外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及人类外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志 物及其应用；具体涉及人类血液exosome来源的Rab27A/B蛋白作为肝癌诊断和预后标志物 及其在制备诊断肝癌和判断肝癌预后试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌（HCC)是世界范围内前十名常见肿瘤，有非常高的死亡率，每年大约 有一百万人死于这种疾病。找到与原发性肝癌进展有关的肿瘤标志物，进而指导临床对肝 癌患者来说将有非常重要的意义。
[0003] exosome是多种细胞分泌的一种30-100nm大小的膜性囊状结构。肿瘤细胞较正 常细胞能分泌更多的exosome，分泌到细胞外的exosome携带有大量肿瘤特异的抗原蛋 白、抗原伴侣分子和核酸，通过exosome中的蛋白质和核酸促进肿瘤细胞之间信息交流， 产生旁路效应，促进肿瘤生长和转移。Rabinowits等发现肺癌病人外周血中exosome平 均蛋白浓度达到2.8511^/1111(95%(：1 1.94-3.76)，而非肿瘤病人只有0.7711^/1111(95%(：1 0.68-0. 86)，远远低于肺癌病人（P〈0. 001);从exosome蛋白浓度95%的区间来看，肺癌病 人和非肺癌病人的区间无重叠。因此，外周血中exosome蛋白浓度有可能作为肺癌诊断的 标志物。申请人所在课题组前期研宄也发现从卵巢癌腹水中分离得到的exosome含有大量 肿瘤-睾丸抗原和免疫分子，国内外学者利用exosome中的肿瘤抗原蛋白制作exosome亚 细胞瘤苗，在体外和动物实验以及部分人体实验都取得了好的效果。肿瘤分泌的exosome 较肿瘤细胞更易进入外周血，即使在脑胶母细胞肿瘤，纳米级的exosome也能透过致密的 血脑屏障进入外周血，并通过外周血exosome中EGFRvIII基因突变的检测来明确胶母细胞 肿瘤的诊断和治疗；此外，肿瘤细胞分泌exosome的能力较正常细胞更强，exosome中的核 酸和蛋白质受到双层脂质膜的保护不易被血中的蛋白酶和核酸酶降解；所有上述因素都是 利用外周血exosome作为肿瘤早期诊断的最佳理由。在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌，国外 学者利用外周血exosome中存在较高的肿瘤相关抗原蛋白来进行早期诊断。
[0004] Rab家族属Ras超家族的小GTP酶，目前有近70个家族成员，是参与囊泡融合及运 输相关的一类膜相关蛋白，参与细胞的分泌、胞吞、信号转导等，是细胞内外信息交流的重 要调控蛋白。1^匕274和1^匕278组成了1^匕27亚家族，并具有71%同源性。上述两种蛋白在 exosome运输（Trafficking)、与细胞膜对接（docking)、融合（fuse)和胞吐（exocytosis) 上所起作用最突出。Rab27A蛋白在肺癌、乳腺癌、脑胶质母细胞瘤的高表达与这些肿瘤侵袭 和转移等恶性生物学行为密切相关。但，有关Rab27B的研宄较少，Hendrix等的研宄表明： 人体胚胎各个器官细胞均无Rab27B表达，而成熟的器官各个细胞均有表达。申请人所在课 题组前期对正常肝组织、肝炎组织、肝硬化组织的、正常胃和大肠组织Rab27B蛋白表达进 行了检测，发现上述组织均存在Rab27B蛋白表达，然而，其对应的肿瘤组织却不同程度的 丢失。因此，Rab27B蛋白可能是一种与细胞分化相关的蛋白，由于肿瘤细胞的去分化而发 生丢失。
[0005] 目前，肝癌的诊断主要依赖于影像学上发现肝内肿物，包括超声、CT、核磁共振 (MRI)等，同时结合血清中的肿瘤标志物如AFP等。但是，这两种方法的敏感性及特异性都 不是十分令人满意。因此开发一种高敏感性和特异性的肝癌诊断方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种外周血exosome来源的肝 癌诊断和预后标志物，所述标志物是exosome来源的Rab27A和/或Rab27B。本发明提供的 标志物来源于人类外周血exosome，由于exosome具有选择性富集癌蛋白的作用，且受细胞 膜的保护，在细胞间隙和外周血中不易被降解，因此本发明的标志物用于肝癌的诊断和预 后敏感性更强。同时由于Rab27A和Rab27B在不同组织的表达模式存在明显的差异，反映 了其组织特异性，因此本发明的标志物用于肝癌的诊断和预后特异性更强。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物，所述标志物 是exsome来源的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白。Rab27A和Rab27B两蛋白在肝癌患者血 液exosome中表达相反的特点，将Rab27A/Rab27B比值作为肝癌早期诊断的指标比单独使 用一种蛋白作为诊断指标的诊断率更高。
[0009] 本发明还提供了上述标志物的检测试剂。所述试剂包括Rab27A蛋白的单克隆抗 体和/或Rab27B蛋白的单克隆抗体。优选地，所述Rab27A蛋白的单克隆抗体购自Abeam 公司，货号为ab55667 ;所述Rab27B蛋白的单克隆抗体购自ProteintechGroup，货号为 13412-1-AP。
[0010] 本发明还提供了上述标志物在制备诊断人类肝癌的试剂盒中的应用，所述试剂 盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。可选地，所述诊断试剂盒 还可包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血 exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的含量来判断受试者是否患有肝癌。
[0011] 作为一种可替代的实施方案，所述诊断试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和 Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判 断受试者是否患有肝癌。
[0012] 本发明还提供了上述标志物在制备判断肝癌预后的试剂盒中的应用，所述试剂 盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血 exosome来源的Rab27A蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。可选地，所述试剂盒还可包 括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血exosome 来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。
[0013] 作为一种可替代的实施方案，所述试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和 Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判 断肝癌患者的预后效果。
[0014] 本发明还提供了一种诊断人类肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单 克隆抗体和Rab27A蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋 白含量来判断受试者是否患有肝癌。可选地，所述试剂盒还可包括Rab27B蛋白的单克隆 抗体和Rab27B蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。
[0015] 作为一种可替代的实施方案，所述诊断试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和 Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判 断受试者是否患有肝癌。
[0016] 本发明还提供了一种判断肝癌患者预后的试剂盒，所述试剂盒包括Rab27A蛋白 的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A 蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。可选地，所述试剂盒还可包括Rab27B蛋白的单克隆 抗体和Rab27B蛋白标准品，该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白和 Rab27B蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。
[0017] 作为一种可替代的实施方案，所述试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和 Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判 断肝癌患者的预后效果。
[0018] 优选地，诊断试剂盒和判断预后试剂盒中Rab27A蛋白标准品和Rab27B蛋白标准 品购自北京义翘神州生物技术有限公司。
[0019] 优选地，本发明的诊断试剂盒和判断预后试剂盒还包括ELISA实验中常用的试 剂。
[0020] 本发明还提供了一种诊断人类肝癌的方法，所述方法的具体操作步骤如下：
[0021] (1)分离并纯化人类外周血中的exosome;
[0022] ⑵提取exosome中的蛋白；
[0023] (3)检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量；
[0024] (4)将步骤（3)获得的受试者的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量与大部 分正常人相应蛋白的含量相比，如果受试者Rab27A蛋白显著升高，则诊断受试者为肝癌患 者；如果Rab27B蛋白显著降低或无表达，则诊断受试者为肝癌患者。
[0025] 本发明还提供了一种判断肝癌患者预后的方法，所述方法的具体操作步骤如下：
[0026] (1)分离并纯化人类外周血中的exosome;
[0027] ⑵提取exosome中的蛋白；
[0028] (3)检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量；
[0029] (4)将步骤（3)获得的受试者的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量与大部分 正常人相应蛋白的含量相比，如果受试者Rab27A蛋白显著升高，则该肝癌患者的预后差； 如果Rab27B蛋白显著降低或无表达，则该肝癌患者的预后差。
[0030] 在本发明的具体实施方案中，分离并纯化人类外周血中的exosome的具体操作步 骤是：
[0031] (1)全血3000*g离心15min，移去细胞和细胞碎片；
[0032] (2)取上层液体移入离心管，加入适量Exoquick试剂，4°C下反应30min;优选 250u1血清中加入63u1Exoquick试剂；
[0033] (3) 1500*g离心混合液 30min(exosome沉于管下）；
[0034] (4)吸出上清，离心1500*g5min吸出所有上清（不能震动离心管）；
[0035] (5)用250y1PBS溶解全部沉淀，-20 °C保存。
[0036] 在本发明的具体实施方案中，采用德国ExoQick试剂盒提取exosome蛋白，具体操 作步骤参见试剂盒说明书。
[0037] 可以用于本发明以检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白含量的方法包括流式细胞 仪检测法、ELISA检测法、Westernblot法。
[0038] 使用流式细胞仪检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量的具体操作步骤是： 取