性状相关的分子标记的克隆及制备方法与应用。
背景技术：
我国是世界上养猪生产和猪肉消费第一大国，在我国的肉类食品消费结构中，猪肉的消费量高达2/3。养猪业已经是我国发展农村经济，增加农民收入的支柱产业之一。目前，我国养猪生产面临的突出问题是疾病，它严重制约着我国养猪业的发展。疾病一方面造成养猪死亡率高、出栏率低，效益降低，另一方面为了控制疾病大量使用药物导致猪肉品质下降，而且大量使用药物导致耐药菌株、强毒株的出现使疾病的控制更加复杂。猪病给养猪业造成巨大经济损失，美国每年由于猪病付出的费用超过15亿美元，发展中国家由于猪病造成的经济损失更大，约占养猪生产总值的30％。因此，寻找新的抗病策略，培育抗病品系，已成一个重要的研究领域。
目前抗病育种的途径有直接选择和间接选择两种。直接选择是在直接接触或人工接种病原体的情况下对抗病个体进行直接选择。该法具有很强的直观性，但由于很多疾病的发生难以定性，攻击的病原程度和标准难以确定，疾病性状遗传力较低，大规模疾病爆发的风险较大，所以直接选择很难被采用。目前主要通过间接选择进行来进行育种，主要是对一些免疫指标以及与免疫指标相关的分子标记来进行选育。随着分子生物学及其技术的发展，分子标记辅助育种已成为研究的热点和趋势。应用分子技术阐明免疫应答的分子机理和遗传控制机制，结合免疫性状指标进行抗病育种，必将大大加快动物抗病育种的进程。
分子标记辅助育种技术的核心是抗病主效基因以及抗病相关的分子标记的鉴定。近年来，国内外学者对猪免疫力相关的基因进行了大量的研究。找到了一些与猪抗病相关的遗传标记以及抗病基因。猪的MHC定名为猪的淋巴细胞抗原(SLA)。SLA有关基因涉及到一系列免疫应答的控制、补体成分及参与抗原传递的主要分子。猪单倍型SLAa/a对感染支气管败血性波氏杆菌高反应存在关联(Rothschild等，Breed andswine lymphocyte antigen haplotype differences in agglutination titers following vaccinationwith B.bronchiseptica.J Anim Sci 1984，59，643-9)，单倍型SLAd/d、SLAd/g、SLAg/g在特定抗原反应上优于SLAa/a、SLAa/c、SLAa/d、SLAc/c、SLAc/d(Mallard等，Genetic and other effects on antibody and cellmediated immune response in swine leucocyte antigen(SLA)-defined miniature pigs.Anim Genet1989，20，167-78)。Sinclair微型猪的黑色素瘤由两个位点控制，一个在SLA内，控制其表型；另一为非SLA控制的突变基因，能启动瘤的发育(Tissot等，Esophageal Abrikosov’s tumor，preoperativediagnosis with echoendoscopy.1987 J Chir(Paris)，124，372-4)。引起断奶后仔猪腹泻和水肿病的E.coli F18受体的候选基因是α(1，2)岩藻糖转移酶基因1(FUT1)，在第103位碱基突变导致了氨基酸由Ala变成Thr，研究发现这个位点与大肠杆菌的易感性相关(Meijerink等，A DNA polymorphisminfluencing alpha(1，2)fucosyltransferase activity of the pig FUT1 enzyme determinessusceptibility of small intestinal epithelium to Escherichia coli F18 adhesion.2000Immunogenetics，52，129-36)。猪应激综合征(PSS)是由I型兰尼定受体基因(RYRI)控制，该基因物理定位于SSC6q1.1—1.2，又称钙离子释放通道基因(CRC)或氟烷敏感基因(Haln)，隐性纯合子(HalnHaln)发病。分子检测发现是cDNA第1843碱基由C突变成T，从而使编码的氨基酸由Arg615改变成Cys615，引起一系列生理变化导致PSS的发生(Fujii等，Identification of a mutation in porcine ryanodinereceptor associated with malignant hyperthermia.1991 science，253，448-51)。
LGP2基因RIG-I(Retinoic acid-inducible gene-I)信号通路的重要抑制基因。RIG-I信号通路是新发现的独立于Toll信号通路的新的抗病毒信号通路(Komuro等，Negative regulation of cytoplasmicRNA-mediated antiviral signaling.2008，Cytokine.)。目前发现RIG-1信号通过的主要组成有RIG-1，MAD5(melanoma differentiation-associated gene 5)以及Cardif。RIG-1，MAD5都是RNA解螺旋酶，具有相似的结构，都具有2个N末端CARD(two amino-terminal caspase recruitment domains)和一个DExD/H-box RNA解螺旋酶结构域(Yoneyama等，Shared and unique functions of the DExD/H-Box helicasesRIG-I，MDA5，and LGP2 in antiviral innate immunity.2005，J.Immunol，175，2851-2858)。当RIG-1或者MAD5结合dsRNA病毒基因组后，它们发生构象变化，使得N末端的CARD结构域打开，进而和Cardif上CARD结构域发生互作传递信号，最终激活IFN表达抵抗感染。LGP2和RIG-1、MAD5同源也具有DExD/H-boxRNA解螺旋酶结构域，但是缺少CARD结构域，因此它可以和dsRNA病毒基因组结合，但是不能传递信号，在RIG-1信号通路中起负调节的作用(Rothenfusser等，The RNA helicase Lgp 2 inhibits TLR-independentsensing of viral replication by retinoic acidinducible gene-I.2005，J.Immunol.175，5260-5268)。本发明申请中，克隆了猪LGP2基因，并找到了一个与猪免疫性状密切相关的突变位点。为猪的抗病育种提供了新的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，通过PCR扩增LPG2基因部分DNA片段，寻找突变位点，筛选一种与猪免疫性状相关的分子标记，利用该分子标记进行猪免疫性状的标记辅助选择关联分析中的应用。
申请人:通过基因克隆方法，得到一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所述。在其126bp处有一个G126-C126的碱基突变，导致KpnI-RFLP多态性。
设计了一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物为5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’。
公布一种制备如上述与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段的方法，按照以下步骤 (1)用人LGP2基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪脾脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，其中所述引物对的正向引物为5’-CCTTTCTGTCTGCCCTGCTTC-3’，反向引物为5’-TGGCAGGAAAGGAATGTCG-3’，用RT—PCR方法扩增猪LGP2基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO1所述的序列； (2)根据SEQ ID NO1所述的序列设计引物对，所述的引物对的正向引物为5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物为5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’扩增猪基因组DNA；将PCR产物纯化克隆和测序、通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO2所述的序列。
在本发明的实施例中申请人已将制备的与猪免疫性状相关分子标记应用在猪分子标记辅助育种的关联分析中的应用。
更详细的技术方案见《具体实施方式
》。
本发明的效果是发现了一个与猪免疫性状相关的分子标记，为猪的抗病育种提供了新的分子标记。。
序列表SEQ ID NO1是本发明克隆的免疫相关基因LGP2的cDNA片段序列。
序列表SEQ ID NO2是本发明克隆的免疫相关基因LGP2的DNA片段序列。
图1是本发明的技术流程示意图。
图2是克隆的猪免疫性状相关基因LGP2部分cDNA序列。
图3是克隆的猪免疫性状相关基因LGP2基因部分DNA序列，其中第126位碱基处的的突变位点是G126-C126。
图4本发明中LGP2基因部分DNA序列的RFLP-Kpn I的三种基因型(GG GC CC)电泳图谱。
具体实施例方式 实施实例1 (一)LGP2基因部分cDNA序列PCR扩增及部分DNA序列扩增 (1)引物设计 用人LGP2基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪脾脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，其中所述引物对的正向引物为5’-CCTTTCTGTCTGCCCTGCTTC-3’，反向引物为5’-TGGCAGGAAAGGAATGTCG-3’，用RT—PCR方法扩增猪LGP2基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO1所述的序列；根据SEQ ID NO1所述的序列设计引物对，所述的引物对的正向引物为5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物为5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’扩增猪基因组DNA；将PCR产物纯化克隆和测序、通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO2所述的序列。在SEQ ID NO2所述的序列的126bp处有一个G126-C126的碱基突变，导致KpnI-RFLP多态性。
(2)PCR产物的纯化和测序 PCR扩增SEQ ID NO110μL体系双蒸水5.9μL、10×buffer 1μL、25mM Mg2+ 0.6μL、2.5mMdNTP 0.8μL、正向引物0.3μL、反向引物0.3μL、5U/μL Taq酶0.1μL、长白猪cDNA 1μL。扩增条件94℃预变性5min、94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸90s、35个循环、72℃再延伸5min。共10管。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。
SEQ ID NO2 10μL体系双蒸水7μL、10×buffer 1μL、2.5mM dNTP 0.8μL、正向引物0.3μL、反向引物0.3μL、5U/μL Taq酶0.1μL，温氏群体基因组DNA 0.5μL。扩增条件94℃预变性5min、94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环、72℃再延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。共302个样本。
SEQ ID NO1 PCR产物的回收使用博大泰克公司小量DNA回收试剂盒。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，按每100μgl％凝胶加入700μL溶胶液的比例，加入溶胶液，于65℃温育至凝胶完全融化。将胶液上柱，体积过大可分几次上柱，9000rmp离心30s。倒掉收集管中液体，在吸附柱中加入500μL漂洗液，1200rmp离心30s，倒掉收集管中液体，重复此操作一次。将柱子1200rmp离心2min，除去乙醇。将吸附柱放入新的1.5mL Ependorff管中，往柱子中央加入30μL双蒸水，室温放置2分钟，1200rmp离心2min，得到回收产物。检测，送公司测序。
(3)DNA序列同源性检索鉴定 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)软件，将测序后获得的cDNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该cDNA序列的功能信息。
(二)PCR-RFLP诊断方法建立 RFLP检测10μL酶切体系双蒸水3.8μL、10×Buffer 1μL、限制性内切酶Kpn I 0.2μL(10U/μL)、PCR产物5μL。将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h。2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
扩增猪基因组DNA得到了334bp特异性扩增片段(详见图4)，序列分析结果表明在126bp处存在G126-C126突变，并导致RFLP-Kpn I多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中G是没有形成酶切位点的等位基因，C是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中GG型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有334bp一条DNA带)，CC型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现208bp和126bp两条DNA带)，GC为杂合型(电泳检测时出现334bp、208bp和126bp三条DNA带)。
实施例2 利用PCR-Kpn I-RFLP检测了广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的“长白猪”群(一种具有国外猪血缘的猪种)，猪群的基因型频率、基因频率见表1。研究结果显示LGP2基因各基因型在长白猪种均有分布，在344个个体中GG基因型有120个，GC基因型有171个个体，CC基因型有53个个体。G等位基因频率为60％，C等为基因频率为40％。G等位基因占优势。
表1 本发明的PCR-Kpn I-RFLP多态性在长白猪中的分布
实施例3 基因型与免疫性状关联分析所用的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群。父母代及子一代全部进行了基因型检测，子代在0、17、32日龄采集抗凝血和非抗凝血，用于血常规和抗体水平检测。
所分析的性状主要是免疫性状，包括子一代猪分别在0、17、32三个日龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项指标。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析LGP2基因SNP位点的基因型效应及其与免疫指标的关系 Y＝Xβ+Zγ+e 其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；γ为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version 8.0)软件中MIXED MODELS程序进行数据处理与统计分析。
对猪LGP2基因DNA片段第Kpn I-RFLP多态性位点与部分免疫性状进行关联分析。所分析的免疫性状主要是子一代猪分别在0、17、32三个日龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项指标，不同基因型之间性状差异显著性的结果如表2-4所示，所得到相关的性状是0日龄红细胞分布宽度(见表5)、17日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平，17日龄白细胞，17日龄淋巴细胞绝对值，17日龄血小板分布宽度，17日龄血小板体积以及17日龄大血小板比率如表6所示。
表2 LGP2基因片段126G/C多态性与0日龄部分免疫性状的关联分析检测
注**表示P<0.01，*表示P<0.05。
表3 LGP2基因片段126G/C多态性与17日龄部分免疫性状的关联分析检测
注**表示P<0.01，*表示P<0.05。
表4 LGP2基因片段126G/C多态性与32日龄部分免疫性状的关联分析检测
注**表示P<0.01，*表示P<0.05。
表5LGP2基因片段DNA序列的126G/C突变位点不同基因型对0日龄免疫性状的影响
注a，b表示P<0.05。
表6LGP2基因片段DNA序列的126G/C突变位点不同基因型对17日龄免疫性状的影响
注a，b表示P<0.05。
由表6可知，GG基因型个体的17日龄白细胞记数、淋巴细胞绝对值、血小板分布宽度以及大血小板比率显著高于CC或GC基因型(P<0.05)；因此，G等位基因是17日龄白细胞数、淋巴细胞绝对值、血小板分布宽度以及大血小板比率的有利等位基因。另外，我们发现GG基因型个体的17日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平较低。白细胞数也越高表明机体对于疾病的抵抗力越强，而且猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平低说明感染程度较低。因此，选择G等位基因对猪抗病性状选择是有利的。
<110>华中农业大学
<120>与猪免疫性状相关的分子标记的克隆及应用
<130>
<141>2008-10-06
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2574
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
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<220>
<221>CDS
<222>(243)..(2288)
<223>
<220>
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<222>(2556)..(2574)
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<220>
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<223>
<400>1
cctttctgtc tgccctgctt ctgaagctcg tagttttttt cggaggggca gggaagggag 60
agtcttagtt tgatctctgc tgggctagct cctcccttca gtttcagttt ccatttcctt 120
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ctgagggagc aggtgtggtc cttagtcctc tgcctcccct cctacccaga taaggttcct 240
ga atg gag ctg cga ccc tac cag tgg gag gtg atc atg ccc gct ctg 287
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1 5 10 15
gag ggc agg aat atc atc ata tgg ctg ccc acg ggc gct ggc aag acc335
uArg Asn I e I e I erp eu Pro r A asr
20 25 30
agg gcg gct gct tat gtg gcc aag agg cat ctg gag act gtg gat gga 383
Arg Ala Ala Ala Tyr Val Ala Lys Arg His Leu Glu Thr Val Asp Gly
35 40 45
gcc aag gtg gtt gtg ctg gtc aac agg gta cac ctg gtg acc cag cat 431
Ala Lys Val Val Val Leu Val Asn Arg Val His Leu Val Thr Gln His
50 55 60
tgt gag gag ttc agc cgc atg ctg gac aga cgc tgg gcc att acc acc 479
Cys Glu Glu Phe Ser Arg Met Leu Asp Arg Arg Trp Ala Ile Thr Thr
65 70 75
ctg agc ggg gac atg ggg cca cga gcc ggc ttt ggc cac ctg gcc cgg 527
Leu Ser Gly Asp Met Gly Pro Arg Ala Gly Phe Gly His Leu Ala Arg
80 85 90 95
agc cat gat ctg ctc atc tgc aca gct gag ctg cta cag aag gcg ctg 575
Ser His Asp Leu Leu Ile Cys Thr Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ala Leu
100 105 110
acc agc gag gag gag gag gag cac gtg gag ctc aac gtc ttctcc ctg623
Thr Ser Glu Glu Glu Glu Glu His Val Glu Leu Asn Val Phe Ser Leu
115120 125
ctg gtg gtg gatgag tgt cac cac aca cac aaa gac acc gtctac aac 67l
Leu Val Val Asp Glu Cys His His Thr His Lys Asp Thr Val Tyr Asn
130 135 140
atc atc ctg agc cag tac ctg aag cat aaa ttc cag agg acg aag cca 719
Ile Ile Leu Ser Gln Tyr Leu Lys His Lys Phe Gln Arg Thr Lys Pro
145 150 155
ctg ccg cag gtg ctt ggg ctc aca gcc tcc cca ggc aca ggc agg gcc 767
Leu Pro Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Thr Gly Arg Ala
160 165 170 175
tcg aca ctc gat ggc gcc att gac cac atc ctg cag ctc tgt gcc aac 815
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180 185 190
ctg gat acg tgg cgc atc atg tca ccc cag aactcc cgctcc cag ctg 863
Leu Asp Thr Trp Arg Ile Met Ser Pro Gln Asn Ser Arg Ser Gln Leu
195 200 205
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Gln Glu His Ser Arg Gln Pro Cys Lys Gln Tyr Asp Leu Cys His Gln
210215 220
cgt gcc cag gac ccg ttt ggg gcc aag ctg aag aag ctc atg gac aaa 959
Arg Ala Gln Asp Pro Phe Gly Ala Lys Leu Lys Lys Leu Met Asp Lys
225 230 235
atc cac cgc cat ctg gag atg ccg gag ttg aga cgg gac ttt ggg act 1007
Ile His Arg His Leu Glu Met Pro Glu Leu Arg Arg Asp Phe Gly Thr
240 245 250 255
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Gln Thr Tyr Glu Gln Gln Val Val Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Glu
260 265 270
gcg ggg ctc cag gag cgg agg gtg tat gcg ctt cac ctg cgt cgc tac 1103
Ala Gly Leu Gln Glu Arg Arg Val Tyr Ala Leu His Leu Arg Arg Tyr
275 280 285
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Asn Asp Ala Leu Leu Ile His Asp Thr Val Arg Ala Val Asp Ala Leu
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gcc acg ctg cgg gat ttc cac acc agg gag cgc gcc acc aag acc cag 1199
Ala Thr Leu Arg Asp Phe His Thr Arg Glu Arg Ala Thr Lys Thr Gln
305 310 315
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Ile Leu Gln Ala Glu Arg Trp Leu Leu Ala Leu Phe Asp Asp His Lys
320 325330 335
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Asn Glu Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Gly Pro Glu Asn Pro Lys Leu
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gag gtg ctg aaa gaa atc ctg cag aag cag ttc aag ggt ccc aag agc 1343
Glu Val Leu Lys Glu Ile Leu Gln Lys Gln Phe Lys Gly Pro Lys Ser
355 360 365
ccc cgg ggc atc atc ttc acc cga acc cgc cag agc gct cac tcc ctc 1391
Pro Arg Gly Ile Ile Phe Thr Arg Thr Arg Gln Ser Ala His Ser Leu
370 375 380
ctg ctg tgg ctc cag cag cag ccg agc ctg cag act gtg gac atc agg 1439
Leu Leu Trp Leu Gln Gln Gln Pro Ser Leu Gln Thr Val Asp Ile Arg
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gcc cag ctg ttg att ggg gct ggg aac agc agc cag agc acc ccg atg 1487
Ala Gln Leu Leu Ile Gly Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser Thr Pro Met
400 405 410 415
acc cag atg acc cag agg gac cag caa gaa gtg atc cag aag ttc cgg 1535
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420 425 430
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Thr Gly Ala Leu Asn Leu Leu Val Ala Thr Ser Val Ala Glu Glu Gly
435 440 445
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450455 460
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Asn Glu Ile Ser MetVal Gln Ala Arg Gly Arg Ala Arg Ala Ser Gln
465 470 475
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Ser Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala Gln Gly Ser Arg Glu Leu Arg Arg
480 485 490 495
gag cag acc aat gag gcg ctg gag agt ctg atg gaa cag gcg gtg gct 1775
Glu Gln Thr Asn Glu Ala Leu Glu Ser Leu Met Glu Gln Ala Val Ala
500 505 510
gct gtg cag gcg atg gac cag gcc gag tac cag gcc aag atc cag gag 1823
Ala Val Gln Ala Met Asp Gln Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Ile Gln Glu
515 520 525
ctg cag cgg gca gcc ttg gtt aag cgg gca gcc cgg gca gcc cag cag 187l
Leu Gln Arg Ala Ala Leu Val Lys Arg Ala Ala Arg Ala Ala Gln Gln
530 535 540
aag agt cgg cag cag aag ttc ctg gca gag caa gtg cag ctc ctg tgc 1919
Lys Ser Arg Gln Gln Lys Phe Leu Ala Glu Gln Val Gln Leu Leu Cys
545 550 555
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560 565 570 575
gag agt gcc cac cat gtc aac gtg aac ccc aac ttc aag atc tac tac 2015
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595 600 605
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Arg Pro Gly Gly Val Ile Arg Cys Arg Asn Cys Gly Glu Ser Trp Gly
610 615 620
atg cag ata atc tac aag tcc gtg aag ctg cca gtg ctc aaa gtc cgc 2159
Met Gln Ile Ile Tyr Lys Ser Val Lys Leu Pro Val Leu Lys Val Arg
625 630 635
agt gtg ctt ctg gag acg ccc aac ggg cgg atc cag gtc aag aaa tgg 2207
Ser Val Leu Leu Glu Thr Pro Asn Gly Arg Ile Gln Val Lys Lys Trp
640 645 650 655
tcctgc gtg ccc ttc ccg gtg cct gac ttc gat tac acg cag tat tgc2255
Ser Cys Val Pro Phe Pro Val Pro Asp Phe Asp Tyr Thr Gln Tyr Cys
660 665 670
acc gag agc ctg acc gac ctc tcc ctg gactga ccgccttgtc cctgcagtgc 2308
Thr Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ser Leu Asp
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ccggctcagc ctgcaggggg cgggagactc cgcggccgcc acctgggtcc agcccggtct 2368
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<211> 681
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
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85 90 95
His Asp Leu Leu Ile Cys Thr Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ala Leu Thr
100 105 110
Ser Glu Glu Glu Glu Glu His Val Glu Leu Asn Val Phe Ser Leu Leu
115 120 125
Val Val Asp Glu Cys His His Thr His Lys Asp Thr Val Tyr Asn Ile
130 135 140
Ile Leu Ser Gln Tyr Leu Lys His Lys Phe Gln Arg Thr Lys Pro Leu
145 150 155 160
Pro Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Thr Gly Arg Ala Ser
165 170 175
Thr Leu Asp Gly Ala Ile Asp His Ile Leu Gln Leu Cys Ala Asn Leu
180 185 190
Asp Thr Trp Arg Ile Met Ser Pro Gln Asn Ser Arg Ser Gln Leu Gln
195 200 205
Glu His Ser Arg Gln Pro Cys Lys Gln Tyr Asp Leu Cys His Gln Arg
210 215 220
Ala Gln Asp Pro Phe Gly Ala Lys Leu Lys Lys Leu Met Asp Lys Ile
225 230 235 240
His Arg His Leu Glu Met Pro Glu Leu Arg Arg Asp Phe Gly Thr Gln
245 250 255
Thr Tyr Glu Gln Gln Val Val Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Glu Ala
260 265 270
Gly Leu Gln Glu Arg Arg Val Tyr Ala Leu His Leu Arg Arg Tyr Asn
275 280 285
Asp Ala Leu Leu Ile His Asp Thr Val Arg Ala Val Asp Ala Leu Ala
290 295 300
Thr Leu Arg Asp Phe His Thr Arg Glu Arg Ala Thr Lys Thr Gln Ile
305 310 315 320
Leu Gln Ala Glu Arg Trp Leu Leu Ala Leu Phe Asp Asp His Lys Asn
325 330 335
Glu Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Gly Pro Glu Asn Pro Lys Leu Glu
340 345 350
Val Leu Lys Glu Ile Leu Gln Lys Gln Phe Lys Gly Pro Lys Ser Pro
355 360 365
Arg Gly Ile Ile Phe Thr Arg Thr Arg Gln Ser Ala His Ser Leu Leu
370 375 380
Leu Trp Leu Gln Gln Gln Pro Ser Leu Gln Thr Val Asp Ile Arg Ala
385 390 395 400
Gln Leu Leu Ile Gly Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser Thr Pro Met Thr
405 410 415
Gln Met Thr Gln Arg Asp Gln Gln Glu Val Ile Gln Lys Phe Arg Thr
420 425 430
Gly Ala Leu Asn Leu Leu Val Ala Thr Ser Val Ala Glu Glu Gly Leu
435 440 445
Asp Ile Pro Gln Cys Asn Val Val Val Arg Tyr Gly Leu Leu Thr Asn
450 455 460
Glu Ile Ser Met Val Gln Ala Arg Gly Arg Ala Arg Ala Ser Gln Ser
465 470 475 480
Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala Gln Gly Ser Arg Glu Leu Arg Arg Glu
485 490 495
Gln Thr Asn Glu Ala Leu Glu Ser Leu Met Glu Gln Ala Val Ala Ala
500 505 510
Val Gln Ala Met Asp Gln Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Ile Gln Glu Leu
515520 525
Gln Arg Ala Ala Leu Val Lys Arg Ala Ala Arg Ala Ala Gln Gln Lys
530 535 540
Ser Arg Gln Gln Lys Phe Leu Ala Glu Gln Val Gln Leu Leu Cys Ile
545 550 555 560
Asn Cys Met Val Ala Met Gly Tyr Gly Ser Asp Leu Arg Lys Val Glu
565 570 575
Ser Ala His His Val Asn Val Asn Pro Asn Phe Lys Ile Tyr Tyr Asn
580 585 590
Val Ser Gln Glu Pro Val Val Ile Asp Arg Val Phe Lys Asp Trp Arg
595 600 605
Pro Gly Gly Val Ile Arg Cys Arg Asn Cys Gly Glu Ser Trp Gly Met
610 615 620
Gln Ile Ile Tyr Lys Ser Val Lys Leu Pro Val Leu Lys Val Arg Ser
625 630 635640
Val Leu Leu Glu Thr Pro Asn Gly Arg Ile Gln Val Lys Lys Trp Ser
645 650 655
Cys Val Pro Phe Pro Val Pro Asp Phe Asp Tyr Thr Gln Tyr Cys Thr
660 665 670
Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ser Leu Asp
675 680
<210>3
<211>334
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(334)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(315)..(334)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(126)..(126)
<223>
<400>3
tccggactgg tgccttgaac ctcctggtgg ccacgagcgt ggcagaggag gggctggaca 60
tcccccagtg caacgtggtg gtgcgctatg ggctcctgac caatgagatc tccatggtcc 120
aggtarccga agcatccctc cccaaaacag ccctcaaagg atgctgggtg gaccccagcc 180
ccaccactca cccctctgtt ttctccttcc ccaggcaagg ggccgggccc gggccagtca 240
aagcgtatac tcgtttgtgg cagcccaagg cagccgggag ctgcggcggg agcagaccaa 300
tgaggcgctg gagagtctga tggaacaggc ggtg 33权利要求
1、一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所述。
2、根据权利要求1所述的一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段，其特征在于在其126bp处有一个G126-C126的碱基突变，导致KpnI-RFLP多态性。
3、检测权利要求2所述的一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物为5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’。
4、制备如权利要求2所述的与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段的方法，按照以下步骤
(1)用人LGP2基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪脾脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，其中所述引物对的正向引物为5’-CCTTTCTGTCTGCCCTGCTTC-3’，反向引物为5’-TGGCAGGAAAGGAATGTCG-3’，用RT—PCR方法扩增猪LGP2基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO1所述的序列；
(2)根据SEQ ID NO1所述的序列设计引物对，所述的引物对的正向引物为5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物为5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’扩增猪基因组DNA；将PCR产物纯化克隆和测序、通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO2所述的序列。
5、权利要求2所述的所述的一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段在猪分子标记辅助育种中的应用。
6、权利要求3所述的一种与猪免疫性状相关的LGP2基因DNA片段的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜基因工程分子标记制备领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择关联分析应用的与猪免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。所述的分子标记由猪LGP2基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。序列表SEQ ID NO2所示序列的第126位碱基处有一个G126-C126的碱基突变，导致RFLP-Kpn I多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择的关联分析提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/12GK101392254SQ20081019721
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者赵书红, 李新云, 韩春梅, 朱猛进, 李长春 申请人:华中农业大学