专利名称：：通过定量p的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用定量P97来诊断和监测阿尔茨海默氏病的方法。阿尔茨海默氏病(AD)是一种影响认知、行为和功能的神经退化性疾病。最近的一个研究表明，AD可影响大约7％的75岁的人，85岁的则超过25％[加拿大健康与衰老研究工作组，Can.Med.Assoc.150.899-913(1994)]。其它的研究表明老年人中AD的发生率甚至更高[Evans，D.A.J.Am.Med.Assoc.262，2551-2559(1989)]。目前，对AD只有非常有限的治疗选择，仅有的定性诊断方法是大脑剖检。AD的特征是大脑中有各种各样的病理标记，这些标记包括主要含β淀粉样蛋白(Aβ)的老年斑、带有高磷酸化微管相关Tau蛋白的神经原纤维结[Goedert，M.，Spillantini，etal.，Neuron8，156-160(1992)和Selkoe，D.J.Neuron6，487-498(1991)]、神经元细胞死亡和突触连接丧失[Terry，R.D.，etal.Ann.Neurology30，572-580(1991)]。据报道Aβ蛋白的异常沉淀导致大脑中认知记忆区域中的神经元细胞死亡[Blass，J.P.Neurology，43，S25-38(1993)；和Price，D.L.Ann.Rev.Neurosci.9，489-512(1986)]。临床上AD的诊断是通过神经和神经病理评价来完成的，遗憾的是在疾病的早期它不能检测出来。一致的临床诊断标准，如NINCDS-ADRDA已经使临床病理诊断的准确性提高到80％以上[McKhann，G.，etal.Neurology34，939-944(1984)]。一些试图证明脑脊液(CSF)中某些蛋白质的水平与AD有关的试验只取得了有限的成功。例如，用于检测CSF中Aβ的试验表明，尽管早年发生AD的病人与晚年对照组相比，Aβ水平有轻微的升高[Nakamura，T.，etal.Ann.Neurol.36，903-911(1994)]，AD病人中总的Aβ水平与对照组相比没有显著差异[Shoji，M.etal.Science258，126-129(1992)]。但也有试验显示，在AD病人脑组织中蔓延到位置42的Aβ，Aβ1-42在扩散和老年淀粉样斑块中都占优势[Roher，A.，etal.J.Biol.Chem.268，3072-3083(1993)]，而AD病人CSF中的Aβ1-42比对照组显著降低[Motter，R.，etal.Ann.Neurol.38，643-648(1995)]。在对可转化为Aβ的淀粉样前体蛋白(APP)的分泌型的研究中发现，AD病人CSF中可溶性的APP比对照组明显降低[VanNostrand，W.E.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，2551-2555(1992)]。而其它的研究仅显示APP有轻微的降低[Palmeit，M.R.，etal.Neurol.40，1028-1034(1990)]甚至升高[Kitaguchi，N.，etal.Biochem.Biophys.Res.Comm.166，1453-1459(1990)]。用于监测CSF中Tau蛋白的试验显示，尽管与对照组相比，AD病人的平均Tau水平升高，但与正常对照组[Motter，R.etal.Ann.Neurol.38，643-648(1995)Vigo-Pelfrey，C.etal.Neurology45，788-793(1995)]和患有其它神经疾病对照组[Vandermeeren，M.，etal.J.Neurochem.61，1828-1834(1993)]也有相当程度的重叠。由于相互矛盾的结果和AD病人与对照组之间的结果重叠，其它的CSF诊断指标已被否认，例如与老年斑有关的αI-抗糜蛋白酶[Abraham，C.R.，Selkoe，D.J.&Potter，H.Cell.52，487-501(1988)]和遍在蛋白[Wang，G.P.，etal.ActaNeuropathol(Bert)82，6-12(1991)]。不但这些结果令人失望，而且通常用于病人诊断的样品CSF也不能很好地得到。但是，商业性的诊断试验已经由AthenaNeuroscienceInc.开发，它用位于人染色体19上的阿朴脂蛋白E(ApoE)E4等位基因频率来检测CSF中Tau蛋白和Aβ1-42的水平。现已有实验证实，ApoE与老年斑有关，ApoEE4为纯合子的人更有可能发展为AD病人[Sanders，A.M.，etal.Neurol.43，1467-1472(1993)]。据文献报道，这种联合分析能帮助医生判定病人患有AD病的可能性[Motter，R.，etal.Ann.Neurol.38，643-648(1995)]。但是，这种试验费时而且只是提供一个可能的答案。最近一个研究瞳孔反应的报告显示，AD病人对乙酰胆碱阻滞剂托吡卡胺的稀溶液呈现高敏感性[Scinto，L.F.etal.Science266，1051-1054(1994)]。这种高敏感性首先在Down′s综合征病人中发现，这种病人总是在中年发展为与AD病人非常相似的神经病理[Olson，M.I.和Shaw.C.M.Brain92，147-156(1969)]。尽管该研究似乎给人以希望，但其结果不易被重复，并存在重叠和解释上的一些困难，如眼疾病或眼颜色对试验可能存在的影响[Loupe，D.N.etal.Opthalmology103，495-503(1996)]。最新文献[Parshad，R，etal.Proc.Natl，Acad.Sci.USA93，5246-5150(1996)]描述了一种方法，即通过检测修复DNA损伤能力的缺陷来鉴定AD细胞。该试验在支持或表示病人不是AD的诊断方面证明是有用的。但是，该试验还远未达到临床应用的水平，因为它费力而且需要多个培养细胞的步骤。最后，有研究已经显示用正电子发射X线断层照相技术有可能检测AD病人脑中葡萄糖代谢的变化[Reiman，E.M.，N.Engl，J.Med.334，752-758(1996)]。该试验不适用于常规应用。人们已经对AD的遗传病因有着相当的兴趣，现已证明，几个基因的突变使人易患少数几种家族性AD。染色体21上的APP基因突变[Murrell，J.，etal，Science254，97-99(1991)]和Karlinsky，H.Neurology，42，1445-1449(1992)]与常染色体显性、早年(＜65岁)的AD有关，早老基因(Presenilins)，例如与染色体14相连的S182[Schellenberg，G.D.etal.Science258，668-671(1992)；VanBroeckhoven，C.etal.NatureGenet2335-339(1992)和Sherrington，r.etal.Nature375，754-760(1995)]和与染色体1相联的STM2的突变[Levy-Lahad，E.，etal，Science269，973-977(1995)和Rogaev，E.I.，etal.Nature376，755-778(1995)]与少数家族性AD有关。另外，在染色体19上发现的ApoE的E4等位基因可改变发展为晚年发作型AD的危险性[Sanders，A.M.，etal.Neurol.43，1467-1472(1993)和Rogaev，E.I.，etal.Nature376，775-778(1995)]。这些基因的发现在判定少数病人发展为AD的素因方面将具有相当的价值，但遗传学评估不适用于检测或者监测AD。P97抗原，又称为黑转铁蛋白，与AD有关(PCT/CA93/00272，1994年1月20日公开，公开号为W094/01463)。P97属于铁结合蛋白中非常重要的一组，这组铁结合蛋白包括血清转铁蛋白(Tf)、乳铁蛋白和来自鸟蛋白的卵转铁蛋白[Baker，E.N.，Rumball，etal，TrendsBiochem，Sci.12，350-353(1987)]。P97能与铁结合，参与细胞铁摄取过程[Kennard，M.L.，etal.EMBOJ.14，4178-4186(1995)]。P97有两种类型一种是通过糖基-磷脂酰肌醇锚状物吸附在细胞表面上，另一种是主动分泌型[Food，M.R.etal.J.Biol.Chem.269，3034-3040(1994)]。最近一个研究发现，P97和转铁蛋白受体(TR)高度集中于人脑毛细管内皮。而转铁蛋白(Tf)本身主要集中于神经胶质细胞中[Rothenbergers，S.etal.BrainRes.712，117-121(1996)]。还有实验表明，在AD病人死后脑组织中，P97在与淀粉样斑有关的反应性小神经胶质细胞上有特异性表达[Jefferies，W.A.etal.BrainRes.712，122-126(1996)]。其它与老年AD斑无关的小神经胶质细胞以及患其它神经病理疾病(帕金森氏病，进行性核上麻痹、亨迁顿病和肌萎缩性侧索硬化)的脑组织的小神经胶质细胞均不能表达可检测水平的P97。本发明的发明人特别说明，跟健康的个体相比，可溶性铁结合蛋白，P97在阿尔茨海默氏病人的血清和脑脊液(CSF)中显著升高。来自阿尔茨海默氏病人样品中的P97的量经常比来自健康个体样品中的高。本发明的发明人还特别说明，随着病程的延长，血清中P97的水平升高。另外，在可观察到AD症状的大概两年前，P97的水平开始升高。这种特殊的P97定量能鉴别患有AD的病人，用于监测疾病的发作和纵向进展。作为上述发现的结果，本发明的发明人设计了一个简单和可靠的在体液中检测AD的试验，该试验在AD病的评估和处理方面都很有价值。利用本发明进行AD的早期诊断可以给家庭更多的时间来计划正确照顾阿尔茨海默氏病人，减少出现类似阿尔茨海默氏病病状如抑郁或中风的可能性。本发明的方法能用于有效治疗AD的新策略。尽管已开发许多用于治疗AD的药物，但没有一种便宜而又快速的用于研究这些药力效果的方法。现在临床上用于测定药物效力的试验是复杂、劳动量大的神经行为评估。概括地说，本发明涉及一种通过定量病人体液样品中的P97来诊断阿尔茨海默氏病的方法，它包括以下步骤a)从怀疑患有阿尔茨海默氏病的人体中获取体液样品，从而得到试验样品；b)测定试验样品中P97的量；c)比较试验样品和对照样品中P97的量。其中，试验样品中P97的量比对照样品中的高表示可能患有阿尔茨海默氏病。本发明还涉及一种通过定量患有阿尔茨海默氏病人体液样品中的P97来监测该病进展的方法，它包括以下步骤a)从阿尔茨海默氏病人中获取体液样品，从而得到试验样品；b)测定试验样品中P97的量；c)比较试验样品和以前获得的第一个试验样品中P97的量。其中，试验样品中P97的量比第一个试验样品中的高表示病人的阿尔茨海默氏病情在进展。本发明进一步涉及一种通过定量阿尔茨海默氏病人体液样品中的P97来监测阿尔茨海默氏病治疗的方法，包括以下步骤a)从已接受治疗的阿尔茨海默氏病人获取体液样品，从而得到试验样品；b)测定试验样品中的P97的量；c)比较试验样品和治疗前从病人中获得的体液样品中P97的量。其中，试验样品中与治疗前样品中P97量的差异表示治疗的效果。本发明还进一步涉及用于完成本发明方法的试剂盒，它包括检测试验样品中P97存在的试剂、检测P97存在的所有试剂和用于完成本发明方法的合适的支持用品。参照下面的详细描述和附图，本发明的上述各特征及其它特征将很清楚。另外，本发明中引用的专利文献及出版物全部合并于此作为参考。图1为P97标准品的标准曲线；图2是基于年龄的阿尔茨海默氏病人与对照组的血清P97水平的比较；图3是基于病程的阿尔茨海默氏病人与对照组的血清P97水平的比较；图4是基于年龄的阿尔茨海默氏病人与对照组的血清中转铁蛋白水平的比较；图5是不同年龄的阿尔茨海默氏病人与对照组之间血清P97浓度的比较；图6表示从病人首次被观察到AD症状起，AD病人血清P97浓度随时间的变化；图7表示不同年龄阿尔茨海默氏病人与对照之间血清转铁蛋白的比较；图8表示AD病人与其配偶之间血清P97浓度的比率。本发明提供了通过定量病人体液样品中的P97来监测和诊断阿尔茨海默氏病人的方法。该方法涉及从病人获得体液样品。“病人”一词指患有阿尔茨海默氏病或者被怀疑患阿尔茨海默氏病的温血动物如哺乳动物，优选人。病人可以存在或不存在认知损害，病人也可以正在接受AD的治疗。总之，本发明的诊断方法用于判定一个没有表现出任何AD症状的个体是否具有发展为AD的因素或者是否有可能发展为AD。试验样品可以从多种体液中获得，例如血清、淋巴液、胆汁、唾液或脑脊液。细胞样品也可以被用作试验样品，如血细胞，优选单核细胞。特别地，表达P97的激活巨噬细胞可被测定。优选的是，试验样品从血清或CSF中获得，最优选为血清。试验样品可以用已知技术获得。在一个特别优选的实施例中，血清样品来自病人。样品在使用前可冻藏(例如在-80℃)，经纯化和(或)经稀释后使用，例如在Pandex缓冲液DMEM(含有0.1％NaN3和1.0％BSA)稀释的50％v/v胎牛血清(FCA)。试验样品中的P97用允许在试验样品中定量P97的试剂进行定量。优选的是能辨认和结合试验样品中P97的试剂。在本发明的一实施例中，该试剂为一种抗体。这里使用的“抗体”一词包括多克隆抗体和单克隆抗体、与P97能反应的多种抗体的混合物(例如，与P97能反应的不同类型单克隆抗体的混合物)、整个抗体、足以与P97结合的抗体生物学功能片段、包括来自不同种属的抗体的融合抗体、双功能抗体以及四聚抗体。这些抗体可以用常规方法制备。例如，用标准方法通过用P97肽可以制备多克隆抗血清或单克隆抗体。用能激发哺乳动物抗体反应的具有免疫原性的肽使哺乳动物(例如小鼠、仓鼠和兔)产生免疫。使肽具有免疫原性的技术包括载体结合或其它本
技术领域：
熟知的技术。例如，肽可以与佐剂一起给予。免疫反应过程可以通过测定血浆或血清中抗体的效价进行监测。以免疫原为抗原，标准的ELISA或其它的免疫分析方法可用于测定抗体水平。免疫之后，可获得抗血清，需要时，可从血清中分离出多克隆抗体。单克隆抗体的制备，从经免疫的动物中富集抗体产生细胞(淋巴细胞)，然后用标准体细胞融合方法使之与骨髓瘤细胞融合，不断增殖这些细胞，可产生杂交瘤细胞。这些技术都是本
技术领域：
中熟知的技术(例如杂交瘤技术最初由Kohler和Milstein建立(Nature256，495-497(1975))以及其它技术例如人B淋巴细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today4，72(1983))、制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，MonoclonalAntibodiesinCancerTherapy(1985)AllenR.Bliss，Inc，77-96)和组合抗体库的筛选(Huse等，Science246，1275(1989))。杂交瘤细胞可以用免疫化学方法筛选，用于制备与P97特异反应的抗体，从而分离出单克隆抗体。另外，由Genpharm建立的模型即SCID-hu小鼠，可用于制备抗体，或与p97反应的抗体片段。抗体还可以从各种来源得到，包括实验室和保藏机构，如美国典型培养物保藏中心。例如，抗P97小鼠单克隆抗体，HybC(33B6E4)可以从Shuen-KueiLiao博士(McMasterUniversity，Hamilton，ON)得到；抗P97单克隆抗体9B6可以从加拿大，BC，UBC生物技术实验室得到；抗P97小鼠单克隆抗体L-235可以从美国典型培养物保藏中心得到[ATCC-HB8446L235(H-19)]。能识别和结合试验样品中的P97并且定量时可以在样品中存在的各种其它试剂可用于本发明的方法中。例如，转铁蛋白受体能与P97结合，可用于定量试验样品中的P97。另外，P97可与铁及其它金属结合，用标准方法可用于定量试验样品中的P97(参见PCT/CA93/00272，1994年1月20日公开，公开号为W094/01463，该文献描述了铁结合的测定)。本发明的方法中使用的试剂可用能检测的物质进行显示性标记，或者随后作显示性的标记。能检测的物质包括各种酶、荧光物质、发光物质和放射性物质。适用的酶包括辣根过氧化物酶、生物素、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适用的荧光物质包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、硫氰酸、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质有氨基苯二酰一肼；适用的放射性物质包括放射性I125、I131或氚。本发明的方法中使用的试剂也可随后作显示性标记，例如用能识别和结合该试剂的物质进行标记。举例来说，如果试剂为一抗体(如小鼠IgG抗体)，用本发明中描述的显示性物质标记的与该试剂反应的第二抗体(例如羊抗鼠γ球蛋白)可用于检测该试剂，从而可用于P97的定量。在已知的免疫测定方法中，抗体试剂可用于检测和定量P97，这些免疫测定方法是依靠P97抗原决定簇和抗体之间相互结合作用进行的。例如放射免疫测定法、酶免疫测定法(如ELISA)、免疫荧光法、免疫沉淀反应、乳汁凝聚试验、血细胞凝聚、逆流免疫电泳(CIEP)、放射免疫沉淀、DotBlot测定、抑制或竟争测定和夹层测定。在一优选实施例中，基于快速免疫荧光技术的一种测定方法[如Solley等在1984“粒子浓度荧光免疫测定”(PCFIA)，J.Immunol，Meth.，67，21-35中描述的]可用于定量或测定样品中P97的水平。该方法使用了与亚微粒聚苯乙烯珠结合的捕获抗体(Ab)。这种“被激活的”固定相用作目的蛋白质的特异吸附剂。对该蛋白质也有特异性的荧光标记的第二抗体与固定捕获相结合形成混合物，该混合物的荧光信号与蛋白质的浓度成比例。反应可在特别设计的96孔板(分类22-400-1；IdexxLaboratoriesInc.，Wesbrook，ME)上进行。每个孔装有一张0.22μm的醋酸纤维素膜，它允许孔中的液体在真空下被吸出，从而浓缩孔底的荧光混合物。冲洗板后，用Pandex荧光浓度分析仪(FCA；Idexx)对每个孔进行荧光读数。测定中使用的活化珠可为用抗P97抗体包被的羧酸聚苯乙烯粒子(0.77μm，0.25％V/V；Idexx)。适用的抗P97抗体包括抗P97小鼠单克隆抗体，HybC(33B6E4；Dr.Shuen-KueiLiao，McMasterUniversity，Hamilton，ON)，9B6(Dr.WilfJefferies，BiotechnologyLaboratory，UBC，BC)，或者抗P97兔抗血清(Dr.WilfJefferies，BiotechnologyLaboratory，UBC，BC)。荧光标记的第二抗体可为抗P97小鼠单克隆抗体，L235(AT′CC-HB8446L235(II-19)或抗P97兔抗血清(Dr.WilfJefferies，BiotechnologyLaboratory，UBC，BC)，然后用异硫氰酸荧光素(FITC)使其荧光化。P97标准品可用P97来制备，例如，用免疫亲和层析法从磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)处理的转染过人P97的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的上清液中纯化制备。在一特别优选的实施例中，血清P97测定可在一特制的96孔板上(22-401-1；Idexx)进行，然后用FCA(Idexx)进行荧光读数。血清样品用50％FCA溶液适当释释后，96孔板上每孔加60μl血清样品。P97标准品用于制备标准曲线。样品标准曲线的制备表示在表1中，其标准曲线显示在图1中。本发明的发明人已发现，在可观察到阿尔茨海默氏病症状的大约前2年，P97水平开始升高。因此，本发明的方法可用于诊断没有明显的阿尔茨海默氏病临床症状的病人是否患有阿尔茨海默氏病，或者是否有可能发展为阿尔茨海默氏病，从而为该病提供早期预后。诊断阿尔茨海默氏病时，可把病人样品中P97的浓度与来自健康人样品中P97的浓度范围作比较，这个浓度范围可通过前瞻性和(或)回顾性的统计研究建立。健康人可基于NINCDS-ADRDA标准和(或)MMS试验结果加以选择。优选的是，健康病人没有明显的临床意义上的认识障碍或者其它临床或病理疾病。也可以通过发现同一病人P97水平比以前定量的水平高作出诊断。与对照组相比，试验样品中P97水平升高表示病人患有阿尔茨海默氏病，或有可能发展为阿尔茨海默氏病。举例说明，测定有代表性数量的对照人血清中P97水平，计算其平均值，或者用P97水平对年龄如图5所示作图，建立对照人的回归直线基线(……图5)。试验样品中含有的P97水平高于平均值或基线的表示有阿尔茨海默氏病或有阿尔茨海默氏病的可能。总之，病人样品中的P97的水平比对照人血清中P97的水平高1.5倍或者更高，特别是2倍或者更高，优选2到9倍时，表示有可能患有阿尔茨海默氏病。现已发现，血清中P97的水平随着疾病的进展而升高(参见图3和图6)。因此，可把病人样品中的P97水平与同一病人以前样品中的P97水平作比较来监测阿尔茨海默氏病的进展。阿尔茨海默氏病的进展及评价也可通过比较试验样品中的P97水平和对照样品中或其它患阿尔茨海默氏病人样品中P97的水平来进行。这里的后一种比较是基于体液样品中P97的水平与病程进展之间的线性关系。举例说明，病人的病程可以通过定量病人样品中P97的水平并从标准曲线(例如，如图6所示的图)上外推进行判定。本发明的方法还可以用于监测或评价阿尔茨海默氏病的治疗效果。在治疗前、治疗期间和/或治疗后提取样品，然后根据该治疗对样品中P97浓度的影响来判定治疗的效果。一种有效的治疗将使病人样品中P97的水平比对照样品中的低。我们已注意到，本发明的方法可用于监测对阿尔茨海默氏病的任何治疗方法的效果，特别是监测那些被推测对阿尔茨海默氏病有治疗效果的药物组合物的效果。这些对阿尔茨海默氏病有一定治疗效果的药物组合物包括那些可恢复胆碱能功能的物质，例如，他克林、卵磷脂、石杉碱A和B、加兰他敏、甲基磺酰氟、麦扁豆碱和地波尼(deprenyl)。适用于本发明定量P97方法的试剂可包装成使用方便的试剂盒，盒中提供用合适容器装好的必备物质。例如，这种试剂盒可包括与P97反应的抗体、和用本发明中描述的方法来定量与样品中P97结合的抗体的必备试剂。该试剂盒还包括用于实施本发明方法的合适支持物。下面的实施例描述了本发明的发明人定量患阿尔该默氏病病人的样品和对照组样品中P97的方法及其意义。所提供的实施例是用来说明而不是限制本发明。实施例1阿尔茨海默氏病人血清中P97水平研究人血清中P97水平的测定方法是基于1984年介绍的一种快速免疫荧光技术，“粒子浓度荧光免疫测定”(PCFIA)而建立起来的(Jolley等，1984，J.Immunol.Meth.，67，21-35)。该方法使用了与亚微粒聚苯乙烯珠结合的捕获抗体。这种“激活的”固定相用作目的蛋白质的特异吸附剂。然后，对蛋白质也具有特异性的荧光标记的第二抗体与固定捕获相结合，形成一个混合物，该混合物的荧光信号与蛋白质的浓度成比例。反应在特殊设计的96孔板(分类22-400-1；IdexxLaboratorlesInc.Wesbrook，ME)上进行。每个孔含有一张0.22μm的醋酸纤维膜，它允许孔里的液体在真空下被吸出，从而浓缩孔底的荧光混合物。冲洗反应板，然后用Pandex荧光浓度分析仪(FCA；Idexx)在不同的波长对每个孔进行荧光读数。测定方法中使用的活化珠是用下面的抗体包被羧酸聚苯乙烯粒子(0.77μm，0.25％V/V；Idexx)制成的，这些抗体是抗P97小鼠单克隆抗体，HybC(33B6E4；Dr.Shuen-KueiLiao，McMasterUniversity，Hamilton，ON)或者9B6(Dr.WilfJefferies，BiotechnologyLaboratory，UBC，BC)或者抗P97兔抗血清(Dr.WilfJefferies，BiotechnologyLaboratory，UBC，BC)。1mL粒子(经混旋和声处理后)进行离心，然后用8毫升0.1M，PH4.5的MES[2(4-吗啉代)乙磺酸]缓冲液重新悬浮。加入5.0毫克EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺]后，再加入1毫升抗体(1mg/mL)。混合物定期混旋，室温下孵育过夜，然后6000rpm离心10分钟(SorvalHB4)，用20mL含0.2％叠氮钠(NaN3)和2％W/V牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮微珠。6000rpm离心10分钟，被包被的微珠4℃保存于32毫升含0.2％NaN3和2％BSA的PBS中(抗体的浓度为25μg/mL)。荧光标记的第二抗体是用抗P97小鼠单克隆抗体、L235(ATTC-HB8446L235(H-19))或抗P97兔抗血清(Dr.WilfJefferies，BiotechnologyLaboratory，UBC，BC)通过下述异硫氰酸荧光素(FITC)荧光化后制成的。往PH9.5磷酸盐缓冲液(0.15MNa2HPO4)加入FITC使浓度达到1mg/mL。无叠氮化物存在时，往FITC溶液(0.15mL浓度为1mg/mL的FITC溶液)中加入0.5mL浓度为4mg/mL的抗体。在室温下避光孵育过夜。荧光化的Ab在4℃贮存备用。P97标准品是用免疫亲和层析法从磷脂酰肌醇磷酸脂酶C(PI-PLC)处理的转染过人P97的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的上清液中纯化制备的。用1mL内含PI-PLC(300mU/mL)的PBS处理109转染过的CHO细胞，离心、回收细胞上清液，然后用0.2μm的膜过滤。上清液上样于抗体(Hybc)免疫的Affi-Gel10(Bio-Red，MississaugaONT)抗体柱(1×10)中。柱预先经过用PH7.2的PBS冲洗和再生。结合的P97先用0.1M、PH3.0的枸橼酸洗脱，然后再用PH9.0的1MTris-HCI缓冲液中和。纯化的P97用30,000MW超滤膜浓缩，用PBS透析，然后无菌过滤。标准品P97的浓度用在280nm1％＝12.0cm-1下的P97消光系数测定(Baker等，1992)。血清样品制备如下。对每个病人需要以下样品(a)在-20℃保存的血清和(b)在4℃保存的新鲜血。在测试样品之前，离心新鲜血，回收血清。两种类型的样品经纯净和(或)用在Pandex缓冲液(含0.1％W/VNaN3和1.0％w/vBSA的DMEM)稀释50％V/V胎牛血清(FCA)后进行测试。血清P97的测定是按下面方法在特制的96孔板(22-401-1；Idexx)上进行，用FCA(Idexx)进行荧光读数。血清样品用50％FCA溶液作适当稀释后，96孔板上每孔加入60μl血清样品。每份样品测试二或三次。每块板的P97标准品也测二次(300，150，120，90，60，30，15，9，6ng/mL)。这些标准品用50％FCA溶液稀释，用于制备标准曲线。表1表示样品标准曲线的制备，图1为所制的标准曲线。每份样品中加入20μl包被的抗P97微珠(大约25μgAb/mL)，然后室温孵育40分钟。轻拍96孔板的边缘，以便轻微混匀板上每孔中的物质。孵育后，取20μl荧光化的第二抗P97抗体(用Pandex缓冲液1/75稀释(约25～40μg/mL))加入样品和微珠的混合物中，室温孵育5～10分钟。把板置于FCA中，抽干液体，用含0.1％NaN3和1％w/vBSA的PBS洗3～5次。然后用485/535nm滤光片25×对已抽干的反应板读数。血清样品从阿尔茨海默氏病(AD)人、作对照用的配偶和无关的对照人中获取。表2表示阿尔茨海默氏病人的P97血清浓度。疾病持续时间表示从诊断为阿尔茨海默氏病以来的年数。但是，很有可能病人在诊断之前的某一时间就患有此病。表3表示AD病人和对照样品中的P97血清浓度。无关对照的血清中P97的水平在2.4至12ng/mL的范围之间，而且P97水平并不随年龄增长而增长(见图2)。如图2所示，AD病人血清中P97的水平与对照相比显著升高，而且P97水平随着病人年龄的增加而升高。AD病人血清P97的水平至少有20ng/mL。观察到的最大浓度为300ng/mL。重要的是，如图3所示，我们发现AD病人血清中P97水平与其病程有关。随着病程的延长，病人血清中的P97水平升高。对AD病人和对照人样品中的血清转铁蛋白的水平也进行了测定。结果在AD病人和对照人之间血清中转铁蛋白的水平没有显著差异，年龄和血清转铁蛋白水平也没有相关性(图4)对一组以前获得的日本AD病人及对照人CSF和血清样品中的转铁蛋白和P97水平也进行了测定。这些样品已冷冻保存了2年，其间还经过了冻融，因此，现在实测的蛋白质水平可能不能反映最初样品中存在的蛋白质的绝对水平。但是，表4中表示的结果证实了上面的发现，AD病人血清中P97的水平比对照人中的水平高。该结果也显示AD病CSF中P97水平比对照人的高。AD病人血清和CSF中的转铁蛋白水平不比对照人的高。实施例2本实施例2提供了对实施1中举例说明的研究更完整的说明和讨论。下面的材料和方法用于实施例2描述的研究。加拿大人。AD病人(N＝27)选自那些参加Vancouver医院对阿尔茨海默氏病及相关疾病的UBC临床试验计划的人。按照NINCDS-ADRDA标准，所有AD病人均被诊断为“临床上可疑”。对所有的AD病人都确定了其认知症状的估计持续时间。病人在进行该研究时没有服用实验药物。作为对照的人，或者随机选自健康志愿者(N＝15)或者其配偶，都被证实没有临床上意义的明显认知障碍。本实施例进行了两个研究a)静脉穿刺后立即在4℃保存血清样品，24小时内测定其中的P97和Tf。年龄从51到82.5岁(平均年龄为66.4±16.5岁)的17名AD病人(10女，7男)与年龄在28岁到76岁(平均年龄为52.33±16.5岁)的15名对照人(6女，3男)进行比较。b)来自配偶对(N＝10对)的血清样品在静脉穿刺后立即在-20℃冻存。样品从配偶对中抽取的同时冷冻，并对其进行分析。AD病人(7女，3男)，年龄从54到86岁(平均年龄为70.6±10.47岁)与他们没患AD的配偶(3女，7男)年龄从53到84岁(平均年龄为69.9±10.21岁)进行比较。日本人。年龄从61到80岁(平均年龄为71.5±6.52岁)的8名AD病人(6女，2男)与年龄从57到72岁(平均年龄为66.5±6.4岁)的7名对照人(4女，3男)进行比较。AD病人和对照人的血清样品和CSF样品从chiba大学医学院神经学系获得。所有AD病人按NINCDS-ADRDA标准都被诊断为“临床可疑”。对照来自患有以下神经病理疾病的老年人1帕金森氏病、2脊髓小脑退化、1肌萎缩性侧索硬化、2颈椎关节强硬和1外周神经病。血清样品和CSF样品在抽取后立即在-20℃冻存，分析前一起解冻。P97的测定。样品经纯净和用含50％V/V胎牛血清、0.1％叠氮钠、1.0％W/V牛血清白蛋白的DMEM缓冲液释释后进行测定。抗P97小鼠抗体，HybC用于包被羧酸聚苯乙烯(0.77μm)捕获微粒，抗P97小鼠单克隆抗体，L235(ATCC-HB8446L235(H-19))被荧光化(Kennard，M.L，EMBOJ，14，4178-4186(1995))。P97标准品用含300至1ng/mL的胎牛血清的DMEM缓冲液新鲜配制。测定方法包括在一特制的96孔板上分别混合60μl样品和20μl捕获微粒(约25μg抗体/mL)、60μl标准品和20μl捕获微粒(约25μg抗体/mL)，室温孵育40分钟。接着，加入20μl荧光化的第二抗体(大约25到40μg/mL)，混合物室温再孵育5到10分钟。把反应板置入“Pandex荧光浓度分析仪”(Jolley，M.J.Immunol.Methods67，21-35(1984))，抽干液体，用含0.1％叠氮钠和1.0％牛血清白蛋白的PBS冲洗4次。抽干的反应板用485/535滤光片25×进行读数。P97的浓度用由P97标准品制备的标准曲线确定，该标准曲线中荧光与P97的浓度相关。所有样品在各种稀释度下进行三次测定，浓度为全部结果的平均值。转铁蛋白的测定。该测定方法是基于前面描述的“微粒浓度荧光免疫测定。”用抗人转铁蛋白山羊抗血清包被捕获微粒，将抗人转铁蛋白绵羊抗血清荧光化。转铁蛋白标准品新鲜配制成浓度范围3至5.0μg/mL。所有样品在各种稀释度下进行三次测定，浓度为全部结果的平均值。本发明建立了一个能监测人体液中P97浓度的定量方法。该方法基于快速免疫荧光技术“微粒浓度荧光免疫分析”，这种分析方法使用结合亚微粒聚苯乙烯微珠的捕获抗体和荧光标记的第二抗体(Kennard，M.L.等，Biotech，Bioeng，42，480-486，1993)。修改的夹心方法是在每孔含有0.22μm醋酸纤维膜的特殊设计96孔板上进行的。孔中的液体，能够在真空下被抽出，使每孔底的荧光混合物浓缩。板被冲洗后，对每孔进行荧光读数，荧光与P97的浓度成比例。我们发现P97在人血清中部分不稳定，随着保存时间的延长，它将失去抗原性。表5表示保存温度和时间对P97可检测浓度的影响，最初的血清最高浓度为100ng/mL。在60℃下热休克30分钟，样品中的P97不能检测到(惊奇的是Tf好象不受这种处理的影响)。样品室温下保存超过48小时即失去20％抗原性。然而，尽管进一步地冻融将减少P97的检测浓度，但是在4℃和-20℃保存超过48小时，样品是相对稳定的。因为这些原因，在把AD病人血清中P97浓度与认知正常的对照人进行比较时，血清样品在抽取后立即在4℃保存，并在24小时以内进行测定。图5表示所有的AD病人血清中P97的水平比对照人高，它们之间没有重叠。基于配对t检验(t0.05＝12.96，P＝6.6×10-10)，AD病人组的P97浓度平均值(N＝17，43.8±11.6ng/mL)与对照组的平均值(N＝15，7.04±3.28ng/mL)相比有显著差异。至今尚只有另外一个对人血中P97的研究(Brown，J.P.等，Proc，Natl，Acad，Sci，USA78，539-543，1981)，检测出的P97在1.3至2.7ng/mL之间。尽管对照组的平均年龄(52.3±16.5岁)比AD病人组的平均年龄(66.4±17.52岁)小，但线性回归显示在P97血清浓度和实验对象年龄之间不存在显著相关(AD病人N＝17，回归直线斜率＝0.359，R＝0.30，P＝0.249；对照N＝15，回归直线斜率＝-0.07，R＝-0.35，P＝0.197)。而且，用AD病人的数据对病人被首次观察到AD症状时起的时间作图(图6)，其线性回归显示升高的血清P97浓度和病程的进展之间存在显著相关(N＝17，回归直线斜率＝3.3，R＝0.82，P＝0.0003)。最后，由回归直线推断出的对照的P97最大浓度显示P97的浓度可能在病人被观察到AD症状前约2年开始升高。为了消除AD病人中P97非特异性升高的可能性，我们分析了AD病人和对照人血清中的另一个血铁结合蛋白，转铁蛋白。图7表示在两种人群之间Tf浓度没有什么差异。用配对t检验统计分析(t0.05＝0.41，P＝0.69)，AD病人组的平均Tf浓度(N＝17，1.81±0.71mg/mL)与对照组的平均Tf浓度(N＝15，1.93±0.78mg/mL)之间没有显著差异。在另一个研究中，将AD病人血清中P97的水平与其认知正常的配偶相比，以判定是否可能存在饮食、生活模式或其它普通的因素对血清中P97浓度的影响。在这个研究中，血清样品在抽取后立即在-20℃冻存。图8比较了10对AD病人(70.6±10.47岁)及其配偶(69.9±10.21岁)血清中P97水平的比值。在全部实验中，AD病人血清中P97的水平比其配偶的高，比值在1.6至32.5之间(平均值为10.17±9.08)。该发现说明环境因素可能不是AD病人血清中P97水平升高的原因。血清和CSF中P97和转铁蛋白的水平在第三个研究中，我们分析了日本的AD病人和对照人血清和CSF冻存样品中的Tf和P97。本研究中使用的对照人为患各种其它神经病理疾病的人，对他们进行测试是为了确定患其它神经病理疾病的人血清中P97水平是否升高。然而，在分析之前，这些血清样品被一起冻融过，这样很遗憾地降低了P97检测浓度。因此，在表6中有几个数据值得注意。AD病人CSF中P97的平均浓度(N＝5，22.4±9.21ng/mL；平均年龄为72.4±5.99岁)比对照的高(N＝5，8.48±4.02ng/mL；平均年龄67.2±6.82岁)。基于配对的t检验(t0.05＝2.90，P＝0.044)，它们之间有显著差异。血清中的P97也是如此，基于配对的t检验(t0.05＝4.52，P＝0.02)，AD病人P97平均浓度(N＝4，11.3±2.76ng/mL；平均年龄为74.3±5.63岁)与对照组的P97平均浓度(N＝6，2.01±1.75ng/mL；平均年龄为65.6±6.52岁)之间存在着显著差异。尽管总体浓度降低很大，但这与图5的数据是一致的。增加其它的观察，P97的浓度与病人的年龄和性别不相关。这些数据还说明监测CSF，其中P97水平比血清的升高2至4倍时，即可提供有价值的AD病的发作及进展的信息。比血清中P97稳定得多的CSF和血清中的Tf浓度的平均值，对AD病人和对照人来说实质上相同的。基于配对的t检验(t0.05＝2.05，P＝0.18)，AD组CSF中Tf浓度的平均值(N＝8，20.35±4.78μg/mL；平均年龄为71.5±6.52岁)与对照组(N＝7，16.0±μg/mL；平均年龄67.7±6.32岁)之间没有显著差异。基于配对的t检验(t0.05＝0.38，P＝0.72)，AD组血清的平均Tf浓度(N＝4，2.24±3.6mg/mL；平均年龄为74.3±5.63岁)与对照组(N＝5，2.26±7.0mg/mL；平均年龄为63.4±4.5岁)之间也没有显著差异。我们还注意到，血清中Tf的水平比CSF中的高得多(约100倍)这个有趣的现象，这与P97相反，血清中P97的水平比CSF中的低。这些数据暗示脑中的P97具独特的功能，因为好象Tf是主动从脑排出而P97则不是。在本研究中，一种生物化学标记分子被鉴定，它在AD病人血清中的水平始终比有关或无关的对照人中的高。本发明的发现人已发现在AD病人与对照人之间没有重叠。从前面的叙述中可以看出，虽然为了举例说明，在此描述了本发明的一些特殊实施例，但在不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以作各种修改。因此，除附加的以外，本发明不受限制。表1</tables>表2AD病人和正常对照血清p97浓度的测试AD病人病人性别日期年龄病程(年)p97浓度(ng/mL)1女4/11/9451242.71女7/11/9451240.661女10/11/9451238.52女10/11/9468241.253女30/11/9475538.72女30/11/9468234.74女30/11/94821160.45女30/11/9482.54.538.26男30/11/94641.5317女30/11/9473.55.537.78女30/11/94817.0525女15/4/9482487.16男20/4/9463.5147.29男27/4/947434110男18/3/9459950.811男8/6/9477769.68女15/7/9480.56.556.412女29/7/9455445.613男4/5/9459540.613男21/9/9459.55.542表395年7月21日和24日测试的样品--病人及其配偶对照测试对象性别日期年龄(岁)病程(年)p97浓度(ng/mL)血液血清1男21/775228241-配偶女21/775-322男21/78613211452-配偶女21/776-343女21/772425223-配偶男21/773-114男21/780943504-配偶女21/768-731男24/775226201-配偶女24/775-392男24/78613653742-配偶女24/776-9.5123女24/772428.3273-配偶男24/773-234男24/780952.3764-配偶女24/768-9.412无关的对照测试对象年龄(岁)p97浓度(ng/mL)1319.22281033610.543811.85407.36415.37421.2851129532.410638.911707.8表4日本人脑脊液(CSF)和血清样品中转铁蛋白(Tf)和p97的测试CSF阿尔茨海默氏病人Tf浓度(μg/mL)p97浓度(ng/mL)113.63-223.34-328.2114.22715.8-3025.640.43821.320.56716.918.6791818.5对照418.011512.41169.9-712.210823.40.5913.99.9血清阿尔茨海默氏病人Tf浓度(mg/mL)p97浓度(ng/mL)12.198.832.628.2271.68-302.4814.0对照43.40.152.060.861.252.072.122.1101.955.6表5表5在人血清中p97的稳定性*试验(初始浓度为100ngp97/mL血清)温度(℃)保存时间(小时)0.52448600未测未测室温95.988.281.2499.599.097.5-2094.092.491.2*稳定性用保存一定时间后可检测p97的百分数表示；nd--表示未检测。表6表6AD病人和患其它神经病理病的病人脑脊液和血清中p97及转铁蛋白的浓度AD病人*CSF血清病人年龄性别p97(ng/mL)Tf(μg/mL)p97(ng/mL)Tf(μg/mL)180女未测13.68.82190265女未测23.3未测未测377男14.228.28.226202765女未测15.87.816803075女40.425.614.024803872女20.521.3未测未测6761男18.616.9未测未测7977女18.518.0未测未测22.4±9.2120.35±4.7811.3±2.762240±360患其它神经病理病的对照CSF血清病人及所患疾病年龄性别p97(ng/mL)Tf(μg/mL)p97(ng/mL)Tf(μg/mL)4-帕金森氏病65女11.718.00.134005-脊髓小脑退化57男11.212.40.820606-脊髓小脑退化70女未测9.92.012507-肌萎缩性侧索硬化65女10.012.22.121208-颈椎关节强硬77男0.523.41.5未测9-颈椎关节强硬72女9.913.9未测未测10-外周神经病60男未测未测5.619508.48±4.0216.0±4.52.01±1.752260±700*按NINCDS-ADRDA标准诊断为临床上可疑的AD病人；nd--表示未检测。权利要求1.一种通过定量病人体液样品中的P97来诊断阿尔茨海默氏病的方法，它包括以下步骤a)从怀疑患有阿尔茨海默氏病的病人中获取体液样品，从而得到试验样品；b)测定试验样品中P97的量；c)比较试验样品和对照样品中P97的量，其中，试验样品中存在的P97的量比对照样品中的高表示可能患有阿尔茨海默氏病。2.按照权利要求1所述的方法，其中试验样品中P97的量与对照样品中的P97的量相比升高1.5倍或者更高表示可能患有阿尔茨海默氏病。3.按照权利要求1所述的方法，其中试验样品中P97的量与对照样品中P97的量升高2至9倍表示可能患有阿尔茨海默氏病。4.按照权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中把试验样品中P97的量与对照样品中测定的P97的平均值或基线值作比较。5.按照权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的对照样品为来自同一病人或另一个体的正常样品。6.一种通过定量患有阿尔茨海默氏病的病人体液样品中的P97来监测阿尔茨海默氏病的进展的方法，它包括以下步骤a)从病人中获取体液样品，从而得到试验样品；b)测定试验样品中P97的量；c)比较试验样品和更早时间从该病人获得的第一个试验样品中P97的量，其中，试验样品中P97的量比第一个试验样品中的高表示该病人的阿尔茨海默氏病情有进展。7.一种通过定量患有阿尔茨海默氏病人体液样品中的P97来监测阿尔茨海默氏病的治疗的方法，它包括以下步骤a)从已接受治疗的病人中获取体液样品，从而得到试验样品；b)测定试验样品中P97的量；c)比较试验样品和在治疗前从该病人中获得的治疗前样品中的P97的量，其中，试验样品与治疗前样品中P97量的差异表示该治疗的效果。8.按照权利要求1至7中的任何一个所述的方法，其中的体液为血清或者CSF。9.按照权利要求1至7中的任何一个所述的方法，其中步骤(b)中P97的量是用P97的抗体测定的。10.一种用于实施按照权利要求1，6或7所述方法的试剂盒，它包括检测试验样品中P97存在的试剂和用于检测P97存在的试剂。全文摘要一种通过定量人体液样本中的P文档编号A61K38/00GK1198214SQ96197251公开日1998年11月4日申请日期1996年8月30日优先权日1995年8月31日发明者W·A·杰福里斯,M·肯纳德申请人:不列颠哥伦比亚大学