专利名称：：诊断、预后或监测eb病毒(ebv)相关癌症的方法和试剂盒的制作方法诊断、预后或监测EB病毒(EBV)相关癌症的方法和试剂盒发明领域本发明通常涉及通过一企测和/或定量肿瘤相关DNA序列it断、预后或监测个体癌症的方法和试剂盒。具体来说，本发明涉及通过4企测和/或定量尿中EBVDNA序列诊断、预后或监测EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)相关癌症的方法和试剂盒。
背景技术：
：EB病毒(EBV)是普遍存在的人类疱渗病毒，首先发现其与非洲型伯基特氏淋巴瘤(Burkitt，slymphoma,BL)相关。随后，还发现EBV感染与鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)密切相关。已经证明，可以在采集于中国南方的几乎所有NPC组织中^r测到EBV基因组(Chenetal.,Intervirology.36(2):91-8(1993);Dickensetal"JClinPathol.45(5):396-7(1992))。与这些结果一致，我们已经证明，可以在96%NPC患者的血浆中检测到EBVDNA,但仅在7%的健康个体中检测到非常低浓度的EBVDNA(Loetal.,CancerRes.59(6):1188-91(1999))。而且，血浆EBVDNA的水平，无i仑是治疗前测量的(Loetal.,CancerRes.60(24):6878-81(2000)),或治疗后测量的(Chanetal"JNatlCancerInst.94(21):1614-9(2002》,都对预测总生存率和无病生存率是有^介值的。同样，循环的EBVDNA也可用于^r测和监测其他EBV相关恶性肺瘤，如淋巴瘤(Leietal.,BrJHaematol.lll(l):239-46(2000))和胃癌(Loetal.,ClinCancerRes.7(7):1856-9(2001))。尽管这种血浆检验(plasmatest)可用于检测NPC,且是相对无风险的操作，但它仍然导致患者的疼痛和焦虑。然而，本领域并未公开尿样中短EBV相关核酸序列的检测和定量以及其用途。因此，需要开发诊断、预后和/或监测EBV相关癌症的替代检验。发明概述我们令人惊讶地发现，循环的无细胞EB病毒(EBV)DNA可穿过肾屏障，并且作为NPC和其他EBV相关恶性胂瘤的肺瘤标志，可在尿中检测到。本发明的第一方面提供了诊断个体EBV相关癌症的方法。所述方法包括(a)获得个体的尿样；以及(b)检测尿样中EBV相关核酸序列，其中尿样中存在EBV相关核酸序列，表示个体患有EBV相关癌症。本发明的第二方面提供了用于个体EBV相关癌症预后的方法。所述方法包括(a)获得个体的尿样；以及(b)检测尿样中EBV相关核酸序列，其中尿样中存在EBV相关核酸序列，表示EBV相关癌症的不良预后。本发明的第三方面提供了监测个体EBV相关癌症的方法。所述方法包括(a)获得不同时间点的个体尿样；以及(全测和/或定量尿样中EBV相关核酸序列，其中尿样中存在EBV相关核酸序列或EBV相关核酸序列水平升高，表示EBV相关癌症的进展，而尿样中缺少EBV相关核酸序列或EBV相关核酸序列水平降低则表示EBV相关癌症的抑制。在本发明方法的具体实施方案中，在EBV相关癌症的治疗过程中进行步骤(a),尿样中缺少EBV相关核酸序列或EBV相关核酸序列水平降低，表示治疗有效。在本发明优选的实施方案中，上述方法还包括分析尿样中EBV相关核酸序列大小的步骤以排除假阳性情况。在这些情况中，尿样中检测和/或定量的EBV相关核酸序列可能不是来自循环的EBV相关核酸片段，且是相对完整的。在本发明优选的实施方案中，上述EBV相关核酸序列来自EBV基因组5amHI-W区的至少一个DNA片段或其至少一个RNA转录本。优选地，DNA片^:或RNA转录本小于180个核苷酸。本发明的第四方面提供了用于个体EBV相关癌症诊断或预后的试剂盒。所述试剂盒包含a)用于从个体尿样中提取核酸的第一单元；以及b)用于4企测提取的核酸中EBV相关核酸序列的第二单元，其中第二单元包含用于扩增EBV基因组5amHI-W区的至少一个片4爻的至少一对引物。本发明的第五方面提供了监测个体EBV相关癌症的试剂盒。所述试剂盒包含a)多个用于从个体的尿样中提取核酸的第一单元；以及b)多个用于4企测和/或定量才是耳又的核酸中EBV相关核酸序列的第二单元，其中第二单元包含用于扩增EBV基因组5amHI-W区的至少一个片段的至少一对引物。在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含从个体获得尿样的装置。在本发明的一些实施方案中，上述EBV相关核酸是DNA。在其他实施方案中，其是RNA。在本发明一些优选的实施方案中，EBV相关癌症是鼻咽癌(NPC)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK-淋巴瘤)或胃癌。在更优选的实施方案中，EBV相关癌症是鼻咽癌。通过以示例的方式显示和描述的本发明优选实施方案的下述说明，本发明的优势对本领域普通技术人员将变得更为显而易见。附图简要说明图1显示依据尿EBVDNA的可4企测性，NPC患者的血浆EBVDNA的浓度；以及图2显示在具有可检测的尿EBVDNA的NPC患者中血浆EBVDNA和尿EBVDNA水平之间的相关性，其中(a):尿EBVDNA浓度表示为拷贝/mL尿，以及(b):尿EBVDNA浓度表示为拷贝/mmol尿肌氨酸酐。发明的详细描述除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属
技术领域：
的技术人员所通常理解的涵义。如上文所述，本发明的方法可用于诊断或预测EBV相关癌症，如鼻咽癌(NPC)。在这些方法中，首先从个体获得尿样，随后进行尿样中EBVDNA序列的检测和/或定量。也公开了监测个体EBV相关癌症的方法。所述方法包括下述步骤(a)获得不同时间点的个体尿样；以及(b)检测和/或定量尿样中EBVDNA序列。尿样中EBVDNA序列水平的差异作为EBV相关癌症的发展的指征。例如，尿样中存在EBVDNA序列或EBVDNA序列水平升高，表示EBV相关癌症的进展，而尿样中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列水平降低，则表示EBV相关癌症的抑制。这种方法特别适用于评估EBV相关癌症治疗的效率。员应当理解的是，该步骤在某些情况下不是必须的，在所述情况下，已经提前获得尿样，例如，在采样中心(samplingcenter)。在优选的实施方案中，尿样中EBVDNA序列的检测或定量包括如下步骤(l)从尿样中提取DNA;(2)扩增提取的DNA中EBVDNA序列；以及(3)检测和/或定量扩增的EBVDNA序列。如本文所用的，短语"EBVDNA序列"指EB病毒(EBV)基因组(GenBank登录号AJ507799)的片段，并且通常是基因组DNA降解的产物。特别是，本发明的EBVDNA序列包含EBV基因组SawHI-W区的至少一个片l殳。本文所用的SamHI陽W区指Jonesetal.，NucleicAcidsRes.11:3919-3937(1983)中公开的EBV基因组的重复5amHI醫W限制片段。可以理解，较长的DNA序列以较低的速率穿过肾屏障。因此，为了提高检测的灵敏度，本发明所选的EBVDNA序列的大小不超过180bp。优选，本发明靶标DNA序列的大小不超过76bp。本文所用术语"扩增(amplifying)"或"扩增(amplification)"意指EBVDNA序列其他拷贝的产生，通常利用聚合酶链式反应或本领域7>知的其他技术进行。可以利用PCR扩增EBVDNA序列单拷贝，达到可以由几种不同方法4企测的水平。在本发明优选的实施方案中，步骤(2)和步骤(3)通过实时定量PCR(Q-PCR)进行。本文所用术语"实时定量PCR"或"Q-PCR"指基于连续地光学监测荧光PCR反应进程的方法。在这种系统中，除了常夫见PCR所用的一对扩增引物外，还包括双标记的荧光杂交#:针。一种荧光染料作为报道分子(如FAM),且其发射谱由第二荧光染料(如TAMRA)淬灭。在PCR的延伸阶段，T叫DNA聚合酶的5，到3，的核酸外切酶活性从探针中切割报道分子，因此将其从淬灭剂中释放，导致焚光增加。荧光随后用于监测扩增过程并测定最初模板DNA的量。我们的研究发现，健康个体的尿中可以偶尔携带EBVDNA。为了排除这些假阳性情况，本发明的方法还包括分析尿样中存在的EBVDNA序列大小的步骤。在一些实施方案中，分析EBVDNA序列的大小通过两次或多次PCR检测或Q-PCR检测进行。这些检测使用不同大小的扩增子。因为较长的DNA序列以较低的速率穿过肾屏障，因此当使用更大的扩增子时，在相同的扩增循环后，将获得浓度低得多的最终扩增产物。如果利用不同大小的扩增子(如59bp和76bp),靶向EBVDNA序列的两种或多种PCR检测或Q-PCR检测产生相似量的最终扩增产物，则存在于尿样中的EBVDNA序列可能不是来自穿过肾屏障的循环EBVDNA。排除这些情况使本发明的方法对于NPC和其他EBV相关恶性肿瘤的诊断、预后或监测具更高的可靠性。可选地，我们可以以常失见方式分析大于180bp的EBV基因组片段是否存在于尿样中。因为大于180bp的DNA片段难以穿过肾屏障，因此个体尿样中存在大于180bp的EBV基因组片段可用于将所述个体从患有EBV相关癌症的患者中排除。如先前所述，血浆EBVDNA浓度可用于i貪断、预测或监测NPC和其他EBV相关恶性肺瘤。本发明公开了在血浆和尿EBVDNA浓度之间存在良好的相关性，即血浆EBVDNA浓度可以通过定量尿EBVDNA浓度测定。因此，尿中EBVDNA序列浓度的检测，是诊断、预测或监测NPC和其他EBV相关恶性肺瘤的血浆纟全测的优良替代方案。根据本发明，个体尿样中存在EBVDNA序列可用于指示EBV相关癌症，包括EBV相关癌症的发展进程。根据本发明，个体尿样中存在EBVDNA序列也可以作为EBV相关癌症的不良预测因素，用于预测个体总生存率或复发的可能性。当追踪患有EBV相关癌症的个体尿样中EBV序列的水平一段时间后，该水平的趋势反映了癌症的发展。通常，水平升高表示癌症的进展。尿中EBV序列水平的趋势也可以用于评估EBV相关癌症治疗的有效性。尿样中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列的水平降低是治疗有效的优良指征。上文将EBVDNA作为EBV相关核酸的i兌明性实例。本领域4支术人员公知的是，存在与EBV相关的其他类型核酸，如RNA。因此，在某些实施方案中，用于EBV相关癌症诊断、预后和监测的方法，包括检测EBV相关RNA,如人类个体尿样中EB编码的小RNA(Epstein-BarrencodedsmallRNA,EBER)。此外本发明公开了用于个体EBV相关癌症的诊断或预后的试剂盒。该试剂盒包含a)用于从尿样中提取DNA的第一单元；以及b)用于检测和/或定量提取的DNA中EBVDNA序列的第二单元，其中第二单元包含用于扩增EBV基因组万amHI-W区的至少一个片段的至少一对引物。本发明还公开了监测个体EBV相关癌症的试剂盒。该试剂盒包含a)多个用于从尿样中提取DNA的第一单元；以及b)多个用于才企测和/或定量提取的DNA中EBVDNA序列的第二单元，其中第二单元包含扩增EBV基因组5a附HI-W区的至少一个片段的至少一对引物。在优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于从个体获得尿样的装置。如果需要，试剂盒还可以包含使用试剂盒的说明书。通常，试剂盒的第二单元还包含Q-PCR检测的探针。为了排除上文提到的假阳性情况，试剂盒优选包含不同大小扩增子的引物。例如，试剂盒包含扩增180bpEBVDNA序列的一对引物，以及扩增76bpEBVDNA序列的另一对引物。监测EBV相关癌症的本发明的试剂盒，特别用于评估EBV相关癌症治疗的有效性，因为尿样中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列水平降低，可以作为治疗有效的指征。对本领域技术人员显而易见的是，通过利用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测或实时定量反转录酶聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)检测，本发明的试剂盒也可以用于4企测和/或定量尿样中EBVRNA序列，进行个体EBV相关癌症的诊断、预后或监测。仅以说明而非限制的方式，提供下述实施例。实施例募集44名NPC患者以及70名健康对照个体。首先从个体尿样和血浆样品中提取DNA,随后，如下文所述，利用靶向EBV基因组5amHI-W区(Lo1999etal.)的定量实时PCR，扩增提取的DNA的EBVDNA。尿和血浆中DNA片段的提取将来自每个研究个体的10ml尿收集于含有EDTA的试管中。将尿样在4°C下1,600g离心10分钟。用0.45的过滤器过滤上清液，除去任何残余的细胞。利用WizardPlusMiniprepDNA纯化试剂盒(WizardPlusMiniprepDNAPurificationKit,Promega,Madison,WI),从尿样中提耳又DNA。将经过滤的上清液与15mL6M的异石克氰酸胍(guanidineisothiocyanate,GITC)完全混合。向每个样品中加入1mlDNA纯化试剂盒中的树脂悬浮液，随后于室温下在滚轴混合器(Rollermixer)上将混合物完全混合2小时。随后利用30mL注射器，使尿-树脂混合物流经试剂盒中提供的小型柱(minicolumn)。随后使2ml洗涤液流经小型柱。通过简单离心清除剩余的洗涤液。向小型柱中加入100微升H20，用于洗脱DNA片段。从血浆中提取DNA片段的方法，在本领域内是已知的，如Loetal.CancerRes.60(24):6878-81(2000)所述的利用QIAamp血液试剂盒(QIAampBloodKit,Qiagen，Hilden,Germany)的方法。简而言之，根据本领域已经建立的实验方案，从患者获得血浆样品。将样品存储于-20°C，直到进一步处理。利用QIAamp血液试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany),采用制造商推荐的"血液和体液实验方案"，从血浆样品中提取DNA。每个柱利用总计400-800血浆样品，进行DNA提取。记载准确的样品量，用于计算把标DNA浓度。50/d的终洗脱体积用于从提取柱中洗脱DNA。EBVDNA片段的检测和定量尿EBVDNA的浓度通过都耙向EBV基因组5amHI-W区的两次实时PCR检测测定。两种PCR检测的扩增子大小为76bp和59bp。76bp扩增子才企测所用的引物为5，-CCCAACACTCCACCACACC-3，(SEQIDNO.l)和5，-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3，(SEQIDNo.2)。59bp扩增子检测所用的引物为5，-CCCAGGCACACACTACACACA-3，(SEQIDNo.3)和5，-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3，(SEQIDNo.4)。76bp和59bp扩增子检测所用的荧光探针分别为5，-(FAM)-CACACACTACACACACCCACCCGTCTC-(TAMRA)-3'(SEQIDNo.5)和5，-(FAM)-CACCCGTCTCAGGG-(MGB)-3，(SEQIDNo.6)。PCR反应设置为50的反应体积。每个反应含有5|iL10x的緩冲液A;300nM的每种扩增引物；25nM相应荧光4笨针；4mMMgCl2;均为200的dATP、dCTP和dGTP;400)iMdUTP;1,25单位的AmpliTaqGold;以及0.5单位的AmpErase尿嘧咬N-糖基化酶。用10)al提取的尿DNA作为模板。两个PCR系统使用相同的热模式(thermalprofile),即50。C,2min;950C,10min，随后40个循环的95°C15s以及56。C1min。利用从EBV阳性细胞系Namawa提取的DNA作为标准，对每个分析并行运行才交准曲线。Namalwa是二倍体细胞系，每个细胞含有两个完整的EBV基因组。每个样品分析两次，随后取平均值，进行分析。尿EBVDNA的数量可以表示为浓度/单位体积尿。例如拷贝/mL尿，或表示为数量/尿样中另一种物质的量，以校准尿的浓度，例如拷贝/mmol肌氨酸酐。尿样中存在EBV或EBV的水平为NPC的有用临床标志分别利用76bp和59bp检测，在NPC患者的10(23%)和22(50%)个尿样中检测到EBVDNA(表1)。59bp检测的更高检测率表明，更短的DNA分子更易于过滤通过肾屏障，并且可在尿中检测到。与我们之前的结果一致，可在几乎所有来自NPC患者的血浆样品中检测到EBVDNA。如表1所示，来自NPC患者的41(93%)个血浆样品可以利用59bp检测或76bp检测进行检测。耙标片段大小的进一步减少可进一步增加EBV相关核酸4企测的灵敏度。表1:利用59bp和76bp检测，NPC患者的尿EBVDNA的检出率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>作为对照，也分析了70名健康个体。利用76bp检测，在3名(40/。)个体的血浆中，EBVDNA是可以4企测的(表2)。它们的血浆EBVDNA浓度为13拷贝/mL,17拷贝/mL和22拷贝/mL。当与44名NPC患者的血浆EBVDNA水平(中间值950拷贝/mL)相比时，这些水平相对较低。在这三名对照个体的尿中，检测不到EBVDNA。表2:利用59bpEBVDNA检测，NPC患者和健康对照个体的尿EBVDNA的<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>假阳性情况评估的排除令人吃惊的是，在血浆检测不到EBVDNA的两名健康个体的尿中，检测到了EBVDNA,浓度为227拷贝/mL和1,280,000拷贝/mL。用76bp和180bp大小的扩增子大小，采用靶向EBV基因组5awHI-W区的两种实时PCR检测，分析了这两个尿样。利用所述两种检测，这两名个体的尿EBVDNA浓度相对恒定。对于前者前一个体而言，利用76bp和180bp检测，尿EBVDNA浓度分别为333拷贝/mL和243拷贝/mL。对于后者后一个体而言，利用76bp和180bp检测，尿EBVDNA分别为1,220,000拷贝/mL和1,073,000拷贝/mL。相反，对于在59bp和76bp两种检测中均检测到尿EBVDNA的NPC患者而言，浓度的平均下降(mediandrop)为93.5%。利用180bp检测，在44名NPC患者的尿中，未检测到尿EBVDNA。利用两种不同大小的PCR检测，两名健康个体相对恒定的尿EBVDNA浓度表明，他们尿中检测到的EBVDNA分子与NPC患者尿中检测到的EBVDNA相比是相对完整的。一种可能的解释是，两名对照个体的尿中存在完整的病毒颗粒，其可能来自活性病毒复制。诊断上，尿EBVDNA的大小可包括于分析中，以增加尿EBVDNA分析的特异性。血浆浓度和尿EBVDNA浓度之间的相关性利用76bp实时PCR检测，分析NPC患者的血浆EBVDNA浓度。具可^r测和不可^r测的尿EBVDNA的患者的平均血浆EBVDNA浓度分别为2054拷贝/mL和511拷贝/mL(pO.0001,曼-惠特尼检验(Mann-Whitneytest))。在具有可^r测的尿EBVDNA的患者中，血浆EBVDNA浓度在统计学上显著更高。结果显示于图1中。对于具有可才企测的尿EBVDNA患者，我们研究了在血桨浓度和尿EBVDNA浓度之间是否存在任何相关性。在血浆浓度和尿EBVDNA浓度之间，存在显著的正相关性(r=0.684,p<0.0001,斯皮尔曼相关性(Spearmancorrelation);图2a)。因为EBVDNA尿浓度受患者水合状态的影响，我们用肌氨酸酐的尿浓度校正了EBVDNA的尿浓度，并以拷贝/mmol肌氨酸酐表示EBVDNA的浓度。当用尿肌氨酸酐浓度才交正尿EBVDNA浓度时，血浆浓度和尿EBVDNA的浓度之间的正相关性变得更加显著(r:0.748,p<0.0001，斯皮尔曼相关性；图2b)。尿才羊中存在EBVDNA或EBVDNA水平是预后的有用标志在平均追踪8个月后，44名NPC患者中有三名出现了临床复发。所有三名患者在治疗前尿中具有可^r测的EBVDNA。相反，具有不可检测的尿EBVDNA的22名患者中没有人出现临床复发。因为具有可才全测的尿EBVDNA的患者具有显著更高的血浆EBVDNA水平，预期也可以将尿EBVDNA作为治疗后生存率的预后标志，因为已知高血浆EBVDNA水平是治疗后疾病复发的不良预后因素。可以预期，存活概率中的差异随着追踪期限的增加会变得更为突出。应当理解，尽管结合详细的说明对本发明进行了描述，但上述说明意在示例而非限制本发明的范围。本说明书引用的和/或列于申请数据页中的所有上述的美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、国外专利、国外专利申请以及非专利出版物，通过引用的方式以其整体并入本文。参考文献Chan,ATC,Lo,YMD,Zee,B,Chan,LYS,etal.(2002)PlasmaEpstein-BarrvimsDNAandresidualdiseaseafterradiotherapyforundifferentiatednasopharyngealcarcinoma(未分"f匕鼻口因癌力文射治疗后血浆EB病毒DNA和残留病).JNatlCancerInst94(21):1614-9.Chen,CL，Wen,WN，Chen,JY,Hsu,MM,etal.(1993)DetectionofEpstein-BarrvirusgenomeinnasopharyngealcarcinomabyinsituDNAhybridization(通过原位DNA杂交检测鼻咽癌中EB病毒基因组).Intervirology;36(2):91-8.Dickens,P,Srivastava,G,Loke,SL，Chan,CW,etal,(1992)Epstein-BarrvirusDNAinnasopharyngealcarcinomasfromChinesepatientsinHongKong(香港中国患者鼻咽癌中的EB病毒DNA).JClinPathol;45(5):396-7.Jones,MDandGriffin,BE.(1983)ClusteredrepeatsequencesinthegenomeofEpstein-Barrvirus(EB病毒基因组中成簇的重复序列)NucleicAcidsRes;11:3919-3937.Lei,KI,Chan,LYS,Chan,WY,Johnson,PJ,etal.(2000)Quantitativeanalysisofcirculatingcell-freeEpstein-Barrvirus(EBV)DNAlevelsinpatientswithEBV-associatedlymphoidmalignancies(患有EBV相关淋巴恶性胂瘤的患者中循环的无细胞EB病毒(EBV)DNA水平的定量分析).BrJHaematol11l(l):239-46.Lo,YMD，Chan,ATC,Chan,LYS,Leung,SF,etal.(2000)MolecularprognosticationofnasopharyngealcarcinomabyquantitativeanalysisofcirculatingEpstein-BarrvirusDNA(通过循环EB病毒DNA的定量分析对鼻咽癌的分子预测).CancerRes;60(24):6878-81.Lo,YMD,Chan,LYS,Lo，KW，Leung,SF,etal.(1999)Quantitativeanalysisofcell-freeEpstein-BarrvirusDNAinplasmaofpatientswithnasopharyngealcarcinoma(患有鼻咽癌的患者的血浆中无细月包EB病毒DNA的定量分析).CancerRes;59(6):l188-91.Lo，YMD,Chan,WY,Ng,EK,Chan,LY,etal.(2001)CirculatingEpstein-BarrvimsDNAintheserumofpatientswithgastriccarcinoma(患有胃癌的患者血清中循环的EB病毒DNA).ClinCancerRes;7(7):1856-9.权利要求1.诊断个体EB病毒(EBV)相关癌症的方法，包括(a)获得个体的尿样；以及(b)检测所述尿样中EBV相关核酸序列，其中所述尿样中存在EBV序列，表示所述个体患有EBV相关癌症。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括(bl)从所述尿样中提取核酸；(b2)从所提取的核酸样品中扩增所述EBV相关核酸序列；以及(b3);险测扩增的EBV相关核酸序列。3.如权利要求l所述的方法，其中所述EBV相关核酸是DNA。4.如权利要求1所述的方法，其中所述EBV相关核酸序列来自EBV基因组5amHI-W区的至少一个片段。5.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一个片段小于180个核苦酸。6.如权利要求1所述的方法，还包括分析大于180个核苷酸的EBV基因组片段是否存在于所述尿样中的步骤，其中所述尿样中存在大于180个核普酸的EBV基因组片段，表示所述个体未患有EBV相关癌症。7.如权利要求l所述的方法，其中在步骤(b)中定量SamHI-W区的两个片段，其中所述两个片段大小不同且都小于180个核苷酸，且其中，在所述尿样中，所述两个片段的水平基本上相等，表示所述个体未患有EBV相关癌症。8.如权利要求l所述的方法，其中在步骤(b)中，进行聚合酶链式反应(PCR)检测、反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测、实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测或实时定量反转录酶聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)检测。9.如权利要求8所述的方法，其中所述PCR或Q-PCR检测中所用的一对引物选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。10.如权利要求8所述的方法，其中所述Q-PCR检测中所用的探针具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列。11.如权利要求l所述的方法，其中所述EBV相关癌症是鼻咽癌(NPC)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。12.个体EBV相关癌症预后的方法，包括(a)获得个体的尿样；以及(b)检测所述尿样中EBV相关核酸序列，其中所述尿样中存在所述EBV相关核酸序列，表示所述EBV相关癌症的不良预后。13.如权利要求12所述的方法，其中所述不良预后包括所述个体低总生存概率或高复发。14.如权利要求12所述的方法，其中所述EBV相关核酸是DNA.15.如权利要求12所述的方法，其中步骤(b)包括(bl)从所述尿样中^是取核酸；(b2)从所提取的核酸中扩增所述EBV相关核酸序列；以及(b3)检测扩增的EBV相关核酸序列。16.如权利要求12所述的方法，其中所述EBV相关核酸序列来自EBV基因组5amHI-W区的至少一个片段。17.如权利要求16所述的方法，其中所述至少一个片段小于180个核香酸。18.如权利要求12所述的方法，其中在步骤(b)中进行聚合酶链式反应(PCR)检测、反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测、实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测或实时定量反转录酶聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)检测。19.如权利要求18所述的方法，其中所述PCR、RT-PCR、Q-PCR或Q-RT-PCR检测中所用的一对引物选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。20.如权利要求18所述的方法，其中所述Q-PCR或Q-RT-PCR检测中所用的探针具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列。21.如权利要求12所述的方法，其中所述EBV相关癌症是鼻咽癌(NPC)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。22.监测个体EBV相关癌症的方法，包4舌(a)获得不同时间点的个体尿样；以及(b)4全测和/或定量所述尿样中EBV相关核酸序列，其中所述尿样中存在所述EBV相关核酸序列或所述EBV相关核酸序列水平升高，表示所述EBV相关癌症的进展，而所述尿样中缺少所述EBV相关核酸序列或所述EBV相关核酸序列水平降低，表示所述EBV相关癌症的抑制。23.如权利要求22所述的方法，其中步骤(b)包括(bl)从所述尿样中提耳又核酸；(b2)从所提取的核酸中扩增所述EBV相关核酸序列；以及(b3)一企测和/或量化扩增的EBV相关核酸序列。24.如^K利要求22所述的方法，其中在治疗所述EBV相关癌症的过程中进行步骤(a)，所述尿样中缺少所述EBV相关核酸序列或所述EBV相关核酸序列水平降低，表示治疗有效。25.如权利要求22所述的方法，其中所述EBV相关核酸是DNA。26.如权利要求22所述的方法，其中所述EBV相关核酸序列包含EBV基因组SawHI-W区的至少一个片段。27.如^5l利要求26所述的方法，其中所述至少一个片l史小于180个核苦酸。28.如权利要求22所述的方法，其中在步骤(b)中进行聚合酶链式反应(PCR)检测、反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测、实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测或实时定量反转录酶聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)检测。29.如权利要求28所述的方法，其中所述PCR、RT-PCR、Q-PCR或Q-RT-PCR检测中所用的一对引物选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。30.如4又利要求28所述的方法，其中所述Q-PCR或Q-RT-PCR检测中所用的探针具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列。31.如权利要求22所述的方法，其中所述EBV相关癌症是鼻咽癌(NPC)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。32.用于个体EBV相关癌症诊断或预后的试剂盒，包含a)用于从所述个体的尿样中提取核酸的第一单元；以及b)用于4全测所换:取的核酸中EBV相关核酸序列的第二单元，其中所述第二单元包含用于扩增EBV基因组J5amHI-W区的至少一个片段的至少一对引物。33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述EBV相关核酸是DNA。34.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述EBV基因组5awHI-W区的至少一个片段小于180个核苦酸。35.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述一对引物选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。36.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述第二单元还包含具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列的4笨针。37.如权利要求32所述的试剂盒，还包含用于从个体获得尿样的装置。38.如;K利要求32所述的试剂盒，其中所述EBV相关癌症是鼻咽癌(NPC)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。39.监测个体EBV相关癌症的试剂盒，包含a)多个用于从所述个体的尿样中提取核酸的第一单元；以及b)多个用于4企测和/或定量所提取的核酸中EBV相关核酸序列的第二单元，其中所述第二单元包含用于扩增EBV基因组5amHI-W区的至少一个片段的至少一对引物。40.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述EBV相关核酸是DNA。41.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述EBV基因组SamHI-W区的至少一个片段小于180个核苦酸。42.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述至少一对引物选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。43.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述第二单元还包含具有SEQIDNO.5或SEQIDN0.6的DNA序列的4笨4十。44.如权利要求39所述的试剂盒，还包含用于从个体获得尿样的装置。45.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述EBV相关癌症是鼻咽癌(NPC)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。全文摘要本发明公开了通过检测和/或定量个体尿样中EBV相关核酸片段对EB病毒(EBV)相关癌症进行诊断、预后或监测的无创方法。也公开了对癌症进行诊断、预后或监测的试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101622362SQ200880006051公开日2010年1月6日申请日期2008年1月30日优先权日2007年2月26日发明者卢煜明,陈君赐申请人:香港中文大学