一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂 盒，尤其是检测乙型肝炎病毒突变（A1C和G1899A)的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是世界上第六大常见的恶性肿瘤，全球每年约有63万新发肝癌病例， 其中55%来自中国。肝癌预后极差，年死亡人数约为60万，在各类肿瘤死亡原因中排名第 三。乙肝相关肝癌的中位生存时间约为16个月，五年生存率介于15%_26%之间。目前肝癌 治疗手段主要有手术切除、肝移植及介入治疗，但术后复发率高，改善预后效果不明显。肝 癌预后差的主要原因是大多数患者就诊时已发展为肝癌中晚期，失去了最佳的治疗时期。 研究证明，早期诊断和治疗肝癌能够显著改善预后，患者五年生存率可达64. 8%。
[0003] 在中国，大多数肝癌发生于乙肝病毒感染导致的慢性肝炎及肝硬化基础上，缺乏 明显的早期症状及敏感的早期筛查手段是导致早期肝癌漏诊、误诊的主要原因。目前临床 诊断肝癌的金标准仍为活检病理，但由于其是有创性检查，且可能导致肝癌转移，故不能反 复进行。B超作为一种方便、低廉、无创的检查手段，诊断中晚期肝癌的敏感性、特异性及准 确度都较高，适合大规模人群筛查，但B超发现早期肝癌的能力有限，不易与肝硬化结节区 另IJ，而且很大程度上取决于肿瘤生长部位及检查者的经验，故限制了其在早期肝癌诊断中 的应用。普通CT因为扫描时间长、扫描层较厚且易受呼吸运动影响等，易出现假阳性或假 阴性。多层螺旋CT(MSCT)扫描速度快、层面薄，提高了小病灶的检出率，同时可清楚显示肝 癌的血供情况，但费用较昂贵，不适于大规模人群筛查。血管造影对小肝癌检出率高，但其 有创性及高费用限制了筛查价值。血清学检查因其快速、简便、费用低、无痛苦等优势而成 为大规模筛查的主要工具，现临床诊断肝癌主要依靠AFP (>400ng/ml)，其诊断乙肝后肝癌 的敏感性约为70-75%。由于AFP表达量与肝癌大小成正相关，故常难以检出早期微小肝癌。 AFP在急性肝炎、肝破裂、肝外伤及生殖系统肿瘤中均可升高，故其诊断特异性也不尽人意。 其他血清标志物如 Des-y-carboxy prothrombin (DCP)(异常凝血酶原）、a -L-Fucosidase (a-岩藻糖苷酶）以及Y-GT (Y谷氨酰转肽酶)等虽有一定的参考价值，但敏感性及特异 性均较低。因此，我们迫切需要找到一种新的高度敏感和特异的早期诊断标志。
[0004] 目前常用的突变检测方法为基因直接测序，但该方法费时、费力，敏感性低，达不 到早期快速诊断的目的。因而，需要一种快速检测的方法用于流行病学现场调查和实验室 快速检测。
[0005] 反向杂交线性探针（reverse hybridization line probe assay)技术具有特异 性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是针对靶基因的突变部位设定多个可能的探 针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行结果观察，简便实用，特异性高，灵敏 度强。反应在杂交炉内可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于基层单位及 现场快速检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供乙型肝炎病毒突变位点（A1C、G1899A)在制备肝癌早期诊断 试剂盒中的应用，并提供了一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒。
[0007] 本发明人发现，在乙型肝炎病毒特定的区域某些特定位点的突变与乙型肝炎病毒 阳性肝病，尤其是肝细胞癌的发生具有重要联系。本发明人通过研究发现，乙肝病毒BCP区 的G1899A和A1C突变能够很好的将HCC患者与非肝癌的乙肝患者区分开来，0R值分别高 达4. 44和15. 4,95%可信区间分别为2. 91-6. 76,6. 15-38. 56。因此，检测乙肝感染者的这 两个关键位点的联合突变，能够预测肝癌的发生，并对患者进行早期筛检和诊断。
[0008] 本发明的第一方面，是提供了一种乙型肝炎病毒突变位点在制备肝癌早期诊断试 剂盒中的应用，所述的乙型肝炎病毒突变位点是乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合突 变，具体是A1C的第一位碱基从A变成C，G1899A的第1899位碱基从G变成A。
[0009] 本发明的第二方面，是提供了一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂 盒，所述的乙肝病毒联合变异是指乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合发生突变，所述的 试剂盒的组成包括：
[0010] i.pcr引物 I、ii、iii、iv
[0011] 将P1和P2等量混合组成PCR引物I，为含G1899A位点区域巢式PCR第一轮引 物；
[0012] P3和P4等量混合组成PCR引物II，为G1899A位点区域巢式PCR第二轮引物；
[0013] P5和P6等量混合组成PCR引物III，为含A1C位点区域巢式PCR第一轮引物；
[0014] P7和P8等量混合组成PCR引物IV，为含A1C位点区域巢式PCR第二轮引物；
[0015] P1至P8序列如表1所示，其中P3和P7的5'端使用生物素标记；
[0016] 表1引物序列
【主权项】
1. 一种乙型肝炎病毒突变位点在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所 述的乙型肝炎病毒突变位点是乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合突变，其中A1C的第一 位碱基从A突变成C，G1899A的第1899位碱基从G突变成A。
2. -种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的乙肝病毒 联合变异是指乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合发生突变，所述的试剂盒的组成包括： (A) PCR引物I、II、III、IV 将P1和P2等量混合组成PCR引物I，为含G1899A位点区域巢式PCR第一轮引物； P3和P4等量混合组成PCR引物II，为G1899A位点区域巢式PCR第二轮引物； P5和P6等量混合组成PCR引物III，为含A1C位点区域巢式PCR第一轮引物； P7和P8等量混合组成PCR引物IV，为含A1C位点区域巢式PCR第二轮引物； P1至P8序列如表1所示，其中P3和P7的5'端使用生物素标记； 各引物序列如下： 编号引物序列
(B) 杂交膜 杂交膜上固定的探针序列如下：
(C) 预杂交液； (D) 杂交液； (E) 抗体； (F) 洗脱液I、II、III、IV; (g)缓冲液i、ii、iii; (H) 显色液； (I) 终止液。
3. 根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征 在于，所述的PCR引物I、II、III、IV中，P1至P8每一条引物的浓度为5yM;P1和P2等量混 合；P3和P4等量混合；P5和P6等量混合；P7和P8等量混合。
4. 根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征 在于，所述的杂交膜，各探针的浓度为5mmol/L，用量为4iU。
5. 根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征 在于，将各探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上，40yl反应体系如下：
6. 根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征 在于，所述的洗脱液I、II、III、IV如下： 20XSSC 3mmol/LNacl 0? 3mol/L柠檬酸三钠 洗脱液I:6XSSC，0.5%SDS; 洗脱液II:5XSSC，0. 1%SDS ; 洗脱液III:1XSSC，0. 1%SDS ; 洗脱液IV :0? 1XSSC，0. 1%SDS。
7. 根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征 在于，所述的预杂交液如下：5XSSC，0.5%TritonX100 ; 所述的缓冲液 I 如下：〇? 15mol/LNacl，100mmol/L Tris, pH7. 5； 所述的缓冲液II如下：〇. 15mol/L Nacl，0. lmol/L Tris，3%牛血清白蛋白，pH7. 5 ; 所述的缓冲液III如下：0.1mol/LNacl，0.1mol/L!'1^8,3%牛血清白蛋白，5〇1111]1〇1/1^Mgcl2,pH9. 5 ； 所述的抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体； 所述的显色液：NBT/BCIP混合显色液； 所述的终止液：〇. 2mmol/L EDTA。
8. -种利用如权利要求1所述的试剂盒检测乙肝病毒联合变异的检测方法，其特征在 于，该检测方法包括下列步骤： (A) 提取乙肝病毒DNA，使用引物I和II分别进行巢式PCR扩增； (B) 将杂交膜放入100ml洗脱液I中，68°C漂洗30min ; (C) 68°C加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动； (D) 将扩增的PCR产物煮沸lOmin，冰浴5min，使DNA变性； (E) 将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与杂交膜68°C杂交120min; (F) 用50ml洗脱液II于68°C漂洗2次，每次漂洗时间5min; (G) 用50ml洗脱液III于37°C漂洗2次，每次漂洗时间5min; (H) 用50ml洗脱液IV于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min; (I) 缓冲液II中42°C封闭40min; (J) lOmin缓冲液I中加入抗体10iU，37°C摇床上摇动30min; 00缓冲液I中室温漂洗2次，每次15min; (L) 缓冲液III中室温漂洗2次，每次15min; (M) 10ml缓冲液III中加入0.lml显色液，避光显色10~30min; (N) 最后用终止液终止反应； (〇)结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性。
【专利摘要】本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，尤其是检测乙型肝炎病毒突变（A1C和G1899A）的试剂盒。本发明人通过研究发现，乙肝病毒BCP区的G1899A和A1C突变能够很好的将HCC患者与非肝癌的乙肝患者区分开来，OR值分别高达4.44和15.4，95%可信区间分别为2.91-6.76，6.15-38.56。因此，检测乙肝感染者的这两个关键位点的联合突变，能够预测肝癌的发生，并对患者进行早期筛检和诊断。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70
【公开号】CN104694666
【申请号】CN201310669456
【发明人】曹广文, 殷建华, 蒲蕊, 张琪, 张宏伟
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月10日