本发明属于生物技术领域，特别涉及一种新的环状hsa_circrna_102032的应用。
背景技术：
肝脏是身体内极其重要的代谢器官，其功能的失调会影响机体正常的新陈代谢和内环境的变化。原发性肝癌(primarylivercancer，plc)是一类发生于肝脏的恶性肿瘤，一般由化学致癌物或环境因素引发的慢性肝病或肝硬化发展而来，但是目前发病机制还未阐明，病理诊断和治疗手段有一定的局限性。同种异体肝移植是目前治疗plc最彻底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是医疗界所面临的问题。因此，迫切需要发现用于plc早期诊断以及治疗作用评估的新生物标记物。
近年来，随着分子生物学基因芯片技术的发展，越来越多的研究者利用该技术探索了各类生物小分子与疾病的关系，而环状rna(circularrna,circrna)是目前研究重大疾病分子机理的热点。circrna是一类保守性好、特异性高，对靶基因能发挥调控作用的内源性非编码rna。因此筛选出具有差异表达的circrna作为疾病相关的生物标志物，并对其进行功能研究，可以更好地了解疾病发生的分子机制，进而提高相关疾病的预防和诊断水平。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种新的环状rna的序列及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种环状rna，其序列是：
ctagagttgggaagacatcactgattatgtctctggtcagtgaagaatttccagaagaggttcctccccgggcagaagaaatcaccattccagctgatgtcaccccagagagagttccaacacacattgtagattactcagaagcagaacagagtgatgaacaacttcatcaagaaatatctcaggctaatgtcatctgtatagtgtatgccgttaacaacaagcattctattgataaggtaacaagtcgatggattcctctcataaatgaaagaacagacaaagacagcag(seqidno：1)。
优选的，该环状rna可以作为肝癌检测、治疗、预后靶点进行应用。
一种肝癌检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测序列为seqidno：1的环状rna的试剂。
优选的，该试剂盒中含有实时荧光定量检测序列为seqidno：1的环状rna的引物序列。
进一步优选的，环状rna引物序列是：
f：5’-gataaggtaacaagtcgatggat-3’(seqidno：4)；
r：5’-tggaactctctctggggtga-3’(seqidno：5)。
一种肝功能指标检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测序列为seqidno：1的环状rna的试剂。
优选的，该试剂盒中含有实时荧光定量检测序列为seqidno：1的环状rna的引物序列。
进一步优选的，环状rna引物序列是：
f：5’-gataaggtaacaagtcgatggat-3’(seqidno：4)；
r：5’-tggaactctctctggggtga-3’(seqidno：5)。
优选的，肝功能指标为谷草转氨酶、谷丙转氨酶中的至少一种。
本发明的有益效果是：本发明申请公开的circrna在肝癌手术前后具有比较明显的表达差异，目前用于肝癌的临床辅助诊断技术尚不完善，因此该circrna具有作为肝癌相关的生物标志物的潜能。
附图说明
图1为hsa_circrna_102032在肝移植术前1天、肝移植术后1天、3天、7天的表达量。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
在对肝癌进行研究的过程中，发现了一个环状rna。其序列是：
ctagagttgggaagacatcactgattatgtctctggtcagtgaagaatttccagaagaggttcctccccgggcagaagaaatcaccattccagctgatgtcaccccagagagagttccaacacacattgtagattactcagaagcagaacagagtgatgaacaacttcatcaagaaatatctcaggctaatgtcatctgtatagtgtatgccgttaacaacaagcattctattgataaggtaacaagtcgatggattcctctcataaatgaaagaacagacaaagacagcag(seqidno：1)，将其命名为hsa_circrna_102032。
实验例2材料与处理：
1)外周血标本的收集
标本收取于中国人民解放军第一八一医院肾脏科进行plc肝移植手术前1天、术后1天、术后3天、术后7天患者，以及于中国人民解放军第一八一医院门诊部门体检正常的健康志愿者的外周血，每个标本收集0.5ml于0.5ml的冻存管中并置于-80℃冰箱保存，储存备用。所有研究对象均知情同意参加本项实验，且该过程经医院伦理委员会审查批准。
2)样品的制备与评估
rna样品制备
实验分为肝癌病人肝移植术前1天组、术后1天、术后3天、术后7天组和健康对照组。
每组取2ml混样全血，用1mltrizol试剂和移液管将细胞吹吸裂解液几次，而悬浮细胞则是在离心的沉淀中加入trizol试剂并用移液管反复吹吸以裂解细胞，在trizol试剂加入前不要洗涤细胞以免增加mrna降解的可能。
为了将核酸蛋白复合体完全解离，把加了trizol的样品于15-30℃放置5min；每1ml的trizol试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖；手动剧烈振荡管体15s后，15-30℃孵育2-3min；4℃下12,000×g离心15mim；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相；rna全部被分配于水相中；水相的体积大约使匀浆时加入的trizol试剂的60％。
将水相转移到新离心管中；水相与异丙醇混合使其中的rna沉淀(加入异丙醇的量为每个样品匀浆加入1mltrizol试剂时加0.5ml的异丙醇)；混匀后15-30℃孵育10min后，于4℃12,000×g离心10min；rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
移去上清液，每1mltrizol试剂匀浆的样品中加入至少75％的乙醇1ml用于清洗rna沉淀；振荡后，4℃7,500×g离心5min。
最后，为了不降低rna的可溶性，在空气中不完全干燥rna沉淀5-10min。溶解rna时，先加入无rna酶的水用枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10min。获得的rna溶液保存于-70℃。
总rna纯化及质检
使用nanodropnd-1000评估rna量和质量，吸光度在260和280mn处测定，a260/a280的比值需要接近2.0(1.8-2.1之间均可)，并且a260/a230比值要大于1.8。rna完整性和纯度通过标准变性凝胶电泳进行评估。具体实验过程如下。
在微量离心管中分别加入重新溶解的rna≤85μl、10×反应缓冲液10μl、baseline-zerodna酶5μl、无rna酶的水至100μl；37℃孵育30min；加入350μl缓冲液rlt，混匀；加入250μl乙醇(96–100％)，吸打混匀；将上述700μl的样品加入到安装在2ml收集管上的rneasy小型离心柱中，小心地盖上盖子，在≥8000×g的离心机上离心15s，弃去流体；在rneasy小柱中加入500μl缓冲液rpe(rpe缓冲液第一次使用前，按瓶上所述加入4倍体积的96-100％乙醇配成工作溶液)，小心地盖上盖子≥8000×g离心15s，洗涤rneasy膜，弃去流体；再次加入500μl缓冲液rpe，盖上盖子，≥8000×g离心2min，洗涤rneasy膜；把rneasy柱放在一新的2ml的收集管中，用过滤法去除旧的收集管，全速离心1min；rneasy柱转移到一新的1.5ml的离心管中，吸取适量无rna酶的水直接加入到rneasy膜中；盖上管盖，≥8000×g离心1min，洗脱；最后进行rna定量和质量控制。
实验例3实时荧光定量pcr检测
引物设计
根据术前组(术前1天组)与健康对照组比较上调且术后组(术后1天、3天、7天组)与术前组比较下调，或者术前组与健康对照组比较下调且术后组与术前组比较上调的筛选原则随机挑选验证的circrna进行荧光定量验证。以2-δδct法计算差异倍数，通过rt-pcr检测。pcr引物序列如下：
表1rt-pcr引物列表
rt-pcr进行验证
采用rt-pcr进行验证。建立8μl体系，加入2×mastermix5μl，正、反向引物各0.5μl，蒸馏水2μl。将8μl混合液加到384-pcr板对应的每个孔中，加入对应的2μlcdna，小心粘上sealingfilm封口膜，并短暂离心混合。将上述384-pcr板置于realtimepcr仪上进行pcr反应。反应程序如下：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10s；60℃，60s收集荧光)。为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-ramprate为0.05℃/s)。由于受rna浓度定量误差和rna逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μl体积的cdna其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因β-actin(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。
肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天及健康对照者的5组外周血标本均可见扩增曲线，引物的扩增效率较高，熔解曲线符合标准，引物的特异性较好(表2)。
表2cricrna在标准曲线中与扩增相关的数值
实验例4rt-pcr检测结果分析
为了检测hsa_circrna_102032在肝移植术前1天(肝癌患者)、术后1天、术后3天、术后7天以及健康对照组之间是否存在差异表达，发明人将circrna的ct值经β-actin内参基因的ct校正后得到的△ct值用于两组间相对表达比值：2-△△ct，以及两组间是否存在显著差异的p值计算(表3、表4)。从图1可知，hsa_circrna_102032在肝移植术前1天的表达量相对于健康对照组极其显著上调(p<0.01)，并且在肝移植术后1天、3天、7天有着显著下调的趋势。
表3肝移植组和健康对照组circrna的△ct值
表4肝移植组和健康对照组之间circrna表达的p值和2-△△ct值
注：*p<0.05代表两组之间存在显著差异表达；**p<0.01代表两组之间存在极其显著差异表达。
实验例5肝移植患者围手术期实验组
收取4例2014年12月1日至2015年8月31日于中国人民解放军第一八一医院确诊为plc并进行肝移植手术的患者。4例患者均为男性，平均年龄40.25±6.40岁，中位年龄42.5岁。所有患者有长期大量饮酒病史，治疗前诊断为酒精性肝硬化发展成plc，且无其他肿瘤病史和肝炎感染病史。
患者和健康个体的临床特征从第181医院的数据库中提取并总结在表2-1中。谷草转氨酶(aspartatetransaminase，ast)和谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，alt)是用于评估肝功能的常用指标，在0-50iu/l之间为正常参考值，表5显示，经移植术后plc患者的肝功能逐渐恢复正常。
表5肝移植患者和健康对照组的临床特征
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