专利名称：肝癌鉴别诊断用p28的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗检测试剂技术领域，是临床上肝癌病理鉴别诊断中对肝细胞性肝癌进行确认的一种新的标记物兔抗人p28GANK抗体，使肝细胞性肝癌与胆管细胞性或转移性肝癌区分开来，以便对症治疗。
背景技术：
肝癌从组织起源上大致可以分为三种类型，即肝细胞性肝癌、胆管细胞性肝癌和转移性肝癌。由于肝癌的病理学特点以失去正常的肝小叶结构为特征，因此在组织结构上很难对已被破坏的肿瘤细胞的来源做出判断，尤其是中低分化型肝癌。而外科的活检标本因为受到组织视野的限制，也给肝癌的病理诊断带来困难。目前在肝细胞性肝癌中常用HepPar1、AFP和CD34作为诊断抗体，而在胆管细胞性肝癌中常以CK18和CK19作为诊断抗体。实际工作中对目前应用的肝癌标记物检出率的报道各有不同。经典的AFP标记虽然特异性强，但敏感性不高，在肝癌组织中的实际阳性率仅为25％～50％。
发明内容
本发明根据抗原与抗体特异结合的原理，用从人肝细胞性肝癌组织中筛选出的p28GANK基因制备的p28GANK蛋白抗原免疫家兔，制备兔抗人p28GANK抗体，由于p28GANK抗体可以特异性识别肝细胞性肝癌的恶性肝细胞，因此可将兔抗人p28GANK抗体用于检测肝细胞来源的人肝细胞性肝癌，并将肝细胞性肝癌与胆管细胞性肝癌、转移性肝癌区分开来。
人肝癌高表达p28GANK基因是2000年Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞性肝癌组织中筛选出的新基因(GenBankD83197)，其开放阅读框编码226个氨基酸组成的25kDa的蛋白质，其中含有6个重复ankyrin序列和1个Rb蛋白结合域(Nature Medicine 2000，696-99.)。其结构见氨基酸序列表1。
一、本发明兔抗人p28GANK抗体的制备方法如下1.RT-PCR法克隆p28GANK基因1.1合成引物正向引物H15’-gcggatccagtagttgctgggacagc-3’其5’端引入BamHI酶切位点ggatcc反向引物H25’-cgctcgagcttgagtattaaacccagg-3’其5’端引入XhoI酶切位点ctcgag1.2逆转录反应合成单链DNA(采用Gibco/BRL公司的Superscript逆转录试剂盒)反应按如下条件进行人肝癌组织总RNA(按Life Technologies公司Trizol RNA纯化试剂盒操作，制备)(1μg/μ1)2μl，随机六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脱氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)处理水2μl，5×第一链合成缓冲液4μl，二硫苏糖醇DTT(0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制剂RNasin 1μl，RNA依赖DNA合成酶Superscript II 1μl，总反应体积为20μl，42℃水浴50分钟，70℃灭活15分钟后，将所得的逆转录产物置-20℃保存备用。
1.3以上述逆转录产物为模板，PCR扩增人p28GANK基因cDNA反应体系按如下比例逆转录产物2μl，10×PCR缓冲液5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，脱氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，引物H1(10μmol/L)1μl，引物H2(10μmol/L)1μl，聚合酶Taq polymerase 0.5μl，去离子水36.5μl，总反应体积为50μl。PCR程序为94℃变性4分钟；94℃ 40秒，55℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃延伸8分钟。然后按常规通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物。
1.4构建p28GANK基因诱导表达重组质粒pProEX-HTb-p28GANK以BamHI和XhoI分别双酶切6×组氨酸融合表达载体pProEX-HTb(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)和上述PCR纯化产物，经1.5％琼脂糖凝胶分离，用QIAGEN公司胶回收DNA试剂盒回收酶切DNA片段。然后将酶切纯化后的pProEX-HTb载体和酶切纯化后的PCR产物经T4连接酶进行连接，得到连接产物。
1.5构建工程菌HT-p28并鉴定重组质粒按常规，将上述连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素LB平板，37℃孵箱过夜，挑取单菌落扩增培养后抽取质粒DNA，用BamHI/XhoI进行酶切和DNA测序鉴定。鉴定结果表明，其重组表达质粒为pProEX-HTb-p28GANK，其相应的工程菌为HT-p28。
2.p28GANK蛋白的表达与纯化按常规将工程菌HT-p28用0.6mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养4小时后，根据德国QIAGEN公司组氨酸标记蛋白纯化试剂盒提供的操作说明书纯化p28GANK蛋白，得到p28GANK蛋白。
本发明用H1，H2引物从人肝癌组织总RNA逆转录产物中扩增的p28GANK序列是(GenBankD83197)78bp-761bp间的cDNA，其全长684bp，所表达的p28GANK蛋白含221个氨基酸。结构见氨基酸序列表2。其与氨基酸序列表1所示的由226个氨基酸组成的p28GANK蛋白相比缺少了C端的5个氨基酸，但抗原免疫的效果不变。
3.兔抗人p28GANK抗体的制备、纯化与鉴定多克隆抗体的制备按《分子克隆实验指南》(第二版，萨姆布鲁克J.等，科学出版社，北京，1997，下同)介绍的方法进行。
3.1免疫接种取上述p28GANK蛋白2mg溶于1.5ml生理盐水与等体积的完全弗氏佐剂(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)乳化后，在新西兰大白兔的背部皮内多点注射。首次免疫后3周，对新西兰大白兔分别进行三次加强免疫，每次间隔2周。每次剂量为p28GANK蛋白1mg溶于1.5ml生理盐水，与等体积的非完全弗氏佐剂(Gibco/BRL，LifeTechnologies，NY)乳化后注射。
3.2制备p28GANK抗体第三次加强免疫后一周，取兔耳缘静脉血1ml，确定效价达到1∶32以上。再在第三次加强免疫后第10天进行颈动脉插管取血，取尽，将血液置4℃ 24小时，先吸取析出的兔血清，再将余血于4℃，4000转/分钟离心10分钟，吸取上层血清。将血清分装后于-80℃保存。按常规，用固定于硝纤膜上的抗原亲和纯化兔抗人p28GANK抗体。
3.3鉴定p28GANK抗体用Western blotting鉴定上述纯化抗体的特异性，具体按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行，将纯化的抗体稀释，稀释度为1∶50。其能特异性识别p28GANK抗原，也包括能特异性识别真核细胞裂解液中表达的p28GANK抗原。鉴定结果表明其为p28GANK抗体。
二、p28GANK抗体鉴别诊断肝细胞性肝癌的免疫组织化学染色实验1.肝癌切片的免疫组织化学染色按常规采用免疫组织化学染色方法检测肝癌组织的细胞来源。免疫组化采用美国DAKO公司生产的试剂盒DAKO EnVision System(DAKO Corporation，carpinteria，USA)。
p28GANK抗体在组织特异性上有较好的肝细胞特异性染色，其在人肝细胞肝癌中染色反应为阳性；而在人胆管细胞性肝癌和转移性肝癌中，对胆管细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、Kuffer氏细胞和肝间质细胞染色均为阴性。
将肝细胞性肝癌(HCC)，胆管细胞性肝癌(ICC)，肝胆管细胞混合性肝癌(C-HCC-CC)和转移性肝癌(MHC)分别用p28GANK抗体、HepPar1抗体、CK18抗体和AFP抗体分组进行免疫组织化学染色，染色结果用Crohn-Mantel-Haentzsel统计法分析，比较结果见表3。
表3p28GANK，Hep-Par1，CK18和AFP抗体免疫组化染色比较
由表3可见，对肝细胞来源的HCC或C-HCC-CC，AFP抗体染色率较低而p28GANK抗体与HepPar1和CK18抗体一样都有较好的染色反应，但对ICC和MHC，p28GANK抗体均不染色，而HepPar1抗体对MHC和CK18抗体对ICC和MHC则仍有部分染色，说明p28GANK抗体在区分肝细胞来源的肝脏肿瘤的鉴别诊断中有实际应用价值。
2.肝癌鉴别诊断实验为了进一步评价p28GANK抗体用于临床肝癌病理鉴别诊断的可能性，将p28GANK抗体与临床上常用的HepPar1和CK18抗体做比较，采用Golden Standard diagnostic evaluationtest(金指标诊断标志物评价测试)进行分析。评估指标有敏感度(sensitivity，简写Se)，特异度(specificity，简写Sp)，误诊率(mistake diagnostic rate，简写α)，漏诊率(omissiondiagnostic rate，简写β)，阳性预测值(positive predictive value，简写PV+)，阴性预测值(negative predictive value，简写PV-)，准确率(validity rate，简写π)，Younden指数(YoundenIndex，简写YI)。
具体操作为将病理诊断为肝细胞来源的肝脏肿瘤标本归为诊断阳性组D+，D+＝HCC+C-HCC-CC；病理诊断为非肝细胞来源的肝脏肿瘤标本归为诊断阴性组D-，D-＝ICC+MHC。用待检抗体检出为阳性的归为T+，T+组中包括病理诊断为肝细胞来源的标本，即用待检抗体确诊的例数a(确诊)，a＝HCC++C-HCC-CC+，也包括病理诊断为非肝细胞来源的标本，即用待检抗体误诊的例数b(误诊)，b＝ICC++MHC+；用待检抗体检出为阴性的归为T-，T-组中包括病理诊断为肝细胞来源的标本，即用待检抗体漏诊的例数c(漏诊)，c＝HCC-+C-HCC-CC-，也包括病理诊断为非肝细胞来源的标本，即用待检抗体作出鉴别诊断的例数d(鉴别诊断)，d＝ICC-+MHC-。评价结果如表4所示。
表4金标准测试(Golden Standard Test)评价HepPar1，CK18和p28GANK抗体在40例肝癌鉴别诊断中的表现
HepPar1Se＝0.76 Sp＝0.91，α＝0.09 β＝0.24，π＝0.8000 YI＝0.67，PV+＝0.96 PV-＝0.59CK18Se＝0.85 Sp＝0.64，α＝0.36 β＝0.15，π＝0.7890 YI＝0.49，PV+＝0.85 PV-＝0.64p28GANKSe＝0.70 Sp＝1.00，α＝0.00 β＝0.30，π＝0.8235 YI＝0.70，PV+＝1.00 PV-＝0.70由表4看出，p28GANK抗体在特异度(Sp)、误诊率(α)、准确率(π)、Younden指数(YI)、阳性预测值(PV+)和阴性预测值(PV-)等指标上都优于HepPar1和CK18抗体。说明p28GANK抗体应用于临床肝癌病理鉴别诊断的优越性。
图1为本发明构建的重组质粒pProEX-HTb-p28GANK结构示意图。
图2为本发明的p28GANK抗原纯化后聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。
图3为本发明p28GANK抗体的Western blotting鉴定图。
图4为本发明p28GANK抗体在肝细胞性肝癌组织内的免疫组化图(200×)。
图5为本发明p28GANK抗体在肝癌组织内的特异性染色图(200×)。
图6为本发明p28GANK抗体在胆管细胞性肝癌组织内的免疫组化图(200×)。
图7为本发明p28GANK抗体在转移性肝癌组织内的免疫组化图(200×)。
具体实施例方式
实施例1制备兔抗人p28GANK抗体1.RT-PCR法从人肝癌中克隆p28GANK基因1.1合成引物正向引物H15’-gcggatccagtagttgctgggacagc-3’其5’端引入BamHI酶切位点ggatcc反向引物H25’-cgctcgagcttgagtattaaacccagg-3’其5’端引入XhoI酶切位点ctcgag1.2逆转录反应合成单链DNA人肝癌组织总RNA(按Life Technologies公司Trizol RNA纯化试剂盒操作，1μg/μl)2μl，随机六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脱氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)处理水2μl，5×第一链合成缓冲液4μl，二硫苏糖醇DTT(0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制剂RNasin 1μl，RNA依赖DNA合成酶Superscript II1μl，总反应体积为20μl，42℃水浴50分钟，70℃灭活15分钟后，将所得的逆转录产物置-20℃保存备用。
1.3以上述逆转录产物为模板，PCR扩增人p28GANK基因cDNA逆转录产物2μl，10×PCR缓冲液5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，脱氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，引物H1(10μmol/L)1μl，引物H2(10μmol/L)1μl，聚合酶Taqpolymerase 0.5μl，去离子水36.5μl，总反应体积为50μl。PCR程序为94℃变性4分钟；94℃ 40秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，共35个循环；72℃延伸8分钟。经琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收PCR产物。
1.4构建p28GANK基因诱导表达重组质粒pProEX-HTb-p28GANK以BamHI和XhoI分别双酶切6×组氨酸融合表达载体pProEX-HTb(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)和上述纯化的PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶分离，用QIAGEN公司胶回收试剂盒回收酶切DNA片段，然后将酶切纯化后的pProEX-HTb载体和PCR酶切纯化的DNA，以分子数比为1∶5，加入T4连接酶缓冲液2μl，加T4连接酶2u(5u/μl)，补去离子水至总反应体积20μl，置22℃水浴连接过夜，65℃灭活酶10分钟。
1.5构建工程菌HT-p28并鉴定重组质粒按常规，将上述连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素LB平板，37℃孵箱过夜，挑取单菌落扩增培养后抽取质粒DNA，用BamHI/XhoI进行酶切，测序鉴定。鉴定结果所获得的重组表达质粒为pProEX-HTb-p28GANK，其相应的工程菌为HT-p28。
2.p28GANK蛋白的表达与纯化按常规将上述工程菌HT-p28用0.6mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养4小时后，按德国QIAGEN公司组氨酸标记蛋白纯化试剂盒提供的操作说明书纯化p28GANK蛋白。简要步骤如下取少量HT-p28工程菌接种于20ml LB(含氨苄青霉素100mg/ml)培养基中，37℃下振荡培养过夜。按1％的接种量将过夜培养的菌种于1升的LB(含氨苄青霉素100mg/ml)培养基中，37℃下振荡培养至光吸收值OD600nm约0.5～0.7，然后加入终浓度为0.6mM的IPTG，经诱导培养4小时后，4℃下6,000转/分离心15分钟。细菌沉淀用裂解液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑，10mM β-巯基乙醇，10％甘油，1mg/ml溶菌酶)10ml重悬，在冰浴上超声10分钟×3次，再在4℃下13,000转/分离心15分钟。离心后上清与1ml 50％(V/V)Ni-NTa悬液混合，4℃慢摇1小时，然后将全部液体上纯化柱，收集流出液。以冲洗液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，10mM β-巯基乙醇，10％甘油)10ml×3洗柱。最后用洗脱液(50mMNaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑，10mM β-巯基乙醇，10％甘油)1ml×5洗脱六组氨酸融合蛋白，收集蛋白洗脱样品液。取10μl蛋白样品液加入10μl上样缓冲液(100mM Tris-Cl pH6.8，200mM二硫苏糖醇，4％十二烷基硫酸钠，0.2％溴酚兰，20％甘油)，100℃变性3分钟，上样10％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，考马斯亮蓝染色鉴定。电泳图谱如图2所示，其中标号1为细菌裂解液；2为上柱流出液；3为洗柱液；4～7为蛋白依次洗脱液。由图2看出，纯化的p28GANK蛋白条带位置正确，纯度较高，得率也能满足下一步免疫家兔所需用量。
3.p28GANK多克隆抗体的制备、纯化与鉴定多克隆抗体的制备按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行。取上述p28GANK蛋白2mg溶于1.5ml生理盐水，与等体积的完全弗氏佐剂(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)乳化后，在新西兰大白兔的背部皮内选择5个点分点注射。首次免疫后3周，对新西兰大白兔分别进行三次加强免疫，每次间隔2周。每次剂量为p28GANK蛋白1mg溶于1.5ml生理盐水，与等体积的非完全弗氏佐剂(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)乳化后注射。第三次加强免疫后一周，取兔耳缘静脉血1ml，确定效价达到1∶32以上。再在第三次加强免疫后第10天进行颈动脉插管取血，取尽，将血液置4℃ 24小时，先吸取析出的兔血清，再将余血于4℃，4000转/分钟离心10分钟，吸取上层血清。将血清分装后，-80℃保存。
利用固定于硝纤膜上的抗原亲和纯化p28GANK特异性抗体，具体步骤如下p28GANK抗原样品100μg上样10％SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素NC膜，丽春红染色，标出p28GANK抗原带位置。剪下抗原带，1×TBS洗去染料，以5％脱脂奶粉(1×TBS配制)封闭2小时后，与兔抗血清(1∶20稀释)室温孵育3小时，转入1×PBS(1％Tween-20)中漂洗10分钟×3次，再用1×PBS漂洗10分钟×2次。取一塑料平皿，在底部平铺parafilm膜，将NC膜放于其上，在NC膜上滴加洗脱缓冲液(0.2mol/L甘氨酸pH2.8，1mmol/L EGTA)200μl，置于湿盒中，室温20分钟。收集全部洗脱液置1.5ml离心管，加入1/10体积1mol/LTris碱(pH10)，1/10体积10×PBS，1/10体积2％BSA，1/100体积4％叠氮钠。换新鲜抗血清继续上述操作，分次收集洗脱抗体。
用Western blotting鉴定纯化抗体的特异性，按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行，纯化p28GANK抗体稀释度为1∶50。结果见图3，其中各抗原分别为，1BSA抗原，24His-p28GANK抗原，5SK-Hep1细胞裂解液，6稳定转染pcDNA3.1的HEK293细胞系裂解液，7稳定转染Myc-p28GANK的HEK293细胞系裂解液。所用抗体分别为，1，2，5～7用p28GANK抗体(1∶50)；3用预先与His-p28GANK抗原孵育后的p28GANK抗体；4用预先与BSA抗原孵育后的p28GANK抗体。p28GANK抗体能特异性识别p28GANK抗原，这种特异性反应可以被p28GANK抗原的预先结合而中止。p28GANK抗体也能特异性识别真核细胞裂解液中表达的p28GANK抗原。
实施例2p28GANK抗体鉴别诊断肝细胞性肝癌免疫组化采用美国DAKO公司生产的试剂盒DAKO EnVision System(DAKOCorporation，carpinteria，USA)，按常规操作进行，具体步骤如下1.制作肝癌组织免疫组化所用切片取人肝癌组织块1cm×1cm×1cm，按常规石蜡包埋，以5μm厚度切片。石蜡切片60℃烤箱过夜后，按以下流程脱蜡入水，二甲苯(1)10分钟→二甲苯(2)10分钟→二甲苯(3)10分钟→100％乙醇5分钟→95％乙醇5分钟→85％乙醇5分钟→75％乙醇5分钟→双蒸水5分钟。
2.免疫组化染色切片用3％H2O2甲醇液处理，室温放置20分钟后，用双蒸水洗5分钟×3次。行抗原修复，切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液中煮沸5分钟，停火10分钟，再煮沸5分钟，自然冷却至室温，双蒸水洗5分钟×3次。37℃下用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭30分钟，甩去封闭液，不洗，直接加本发明p28GANK抗体(一抗，1∶10)，置湿盒中37℃30分钟，然后置4℃冰箱16小时。取出后，室温复温15分钟，然后用0.01mol/L PBS洗5分钟×3次。滴加DAKO羊抗兔二抗(DAKOCorporation，carpinteria，USA)，37℃45分钟，用0.01mol/L PBS洗5分钟×4次，DAB显色2～10分钟后，用0.01mol/L PBS洗1次，苏木素复染10秒，置自来水返蓝，置蒸馏水浸泡。切片脱水透明，中性树胶封片，盖玻片覆盖。
3.观察结果(1)肝细胞性肝癌癌组织和相应癌旁组织的免疫组化染色结果见图4。图4显示染色阳性区域集中在肝细胞胞浆，间质淋巴细胞为阴性。癌组织(HCC)染色强度较同一病例癌旁组织(Para-HCC)为强。
(2)肝细胞性肝癌的免疫组化与伊红-苏木素染色对照结果见图5。由图5看出，左图为肝细胞染色阳性，胆管上皮细胞、血管内皮细胞、Kuffer氏细胞及间质细胞染色阴性。右图为同一标本连续性切片的伊红-苏木素(H&E)染色。
(3)胆管细胞性肝癌的免疫组化染色结果见图6。显示为阴性染色。
(4)转移性肝癌的免疫组化染色结果见图7。图中显示来自结肠癌的转移灶染色阴性，癌旁肝组织染色阳性。
上述结果说明，p28GANK抗体在人肝细胞肝癌中染色阳性，而在人胆管细胞性肝癌和转移性肝癌中的表达皆为阴性。在组织特异性上有较好的肝细胞特异性染色，而胆管细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、Kuffer氏细胞和肝间质细胞染色均为阴性。
本发明p28GANK抗体能较好地识别肝细胞来源的肝细胞性或肝胆管细胞混合性肝癌，并将它们与胆管细胞性或转移性肝癌区分开来。在临床肝癌的病理诊断中有实际应用价值，也可以和其它肝癌标志物联合应用，提高肝癌诊断的准确率，以便针对相应的肝癌类型制定合适的治疗方案。
表1p28GANK蛋白氨基酸序列表MEGCVSNLMVCNLAYSGKLEELKESILADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTEIVEFLLQLGVPVNDKDDAGWSPLHIAASAGRDEIVKALLGKGAQVNAVNQNGCTPLHYAASKNRHELAVMLLEGGANPDAKDHYEATAMHRAAAKGNLKMIHILLYYKASTNIQDTEGNTPLHLACDEERVEEAKLLVSQGASIYIENKEEKTPLQVAKGGLGLILKRMVEG表2p28GANK蛋白抗原氨基酸序列表MEGCVSNLMVCNLAYSGKLEELKESILADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTEIVEFLLQLGVPVNDKDDAGWSPLHIAASAGRDEIVKALLGKGAQVNAVNQNGCTPLHYAASKNRHEIAVMLLEGGANPDAKDHYEATAMHRAAAKGNLKMIHILLYYKASTNIQDTEGNTPLHLACDEERVEEAKLLVSQGASIYIENKEEKTPLQVAKGGLGLILK
权利要求
1.一种兔抗人p28GANK抗体的制备方法，包括如下步骤(1)合成引物正向引物H15’-gcggatccagtagttgctgggacagc-3’反向引物H25’-cgctcgagcttgagtattaaacccagg-3’(2)用人肝癌组织总RNA逆转录合成单链DNA；(3)以上述逆转录产物为模板，用引物H1和H2PCR扩增人p28GANK基因cDNA；(4)构建p28GANK基因诱导表达质粒pProex-HTb-p28GANK；(5)构建工程菌HT-P28；(6)用工程菌HT-P28表达并纯化p28GANK蛋白；(7)用p28GANK蛋白免疫家兔，使产生兔抗人p28GANK抗体；(8)由免疫兔血清制备兔抗人p28GANK抗体。
2.权利要求1所述制备方法所制得的兔抗人p28GANK抗体。
3.权利要求2所述兔抗人p28GANK抗体用于制备肝癌鉴别诊断试剂的用途。
全文摘要
本发明涉及医疗检测试剂技术领域，是临床上肝癌病理鉴别诊断中对肝细胞性肝癌进行确认的一种新的检记物兔抗人p28
文档编号G01N33/574GK1513876SQ0311682
公开日2004年7月21日 申请日期2003年5月9日 优先权日2003年5月9日
发明者王红阳, 傅骁勇, 谭璐, 刘淑琴, 吴孟超 申请人:中国人民解放军第二军医大学