阿兹海默氏病的诊断、预后和监测中的寡聚体Aβ的制作方法
【专利说明】阿兹海默氏病的诊断、预后和监测中的寡聚体A β
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是非临时性的，并要求2012年3月13日提交的61/610,390的利益，在此 为所有目的以其整体通过参考并入本文。
【背景技术】
[0003] 阿兹海默氏病（AD)是引起老年痴呆症的渐进性疾病（Selkoe，TINS 16:403 (1993) ； Har dy 等，WO 92/13069 ；Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994) ;Duff 等，Nature 373:476 (1995) ;Games 等，Nature 373:523(1995))。广义来说，该疾病分为两类：在老年(65+岁）发生的迟发型，以及在老年 期之前、即35至60岁之间充分显露的早发型。在这两种类型的疾病中，病理学相同，但是 在较早年龄开始的病例中异常情况趋于更严重且广泛。AD以淀粉样斑块、神经元纤维缠结 和脑神经元丧失为特征。神经元纤维缠结是微管结合性Tau蛋白的细胞内沉积物，其由相 互缠绕成对的两条细丝构成。淀粉样斑块是跨度高达150 μπι的无序神经纤维网区域，在中 心处具有细胞外淀粉样沉积物，其可以通过大脑组织切片的显微镜分析看到。早发型阿兹 海默氏病与尤其是APP或早衰蛋白基因中的遗传突变以及唐氏综合征中21号染色体的三 倍体性相关。
[0004] 淀粉样斑块的首要组成成分是被称为Αβ的肽。Αβ由大的跨膜糖蛋白、即淀粉 样前体蛋白（APP)的蛋白水解加工产生。Αβ的长度为39至43个氨基酸不等。优势形式 A β 40长为40个氨基酸，并被认为是短形式。第二常见的形式A β 42长为42个氨基酸，并被 认为是长形式。A β 42与致病力相关，并且是神经炎斑块（90% )和实质血管沉积物（75% ) 中的主要组成成分。Roher 等，Proc. Nat' I Acad. Sci. USA90:10836 (1993)。Αβ 的羧基端 包括APP的疏水跨膜结构域的一部分，这可以解释它聚集成形成斑块的纤丝的倾向性。
[0005] Αβ的渐进性脑沉积可以发生在认知症状之前数年或甚至数十年（Selkoe，J. Neuropath, and Exp. Neurol. 53:438 (1994)和 Selkoe, Neuron6:487 (1991))。通过在认知 症状出现之前检测淀粉样斑块的形成和/或与疾病相关的其他生理异常的测定法，可以便 于AD的治疗和预防。大脑活组织检查是高度侵入性的并因此是不想要的，尤其是在未表现 出认知症状的受试者中。已报道，淀粉样沉积物的体内成像是大脑活组织检查的可替选方 案（W011/106732)，但是成像技术需要复杂且昂贵的设备，并需要专业人员来解释图像。
[0006] 另一种方法是检测组织样品、尤其是体液中的生物标志物。已报道与健康对照 相比，在患有AD的受试者的脑脊液（CSF)中可溶性Αβ 42的水平较低。已报道由神经元 细胞损伤所释放的另一种生物标志物Tau，在AD患者的CSF中升高（Vandermeeren等， J. Neurochem. 61:1828 (1993))。已提出将可溶性A β和/或可溶性Tau的测量用于诊断和 监测AD (参见例如美国专利号7, 700, 309)。然而，在非AD和AD受试者中，这些生物标志物 的范围重叠，引起假阴性和假阳性。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了辅助阿兹海默氏病或其易感性的诊断、预后或监测的方法。这样的 方法包括：(a)测量来自于受试者的体液样品中单体A β的量；(b)测量来自于所述受试者 的第二体液样品中单体和寡聚体Αβ的量；（c)将所述单体Αβ的量与单体和寡聚体Αβ的 量进行比较；以及（d)将所述比较用于所述受试者中阿兹海默氏病或其易感性的诊断、预 后或监测。某些方法确定单体Aβ与单体和寡聚体Aβ之间的比率，单体A β比单体和寡 聚体Αβ的较小的商数，指示了所述受试者的发生所述疾病的更高的易感性、所述疾病存 在的更高的可能性或病情的恶化。某些方法确定单体Aβ与寡聚体Aβ之间的比率，单体 A β比寡聚体A β的较小的商数，指示了所述受试者的发生所述疾病的更高的易感性、所述 疾病存在的更高的可能性或病情的恶化。某些方法确定寡聚体Aβ的量，寡聚体Aβ的较 高的量，指示了所述受试者的发生所述疾病的更高的易感性、所述疾病存在的更高的可能 性或病情的恶化。
[0009] 某些方法测量 Αβχ-37、Αβχ-38、Αβχ-39、Αβχ-40、Αβχ-41 和 Αβχ-42 中的至 少一个。某些方法至少测量Αβχ-40。某些方法至少测量Αβχ-42。某些方法至少测量 Αβχ-40 和 Αβχ-42。
[0010] 在某些方法中，单体Αβ的量使用一种或多种抗体来测量，所述抗体结合一个或 多个C-端表位，所述C-端表位在单体A β中存在并且在寡聚体A β中不存在。在某些方 法中，所述一种或多种C-端抗体是一种或多种针对△0 37、六0 38、六0 39、六0 4〇、六041或 A β 42的末端特异性抗体。在某些方法中，所述一种或多种C-端抗体包括末端特异性针对 A β 40的抗体，任选地为抗体2G3。在某些方法中，所述一种或多种C-端抗体包括末端特异 性针对A β 42的抗体，任选地为抗体21F12。在某些方法中，所述一种或多种C-端抗体包 括末端特异性针对A β 40的抗体和末端特异性针对A β 42的抗体。在某些方法中，所述单 体Αβ通过免疫亲和夹心测定法来测量，所述测定法包括所述一种或多种C-端抗体和结合 N-端和/或中央表位的另一种抗体。在某些方法中，所述另一种抗体结合N-端表位，任选 地是抗体3D6。在某些方法中，所述另一种抗体结合中央表位，任选地是抗体266。在某些 方法中，所述一种或多种C-端抗体是报告抗体，所述另一种抗体是捕获抗体。在某些方法 中，所述一种或多种C-端抗体是捕获抗体，所述另一种抗体是报告抗体。在某些方法中，所 述一种或多种报告抗体用钌标记，并且所述捕获抗体用生物素标记。
[0011] 在某些方法中，在步骤（b)中测量单体和寡聚体Αβ的量，包括用将寡聚体Αβ转 变成单体Αβ的解聚试剂处理所述样品，并测定所述解聚试剂处理过的样品中单体Αβ的 量。在某些方法中，所述解聚试剂包含离液剂以将寡聚体溶解成单体。离液剂包括盐酸胍、 异硫氰酸胍、脲、硫脲、高氯酸锂和/或碘化钾。在某些方法中，所述解聚试剂包含非离子型 去污剂。在某些方法中，所述解聚试剂包含聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多酚和/或某些小 分子例如六氟异丙醇。在某些方法中，所述解聚试剂处理过的样品中单体Αβ的量，通过与 步骤（a)中用于测量单体Αβ的量相同的测定法来测量。在某些方法中，所述测量步骤通 过定量质谱术来进行。在某些方法中，所述测量步骤通过毛细管或凝胶电泳，然后通过定量 蛋白质印迹法来进行。
[0012] 在某些方法中，所述体液样品是CSF样品。在某些方法中，所述体液样品是血液样 品。在某些方法中，所述血液样品是血浆样品。在某些方法中，步骤（a)和（b)同时进行。 在某些方法中，所述步骤（a)的样品和所述步骤（b)的第二样品是来自于单一样品的不同 等份试样。
[0013] 在某些方法中，所述受试者没有认知缺损，并且步骤（d)评估所述受试者发生阿 兹海默氏病的易感性。在某些方法中，所述受试者具有轻度认知缺损，并且步骤（d)评估所 述受试者发生阿兹海默氏病的易感性。在某些方法中，所述受试者具有认知缺损，并且步骤 (d)包括使用步骤（C)的比较与所述受试者病症的其他症状和/或征兆的组合来提供阿兹 海默氏病的诊断。在某些方法中，所述受试者在进行所述方法之前已被诊断为患有阿兹海 默氏病，并且步骤（d)提供所述疾病阶段的指示。在某些方法中，所述受试者正接受阿兹海 默氏病的治疗或预防，并且步骤（d)提供所述受试者对治疗的响应的指示。在某些方法中， 所述方法在同一受试者上每隔一段时间进行，并且步骤（C)的比较随时间的变化提供了所 述受试者对治疗的响应的指示。
[0014] 在某些方法中，所述受试者正用针对Αβ的免疫疗法治疗。在某些方法中，所述受 试者正用百平珠单抗（bapineuzumab)治疗。某些方法还包括在进行步骤（a)和（b)之前， 用针对百平珠单抗的抗独特型抗体、任选地用JHlL 22G2处理所述样品。某些方法还包括 测定所述样品中Tau或P-Tau的量，其中Tau或P-Tau相对于对照值的增加，提供了所述受 试者的发生阿兹海默氏病的易感性、阿兹海默氏病的存在或病情恶化的进一步指示。
[0015] 在某些方法中，所述受试者是进入临床试验以测试用于阿兹海默氏病的治疗或预 防的药物的候选者，其中如果所述单体Αβ比单体和寡聚体Αβ的商数低于阈值，则所述受 试者被包含在所述临床试验中，如果所述受试者高于所述阈值，则所述受试者被排除出所 述临床试验。某些方法还包括将所述诊断、预后或监测告知所述受试者或所述受试者的护 理提供者。
[0016] 在某些方法中，至少所述比较单体Αβ和单体和寡聚体Αβ的量的步骤在计算机 中执行。在某些方法中，所述计算机接收与单体Αβ的量以及单体和寡聚体Αβ的量有关 的信号，将所述信号转变成定量的量，比较所述定量的量，并提供与所述量、所述量的比较、 所述受试者的情况或所述受试者的推荐治疗有关的输出。
[0017] 本发明还提供了确定向群体中的哪些受试者给药药物以进行阿兹海默氏病的预 防或治疗的方法。这样的方法包括对所述群体中的每个受试者：(a)测量体液样品中单体 Αβ的量；(b)测量体液的第二样品中单体和寡聚体Αβ的量；以及（c)将单体Αβ的量与 单体和寡聚体Αβ的量进行比较，其中在所述比较的基础上，所述群体中的受试者接受或 不接受药物来治疗阿兹海默氏病或进行阿兹海默氏病的预防。在某些方法中，所述比较确 定单体A β与单体和寡聚体A β之间的比率，并且其中单体A β比单体和寡聚体A β的商 数低于阈值的受试者接受所述药物。
[0018] 本发明还提供了确定给予群体中的受试者何种治疗方案的方法。这样的方法需要 测量体液样品中单体Αβ的量；测量体液的第二样品中单体和寡聚体Αβ的量；以及将单 体Αβ的量与单体和寡聚体Αβ的量进行比较。所述受试者的第一子群体用第一治疗方案 治疗，所述受试者的第二子群体用第二治疗方案治疗，其中在所述第一子群体的受试者和 第二子群体的受试者之间，单体Αβ比单体和寡聚体Αβ的比率显著不同。在某些这样的 方法中，所述第一治疗方案包括用于阿兹海默氏病的预防或治疗的药物，所述第二治疗方 案不包括所述药物，并且所述第一子群体的受试者与所述第二子群体的受试者相比具有较 低的单体A β比单体和寡聚体A β的比率。在某些这样的方法中，所述单体A β比单体和 寡聚体A β的商数在所述第一子群体的受试者中低于阈值，并且在所述第二子群体的受试 者中低于阈值。Αβ形式的测量和与寡聚体Αβ相关的参数的计算可以按照本文中描述的 任何方法来进行。
[0019] 本发明还提供了对群体中的受试者进行差异治疗的方法，所述方法包括用第一治 疗方案治疗所述受试者的第一子群体，并用第二治疗方案治疗所述受试者的第二子群体， 其中所述第一子群体中的受试者和所述第二子群体中的受试者具有显著不同的单体Αβ 比单体和寡聚体Αβ的平均比率。在某些方法中，所述第一子群体的受试者用预防或治疗 阿兹海默氏病的药物治疗，所述第二子群体的受试者不用所述药物治疗，并且与所述第二 子群体中的受试者相比，单体Αβ比单体和寡聚体Αβ的比率，在所述第一子群体的受试者 中明显更低。
[0020] 本发明还提供了确定将群体中的哪些受试者征召到临床试验中的方法，所述方法 包括对所述群体中的每个受试者：测量体液样品中单体A β的量；测量体液的第二样品中 单体和寡聚体Αβ的量；以及将单体Αβ的量与单体和寡聚体Αβ的量进行比较，其中在所 述比较的基础上，将所述群体中的受试者征召或不征召到所述临床试验中。在某些方法中， 所述比较确定单体Αβ与单体和寡聚体Αβ之间的比率，并且其中单体Αβ比单体和寡聚 体Αβ的商数落于阈值之下的受试者被征召到所述临床试验中。
[0021] 本发明还提供了一种诊断试剂盒，其包含：至少一种末端特异性针对Αβ 37、 A β 38、A β 39、A β 40、A β 41或A β 42的C-端抗体；结合A β的N-端和/或中央表位的抗 体；以及将可溶性寡聚体Αβ转变成单体Αβ的解聚试剂。在某些试剂盒中，所述C-端抗 体末端特异性针对A β 40或A β 42。某些试剂盒包含末端特异性针对A β 40的C-端抗体和 末端特异性针对A β 42的C-端抗体，提供了多种用于疾病评估的比率，以提高方法结果的 准确性或灵敏度。
[0022] 本发明还提供了筛选具有对抗阿兹海默氏病的活性的药剂的方法，所述方法包 括：将阿兹海默氏病的转基因啮齿动物模型与所述药剂相接触；比较与所述药剂相接触的 转基因啮齿动物的体液中单体Αβ的量与单体和寡聚体Αβ的量；以及使用所述比较来确 定所述药剂是否具有可用于治疗阿兹海默氏病的活性。
[0023] 本发明还提供了分析Αβ的方法，所述方法包括：(a)测量来自于受试者的体液样 品中Αβ的量，其中所述样品没有用解聚试剂处理；(b)测量来自于所述受试者的体液样品 中Αβ的量，其中所述样品用解聚试剂处理；并且（c)比较在步骤（a)和（b)中测量的量。 在某些方法中，步骤（a)和（b)中的所述测量使用末端特异性针对Αβ的C-端的抗体来进 行。在某些方法中，步骤（c)中的比较确定了步骤（a)中的量与步骤（b)中的量的比率，或 步骤（a)和步骤（b)中的量之间的差。某些方法还包括将所述比率或差用于所述受试者中 阿兹海默氏病或其易感性的诊断、预后或监测，步骤（a)中的量比步骤（b)中的量的较低商 数或步骤（b)中的量与步骤（a)中的量之间的较高差值，指示了所述受试者的发生所述疾 病的更高的易感性、所述疾病存在的更高的可能性或病情的恶化。
[0024] 在某些方法中，步骤（a)和（b)测量Αβχ-37、Αβχ-38、Αβχ-39、Αβχ-40、Αβχ-41 和Αβχ-42中的至少一个。在某些方法中，步骤（a)和（b)至少测量Αβχ-40。在某些方法 中，步骤（a)和（b)至少测量Αβχ-42。在某些方法中，步骤（a)和（b)至少测量Αβχ-40 和Αβ χ-42。在某些方法中，Αβ的量使用一种或多种末端特异性针对Αβ 37、Αβ 38、Αβ 39、 Αβ 40、Αβ 41或Αβ 42的C-端抗体来进行。在某些方法中，一种或多种C-端抗体包括末 端特异性针对A β 40的抗体和末端特异性针对A β 42的抗体。在某些方法中，A β通过免 疫亲和夹心测定法来测量，所述测定法包括所述一种或多种C-端抗体和结合N-端和/或 中央表位的另一种抗体。在某些方法中，所述解聚试剂包含盐酸胍、异硫氰酸胍、脲、硫脲、 高氯酸锂和/或碘化钾、非离子型去污剂、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多酚和/或六氟异丙 醇。在某些方法中，步骤（a)和（b)使用相同的测定法来测量Αβ的量。在某些方法中，所 述体液样品是CSF样品或血液样品。
[0025] 某些方法还包括步骤（d)将所述比率或差用于所述受试者中阿兹海默氏病或其 易感性的诊断、预后或监测中，步骤（a)中的量比步骤（b)中的量的较低商数或步骤（b)中 的量与步骤（a)中的量之间的较高差值，指示了所述受试者的发生所述疾病的更高的易感 性、所述疾病存在的更高的可能性或病情的恶化。在某些方法中，受试者没有认知缺损，并 且步骤（d)评估所述受试者发生阿兹海默氏病的易感性。在某些方法中，所述受试者具有 轻度认知缺损，并且（d)评估所述受试者发生阿兹海默氏病的易感性。在某些方法中，所述 受试者具有认知缺损，并且步骤（d)包括使用步骤（c)的比较与所述受试者病症的其他症 状和/或征兆的组合来提供阿兹海默氏病的诊断。在某些方法中，所述受试者在进行所述 方法之前已被诊断为患有阿兹海默氏病，并且步骤（d)提供所述疾病阶段的指示。在某些 方法中，所述受试者正接受阿兹海默氏病的治疗或预防，并且步骤（d)提供所述受试者对 治疗的响应的指示。在某些方法中，所述方法每隔一段时间进行，并且步骤（C)中的比较随 时间的变化提供了对治疗的响应的指示。在某些方法中，所述受试者正用针对Αβ的免疫 疗法例如百平珠单抗治疗。
[0026] 某些方法还包括在进行步骤（a)和（b)之前，用针对百平珠单抗的抗独特型抗体、 任选地用JHlL 22G2处理所述样品。某些