一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前s区变异的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂 盒，尤其是一种检测进展性肝病相关乙肝病毒pres变异的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 全世界有约超过30亿人感染乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒突变是乙型肝炎病毒 阳性肝病(包括乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌）的重要危险因素之一，随着感染的持 续，肝脏疾病在从乙型病毒性肝炎向肝硬化和肝癌的发展过程中，病毒的突变率逐渐增加。
[0003]乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)属嗜肝病毒科（hepadnaviridae)中正 类嗜肝病毒属（〇rthohepadnavirus)，HBV DNA有不完全的环状双链DNA组成，长的为负链， 短的为正链，负链约含3200碱基（bp)，正链的长度可变，相当于负链的50%~80%，HBV基因 组中包含4个开放读码框（open reading frame, 0RF)，均位于负链，分别是S区、C区、P区 和X区，其中S区又分为前S1、前S2和S三个编码区，分别编码preSl、preS2和HBsAg蛋 白，C区又可分为前C区（precore)和核心区（core),分别编码HBeAg和HBcAg。根据基因 差异率超过8%，可将乙型肝炎病毒分为A-H八个基因型。感染乙型肝炎病毒可引起急慢性 乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。中国是乙肝流行的高发区之一，中国第三次乙型肝炎 血清流行病学调查显示中国平均感染率为7.8%，每年有超过20万人罹患肝癌死亡。肝脏细 胞持续受到损害，会导致肝脏细胞坏死，最终导致肝硬化及肝癌的发生。因此，研究快速、准 确检测肝脏持续感染状态的方法对于降低肝脏损伤，降低肝硬化和肝癌的发生具有重要意 义。目前通常把慢性乙肝、肝硬化和肝癌统称为进展性肝病。
[0004]目前常用的检测乙肝病毒进展性肝病的方法主要是检测血液中的丙氨酸氨基转 移酶（ALT)。作为肝脏损伤的最敏感的指标之一，ALT的升高说明肝脏炎症的存在。但是， ALT的升高可能是由多种原因导致的，比如急性和慢性病毒性肝炎、饮酒和药物引起的肝脏 损伤、肝内外胆汁淤积等等，尚待做进一步的检查才能明确ALT升高的原因。因此，急需一 种快速、准确的检测方法，用于说明炎症的持续存在是由于乙型肝炎病毒阳性肝病患者的 乙肝病毒的复制、变异导致的。
[0005] 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR)技术具有快速、成本低、 灵敏度高等优点，针对突变部位设定相应的特定引物，利用引物和模板的特异性结合，然后 通过琼脂糖凝胶的方法，鉴定目的条带。适用于基层及现场的快速、准确检测。
[0006] 因此临床急需检测进展性肝病(检测肝脏炎症持续存在）的试剂盒。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供乙型肝炎病毒前S区变异位点在制备检测进展性肝病试剂 盒中的应用，并提供了一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒。
[0008] 在乙型肝炎病毒特定的区域，如preS区的某些特定位点的突变与乙型肝炎病 毒阳性肝病，尤其是肝细胞癌的发生具有重要联系。在preS区中，一些重要的突变如 A31T, T49A, A52C, G105C, C109A, A135C 和 G147C 的突变频率在 ASCs 中非常的低（HBV B 型 中0. 0%，C型中0. 0%-4. 2%)，但是在慢性乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者中突变频率接近 100% (HBV B型中92. 3-100. 0%，C型中89. 7%-100. 0%)。这些重要的突变能够在急性感染 后的ASC状态下被选择出来，并且在后续的HBV进化过程中持续保持。在检测中发现这些 突变，能够很好的将无症状携带者与慢性活动性乙肝、肝硬化和肝癌患者区分开来，说明肝 脏炎症持续存在，肝脏细胞持续受到损伤，具有重要临床意义。
[0009] 本发明的第一方面，是提供乙型肝炎病毒前S区变异位点在制备检测进 展性肝病试剂盒中的应用，所述的乙型肝炎病毒前S区（preS区）变异位点是指 A31T,T49A, A52C, G105C, C109A, A135C 和 G147C。
[0010] 所述的检测进展性肝病是指检测肝脏炎症持续存在。
[0011] 所述的乙型肝炎病毒前S区变异位点的序列如下：
【主权项】
1. 一种乙型肝炎病毒前S区变异位点在制备检测进展性肝病试剂盒中的应用，其特征 在于，所述的乙型肝炎病毒前S区变异位点是指A31T，T49A，A52C，G105C，C109A，A135C和 G147C。
2. -种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的 组成包括： (A)PCR引物I、II、III 将Pl和P2等量混合成PCR引物I，为检测A31T、T49A、A52C位点PCR引物； 将P3和P4等量混合成PCR引物II，为检测G105C、C109A位点PCR引物； 将P5和P6等量混合成PCR引物III，为A135C、G147C位点PCR引物； 引物序列如下所示： 编号引物序列 PlGATCCCAGAGTCAGGGCCCTATAC(SEQIDNO:3) P2GTCAACAAGAAAAACCCCGCCTG(SEQIDNO:4) P3TGCTCAGAATACTGCCTCA(SEQIDNO:5) P4CAGCGATAACCAGGACAAA(SEQIDNO:6) P5AGGACTGGGGACCCTGC(SEQIDNO:7) P6AGGATGATGGGATGGGAATA(SEQIDNO:8) (B) DNA聚合酶； (C) Buffer缓冲液； (D) dNTP混合液； (E) 无酶水； (F) 琼脂糖凝胶； (G) EB溶液； (H) 上样缓冲液； (I) TBE缓冲液。
3. 根据权利要求2所述的一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒，其 特征在于，所述的PCR引物I、IIJII中，Pl至P6每一条引物的浓度为5iiM;Pl和P2等量 混合；P3和P4等量混合；P5和P6等量混合。
4. 根据权利要求2所述的一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒，其 特征在于，该试剂盒还包括一个阴性对照，所述的阴性对照为如SEQIDNO: 1所示的野生型 序列。
5. 根据权利要求2所述的一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒，其 特征在于，所述的琼脂糖凝胶的配制如下： (a) 称取1克琼脂糖，置于干净的三角瓶中，加入100mLlXTBE缓冲液，在微波炉中加 热，使之彻底融化，之后，加入5ulEB储备液混合，终浓度0. 5mg/ml，即制成1 %的琼脂糖溶 液； (b) 准备凝胶模具，在模具的一端放上样品梳，距底板0. 5-lmm，以便加入琼脂糖后形成 完好的加样孔； (c) 将上述琼脂糖溶液放在室温下，待温度下降至60°C时，倒在凝胶模具上，室温放置 0. 5-1小时，待琼脂糖彻底凝固后，轻轻拔出样品梳。
6. 根据权利要求2所述的一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒，其 特征在于，所述的上样缓冲液：〇. 25%溴酚蓝，0. 25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液； 所述的TBE缓冲液：54gTris，27. 5g硼酸，20ml0. 5mol/LEDTA，PH8. 0。
7. -种利用如权利要求2所述的检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒进 行检测的方法，该方法包括下列步骤： (A)提取乙肝病毒DNA，使用引物I、II、111分别进行巢式PCR扩增； (B)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 (C)结果判定：出现特异性条带，说明突变位点存在。没有条带，则没有发生突变。
【专利摘要】本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测进展性肝病相关乙肝病毒preS变异的试剂盒。本发明的检测进展性肝病的试剂盒，是检测乙型肝炎病毒前S区（preS区）的变异位点，具体是指A31T,T49A,A52C,G105C,C109A,A135C和G147C。本发明的试剂盒简便实用，特异性高，灵敏度强。
【IPC分类】C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104694665
【申请号】CN201310666272
【发明人】曹广文, 殷建华, 蒲蕊, 张琪, 张宏伟
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月10日