专利名称：存活预后分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于测定对象或个体可能存活的预后分析和试剂盒。
背景技术：
有多个先前已确定的因子，当这些因子在诸如人类个体等对象中测量时可预示所述个体可能长期存活。这些因子包括例如胆固醇、C-反应蛋白(CRP)和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(cystatin C)。这些化合物的水平升高与糖尿病、高血压和心血管疾病和肾损伤有关。
对于作为分析患者中宽范围单克隆免疫球蛋白病(monoclonal gammopathies)的途径，申请人已研究游离轻链多年。这样的游离轻链在诊断中的应用在书籍“Serum FreeLight Chain Analysis,Fifth Edition (2008) A. R. Bradwell 等，ISBN 0704427028”中有详细综述。抗体包括重链和轻链。它们通常具有双重对称并且包含两个相同的重链和两个相同的轻链，各自包含可变区和恒定区结构域。每个轻链/重链对的可变区结构域结合形成抗原结合部位，使得两个链都有助于抗体分子的抗原结合特异性。轻链为两种类型K和X，任何给定的抗体都是由任一轻链产生，但从不由两种轻链一起产生。人体中产生的K分子大约为、分子的两倍，但这在一些哺乳动物中不同。轻链通常与重链连接。然而，在个体的血清或尿中可检测到一些未连接的“游离的轻链”。游离轻链可通过产生抗游离轻链表面的抗体来特异地鉴定，所述游离轻链表面通常因轻链与重链的结合而被隐藏。在游离轻链(FLC)中此表面被暴露，使得其可以通过免疫学检测。用于检测K或\游离轻链的可商购试剂盒包括例如 The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdom生产的“Freelite ”。申请人先前已确定，测量游离k、游离入的量和/或游离k/游离X比例能够检测患者中的单克隆免疫球蛋白病。其已被用作辅助例如完整免疫球蛋白型多发性骨髓瘤(MM)、轻链MM、非分泌MM、AL淀粉样变性病、轻链沉淀疾病(light chaindeposition disease)、潜伏性MM(smouldering MM)、衆细胞瘤和MGUS(未确定临床意义的单克隆免疫球蛋白病)的诊断。还已将FLC的检测用作例如辅助其他B-细胞恶液质(B-cell dyscrasia)的诊断，且甚至用作通常用于诊断单克隆免疫球蛋白病的尿BenceJones蛋白分析的可选方案。常规地，期望增加X或K轻链中的一种。例如，多发性骨髓瘤由恶性浆细胞的单克隆增殖导致，其引起产生单一类型免疫球蛋白的单一类型细胞的增加。这导致在个体中观察到X或K游离轻链的量增加。此浓度增加可以被测定，并且通常测定游离K与游离入的比例并与正常范围相比较。这有助于单克隆疾病的诊断。此外，游离轻链分析还可以用于患者中随后的疾病治疗。例如在治疗AL淀粉样变性病后,可以进彳丁患者的预后。Katzman 等(Clin. Chem. (2002) ；48 (9) 1437-1944)讨论了在单克隆免疫球蛋白病的诊断中游离K和游离X免疫球蛋白的血清参考区间和诊断范围。通过免疫分析研究了年龄为21-90岁的个体，并与通过免疫固定获得的结果相比较，以优化用于检测患有B-细胞恶液质的个体中单克隆游离轻链(FLC)的免疫分析。记录K和X FLC的量和K/X比例，以允许测定用于B-细胞恶液质检测的参考区间。
发明内容
申请人:现已确定对于FLC、特别是总FLC的分析可以用于预测个体的长期存活，即使当个体是明显健康的对象时也是如此。他们已发现FLC浓度在统计学上显著地与长期存活相关。此外，此关系似乎与现有的长期存活预后标志物例如胆固醇、肌酸酐(creatinine)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和C-反应蛋白的关系相似或优于这些关系。来自明显健康的个体血清中的FLC浓度在某种程度上受到个体肾过滤和排泄FLC 能力的影响。在其中FLC清除受限制的个体中，发现血清中FLC水平增加。结果，目前认为FLC是肾功能的良好标志物。由于单体FLC K分子(25kDa)的大小与二聚入分子(50kDa)的大小不同，因此它们一起是优于例如抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(IOkDa)的肾小球过滤的更好的标志物。然而，与抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C相比较，在B-细胞增殖期间产生FLC是多种疾病的结果，因此血清FLC通常不被单独地用作肾功能标志物。数据显示即使在患有慢性肾病(CKD)的患者中，FLC仍给出存活的可能性，与肾功能无关。然而，B-细胞增殖/活性的标志物是重要的，并且由于B-细胞负责产生FLC，因此其在临床上是有用的。FLC生成是B-细胞上调的早期指标。就此而言，其可以与炎性反应的T-细胞介导的标志物CRP的使用互为补充。高FLC浓度可能是慢性肾疾病、B-细胞激活或B-细胞增殖的指标。因此，不正常的FLC分析结果可能是多种病症的标志物，这些病症目前需要若干测试的组合。相反，当FLC分析结果正常时，表明肾功能良好且没有B-细胞激活或增殖。因此，FLC浓度目前已被公认为是个体全身健康的良好指标。本发明提供了全身健康筛选方法，包括检测获自对象的样品中游离轻链(FLC)的量，其中较低的量与存活增加和/或更好的全身健康有关，且较高水平的FLC表明可能存在未检测到的医学问题。例如此分析可被用作作为对象全身健康检查一部分的全身健康筛选的一部分。可选地，其可被用于持续出现非特异性“全身不适”、“身体不适”或“全身不舒服”类症状的患者中。可选地，其可被用在患者中，以在感觉不舒服的患者中区分出因心理原因的不舒服和因难以确定症状的生理原因的不舒服。可以将FLC的量与预定FLC的正常范围相比较，以显示FLC的量是高于正常范围还是低于正常范围。FLC可以为K FLC或入FLC。然而，优选地测量总FLC浓度，这是由于单独测量K FLC或入FLC可能会遗漏例如患者中例如单克隆地产生的一种或另一种FLC的不正常的闻水平。总游离轻链是指样品中游离K轻链加游离\轻链的总量。优选地，对象为明显健康的对象。本文中使用的术语“明显健康的对象”应理解为是指没有威胁生命的疾病或病症(例如下述的那些)的明显症状的对象。优选地，所述方法提供了对象中整体存活预后的方法。这可以是在例如没有诊断出或没有患有B-细胞相关疾病(B-cell associated disease)或恶液质(dyscrasia)特异症状的对象中。优选地，明显健康的对象不必具有B-细胞相关疾病的症状。所述症状可以包括多发性感染、骨痛和疲劳。这样的B-细胞相关的疾病优选地不是骨髓瘤(例如完整免疫球蛋白型骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤)、MGUS、AL淀粉样变性病、WaldenstrSm巨球蛋白血症、Hodgkin淋巴瘤、滤泡中心细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、前-B-细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。此外，所 述个体通常不具有降低的骨髓功能。所述个体通常不具有通常在许多这样的疾病中发现的异常的X KFLC比例。术语“总游离轻链”指获自对象的样品中K和\游离轻链的量。样品通常为获自对象的血清样品。然而，也可能使用全血、血浆、尿或组织或流体的其他样品。通常，FLC例如总FLC通过免疫分析例如ELISA分析测定，或使用荧光标记的小球例如Luminex 小球测定。例如ELISA使用抗体来检测特异的抗原。分析中使用的抗体中的一种或多种可以用能够将底物转化为可检测的分析物的酶标记。这样的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和本领域中已知的其他酶。可选地，可以使用其他可检测的标签或标记来代替所述酶，或与所述酶一起使用。这些包括放射性同位素，本领域中已知的大量有色和荧光标记，包括荧光素、Alexa 氟石、Oregon Green、B0DIPY、罗丹明红、Cascade Blue>Marina Blue、PacificBlue、Cascade Yellow、金；以及缀合物例如生物素(可获自例如Invitrogen Ltd, UnitedKingdom)。也可使用染料溶胶、金属溶胶、化学发光标记、或有色的乳胶。这些标记中的一种或多种可以用于本文所述各发明的ELISA分析中，或可选地用于本文所述的其他分析、标记的抗体或试剂盒中。ELISA类型分析的构建本身是本领域公知的。例如，对于FLC特异性的“结合抗体”被固定化在底物上。“结合抗体”可以通过本领域中公知的方法被固定化在底物上。样品中的FLC通过结合FLC的“结合抗体”被结合至底物上。未结合的免疫球蛋白可以被洗去。在ELISA分析中，结合免疫球蛋白的存在可以通过使用标记的“检测抗体”来确定，所述“检测抗体”相对于结合抗体而言特异于所关注FLC的不同部分。流式细胞仪可用于检测所关注的FLC的结合。对于例如细胞分选而言，此技术是公知的。然而，其也可以被用于检测标记的颗粒例如小球，以及用于测量它们的大小。大量的教科书中描述了流式细胞仪，例如Practical Flow Cytometry,第三版(1994),
H.Shapiro, Alan R. Liss, New York 和 Flow Cytometry, First Principles (第二版)2001,A.L. Given, Wiley Liss。诸如FLC特异性抗体等结合抗体之一与诸如聚苯乙烯或乳胶小球等小球结合。将小球与样品以及第二种检测抗体混合。检测抗体优选地用可检测的标记来标记，其与样品中待检测的FLC结合。当存在待分析的FLC时，这产生经标记的小球。也可使用对于本文所述的其他分析物特异性的其他抗体，以允许对于那些分析物的检测。随后可以通过流式细胞仪检测经标记的小球。对于例如抗游离入抗体和抗游离K抗体，可以使用不同的标记，例如不同的荧光标记。在此分析中或本文所述的其他分析中也可以使用对于本文所述的其他分析物特异性的其他抗体，以对那些分析物进行检测。这允许同时测定结合的各类型的FLC的量或允许测定其他分析物的存在。
可选地，或额外地，对于不同抗体，例如对于不同标志物特异性抗体，可以使用不同大小的小球。流式细胞仪可以辨别不同大小的小球，并且因此可以迅速地确定样品中各FLC或其他分析物的量。可选的方法使用与例如荧光标记的小球例如可商购的Luminex 小球结合的抗体。不同的小球与不同的抗体一起使用。不同的小球用不同的荧光团混合物标记，由此允许通过突光波长测定不同的分析物。Luminex小球可获自Luminex Corporation, Austin,Texas, United States of America。优选地，使用的分析是池度法(nephelometric method)或混池度法(turbidimetric method)。用于检测X-FLC或k-FLC的池度分析和浑池度分析是本领域中公知的，但对于总FLC分析却并非如此。对于分析而言，它们具有最佳的灵敏度水平。可以分别地测定X FLC和K FLC浓度，或单次分析总FLC。这样的分析通常包含50 50比例的抗-K FLC抗体和抗-入FLC抗体。也可以产生针对于游离入和游离K轻链的混合物的抗体。可以将总FLC的量与标准的预定值相比较，以确定总量是高于正常值还是低于正常值。如下文所详细讨论的，申请人已发现，高于正常浓度的血清FLC与存活降低可能性的显著增加相关。对于例如具有较低血清FLC水平的人而言更是如此。由本文中所示的数据，血清FLC的正常水平通常为约15-35mg/L或20-35mg/L、26_35mg/l、或优选地25-32、或24_33mg/l总FLC。闻于33、例如闻于34、闻于36、闻于40、闻于42、闻于48、闻于50、闻于52、高于55、高于70mg/l的总血清FLC显示较早死亡的可能性增加。个体的血清中33mg/ml或低于30、低于28、低于26或低于25mg/l与对象的存活的显著增加有关。存活的可能性的增加可以是在2年、4年、6年、8年、10年、12年、14年、16年或更多年的时间段中。申请人已确定较低的FLC浓度与存活可能性的增加之间的关系在超过160个月的时间段内是显著的。参见例如图I。历史上，已制备用于分别地测量K FLC和X FLC的分析试剂盒，以允许计算比例。它们已被常规地用于已显示出疾病症状的个体中。优选地,分析能够测定样品中约lmg/L-100mg/L或lmg/L_80mg/L的FLC,例如总FLC0预期其检测绝大多数个体中的血清FLC浓度，而不需要以不同的稀释度重新分析样品。当前强调关注较低浓度是指优选地所述诊断分析能够检测低于30mg/L的FLC，更优选低于20mg/L或低于10mg/L，低于4mg/L或lmg/L的血清FLC。优选地，所述方法包括使用免疫分析，例如通过使用抗游离K轻链和抗游离入轻链抗体或其片段的混合物来检测样品中总游离轻链的量。这样的抗体可以为50 50比例的抗K :抗X抗体。结合至FLC的抗体或片段可以通过使用经标记的抗体或片段直接地检测，或使用经标记的抗所述抗游离、的抗体或抗所述抗游离K抗体的抗体间接地检测。抗体可以为多克隆的或单克隆的。可以使用多克隆抗体，由于它们是针对相同链的不同部分而产生的，所以其能够检测相同类型轻链之间的一些变化。多克隆抗体的产生描述于例如W097/17372中。优选地，确定的并发现对于显示整体存活可能性增加而言显著的血清FLC例如总FLC的量为低于33，低于32，低于31，低于30，低于28，低于26，低于25或低于24mg/ml，低于 20mg/L 或低于 15mg/L。相反地，认为高于33mg/L，特别是大于34、36、38、40、50、55、60，或高于70mg/ml的水平表明对象的整体死亡的可能性增加。所述方法可以用于在看似健康的对象中显示不良的预后。或用于突显可能存在未检测到的医学问题，为进一步的研究提供证明。还可以对样品中的一种或多种其他标志物进行测试。这些标志物包括胆固醇、肌酸酐(肾功能的标志物)、抑半胱 氨酸蛋白酶蛋白C或CRP。总体而言，这样的分析的应用是本领域已知的。预期使用其他标志物能够提供进一步的数据并且改善预后的准确度或者辅助潜在疾病/医学问题的诊断。还提供了用于总TLC的分析试剂盒，例如用于本发明方法中的分析试剂盒。所述试剂盒可以检测样品中总FLC的量。这样的分析试剂盒可适于检测样品中低于25mg/L，最优选地，低于20mg/L或约10mg/L,低于5mg/L或4mg/L的总游离轻链(FLC)的量。分析试剂盒可以为例如浊度分析试剂盒。优选地，试剂盒为包含一种或多种抗FLC的抗体的免疫分析试剂盒。通常，试剂盒包括抗K和抗X FLC抗体的混合物。通常，使用50 50抗游离K和抗游离\抗体的混合物。试剂盒可适于检测样品中l-100mg/L或优选地l-80mg/L量的总游离轻链。也可以使用能够结合FLC的抗体片段，例如(Fab)2或Fab抗体的片段。可以例如使用上述的标记将抗体或片段标记。可以提供经标记的抗免疫球蛋白结合抗体或其片段以检测结合至FLC的抗游离\或抗游离K。试剂盒可以形成包含用于测试如上所述的其他标志物例如胆固醇、肌酸酐等的成分的测试分析试剂盒的一部分。可以提供用于这样的标志物的抗体。试剂盒可以包含校准流体，以允许测试在所示范围校准。校准流体优选地包含预定浓度的FLC，例如低于25mg/ml，低于20mg/ml，低于10mg/ml，低于5mg/L或低至lmg/L。通过优化抗体的量和“阻滞”涂布在乳胶颗粒上的蛋白且例如通过优化补充试剂的浓度例如聚乙二醇(PEG)浓度，所述试剂盒也可适用。试剂盒可以包含例如可能被分析的FLC或甚至其他化合物例如胆固醇、肌酸酐、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C或CRP(c-反应蛋白)的多种标准对照。标准对照可以被用于证实待产生的FLC或其他成分的浓度的标准曲线。这样的标准对照确认先前校准的标准曲线对于所使用的试剂和条件是有效的。它们通常与获自对象的样品的分析基本上同时使用。标准可以包含一种或多种低于20mg/L的用于FLC的标准，更优选地低于15mg/L，低于约10mg/L或低于5mg/L，以允许所述分析能够用于检测较低浓度的游离轻链。分析试剂盒可以为浊度试剂盒或混浊度试剂盒。其可以为ELISA、流式细胞仪、荧光、化学发光或小球类分析或纤维素试纸。这样的分析通常是本领域已知的。试剂盒还可以包括用于本发明方法的使用说明。使用说明可以包括对于被认为是正常值的总游离轻链的浓度的指示，低于所述值或甚至高于所述值表明个体存活可能性增加或降低的指示。这样的浓度可以如上所定义。
参考以下附图，将仅通过实施例的方式描述本发明图I显示基于其总FLC浓度而被分为三分位数(tertiles)的研究群体的存活可能性。图表由上至下显示线I :具有约20mg/l总FLC的中间浓度的个体；线2 :具有28. 2mg/l的中间浓度的个体；和线3 (下方的线)约42mg/l的中间浓度。所述存活图表中有16554人。图2显示存活图表图I中显示的三分位数的总FLC浓度的范围(以mg/分升表示)。图3显示以十分位数(deciles)表示的数据的进一步的分析，使用150月时的十分位数顺序的图表，从第一个十分位数最上方的线至最下方的第十个十分位数。
图4显示除去MGUS和/或异常FLC患者的数据，使用150月时的十分位数顺序的图表，从第一个十分位数最上方的线至最下方的第十个十分位数。图5是使用分离的、可商购的抗游离K和抗游离\分析试剂盒获得的总FLC浓度之间的比较，与使用组合的抗、和抗K游离轻链抗体的总FLC分析试剂盒相比较。图6(a_h)显示获自患者血清中C-反应蛋白(CRP)水平和FLC水平的比较，表明它们互相之间没有关联。
具体实施例方式美国的Mayo Clinic 已监测了 Olmsted County, Minnesota 的> 20000 名年龄为50 岁或更高的居民。使用获自 The Binding Site Group Limited, Birmingham, UnitedKingdom的用于游离k和V轻链的“Freelite 分析,在存档的冷冻的血清中追溯性地测量FLC浓度。Freelite分析是可商购的浊度分析和浑浊度分析，其被FDA批准作为辅助浆细胞病症例如多发性骨髓瘤和AL淀粉样变性病的诊断和监测。这些病症通常产生升高浓度的X或K FLC以及异常的FLC比例。Mayo Clinic的研究者测量存档血清中FLC的意图是确定是否有对象具有异常的FLC比例和一种或两种FLC的浓度升高。随后对具有这样的FLC异常但没有单克隆完整免疫球蛋白产生的证据的对象进行研究，以确定他们是否具有升高的恶性浆细胞病症的风险。然而，申请人推测，对于具有较低的总FLC水平的那些对象，对于没有任何单克隆免疫球蛋白或单克隆FLC产生的证据的对象的分析将表明存活增加。上述数据证明这是正确的。图I显示基于其总血清FLC浓度而被分为三分位数的群体的存活图表。三分位数，一、二、三(从顶部至底部)的特性列于下表中。
权利要求
1.用于测定样品中游离轻链(FLC)总量的分析试剂盒，其包含用于检测样品中FLC总量的一种或多种检测试剂。
2.如权利要求I所述的分析试剂盒，其包含抗游离λ抗体和抗游离K抗体或它们的片段。
3.如权利要求2所述的分析试剂盒，其中将所述抗体或片段混合在一起。
4.如权利要求2或3所述的分析试剂盒，其中所述抗体或片段结合在颗粒、例如乳胶颗粒上。
5.如前述权利要求之一所述的分析试剂盒，其用在整体健康筛选方法中以检测获自对象的样品中的总FLC。
6.用于如权利要求I至5之一所述方法中的分析试剂盒，其适于检测样品中低于25mg/L量的总游离轻链(FLC)。
7.如权利要求6所述的分析试剂盒，其适于检测约lmg/L量的总FLC。
8.如前述权利要求之一所述的分析试剂盒，其适于检测lmg/L-80mg/L量的总FLC。
9.如前述权利要求之一所述的分析试剂盒，其为浊度试剂盒或混浊度试剂盒。
10.如前述权利要求之一所述的分析试剂盒，其另外包含一种或多种成分，以测量样品中胆固醇、肌酸酐、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和CRP中一种或多种的浓度。
11.如前述权利要求之一所述的分析试剂盒，其包含多种用于FLC或成分的标准，以产生FLC或成分的浓度的标准曲线。
12.如权利要求11所述的分析试剂盒，其中所述标准包含一种或多种用于测定低于25mg/L的FLC浓度的标准。
13.整体健康筛选方法，包括检测获自对象的样品中游离轻链(FLC)的量，其中较低量的FLC与对象的存活增加和/或更好的整体健康关联，且较高水平的FLC表明可能存在未检测到的医学问题。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述对象没有威胁生命的疾病的明显症状，例如B-细胞相关的疾病或恶液质。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述游离轻链的量是样品中总游离轻链的量。
16.如权利要求13至15之一所述的方法，其中所述FLC在获自所述对象血清的样品中测定。
17.如权利要求13至16之一所述的方法，其中所述总FLC通过使用抗游离轻链抗体的免疫分析测定。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述抗体为抗游离K轻链抗体和抗游离λ轻链抗体的混合物。
19.如权利要求13至18之一所述的方法，其中所述方法包括通过浊度法或混浊度法检测所述FLC的量。
20.如权利要求13至19之一所述的方法，包括使用能够检测低于3mg/LFLC的诊断分析来检测FLC。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述分析能够检测约lmg/L和80mg/L之间的FLC。
22.如权利要求13至21之一所述的方法，其中所述样品为血清样品，且总FLC的量低于25mg/L表明对象中整体存活的可能性增加。
23.如权利要求13至22之一所述的方法，其进一步包括测定获自所述对象的样品中胆固醇、肌酸酐、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C或C-反应蛋白(CRP)的量的步骤。
24.如权利要求I至12之一所述的分析试剂盒，其进一步包含用于如权利要求13至23之一所述的方法中的使用说明。
25.如权利要求23所述的分析试剂盒，其另外包括正常值，使用所述分析试剂盒获得的FLC的正常值浓度表明对象的存活增加。
全文摘要
本发明提供了用于测定对象存活可能性的分析试剂盒和分析方法。本发明还提供了用于测定样品中游离轻链(FLC)的总量的分析试剂盒。本发明还提供了整体健康筛选方法，包括检测获自对象的样品中游离轻链(FLC)的量，其中较低量的FLC与对象的存活增加和/或更好的整体健康有关，且较高水平的FLC表明可能存在未检测到的医学问题。
文档编号G01N33/68GK102639999SQ201080036734
公开日2012年8月15日 申请日期2010年8月19日 优先权日2009年8月19日
发明者A·R·布拉德韦尔, G·P·米德 申请人:结合点集团有限公司