专利名称：一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法及类家蚕丝素蛋白非结晶区基因任意倍数的克隆方法。
背景技术：
家蚕丝素蛋白，又称丝素蛋白，是一种结构蛋白，由包括丝素重链(H链)蛋白、丝素轻链(L链)蛋白和糖蛋白P25三个部分组成的复合体，属于结晶高聚物，分为结晶态和无定形态两大部分。其中，丝素蛋白重链是丝素蛋白的主要部分，全长5363个氨基酸，包括20种氨基酸，富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，其主要包括N末端151个氨基酸残基的非重复区域、核心区域和C末端55个氨基酸残基的非重复区域三个组成部分。而丝素重链的核心区域又分为富含甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)的高度重复区域和非重复的间隔区，其中，高度 重复区域内一般以GAGAGS重复开始，以GAAS终止。非重复间隔区，又称非结晶区，主要为GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFG 的非重复序列。研究表明家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中主要为亲水性氨基酸，其编码的多肽用作美容用品应具有比丝素粉更优的护肤保湿的功效，但是家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中含有光照易生色的酪氨酸和色氨酸，不适合用作护肤品。为了使家蚕丝素蛋白非结晶区能获得更好的应用效果(如护肤品、敷料类生物材料等的功能肽)，本发明人设计了去除了家蚕丝素蛋白非结晶区中的酪氨酸和色氨酸的编码的多肽，其氨基酸序列为GSSGFGPVANGGSGEASSESDFG,命名为类家蚕丝素蛋白非结晶区。为了更好地研究类家蚕丝素非结晶区及其应用，需要获得大量的高纯度的类家蚕丝素非结晶区的蛋白及不同聚合度类家蚕丝素非结晶区的蛋白。采用合成肽的方法获得类家蚕丝素非结晶区的蛋白价格昂贵，不适合类家蚕丝素非结晶区蛋白的大量生产。另一方面由于类家蚕丝素蛋白非结晶区的氨基酸发生了改变，使类家蚕丝素蛋白非结晶区基因不同于与家蚕丝素蛋白非结晶区基因，因此按照现有的基因工程技术利用现有的家蚕丝素的cDNA为模板进行克隆，有误差，无法获得与类家蚕丝素蛋白非结晶区核苷酸序列一致的目的片段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简便，准确性高的克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案—种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，包括以下步骤A、合成分别编码SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的LinkU Link2、Link3三个双链DNA分子；其中Linkl的5，端和3，端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端喊基；B、将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Nhel/Hindlll双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得。本发明通过对类家蚕丝素重链核心区的非结晶区氨基酸序列及其编码基因的分析，将类家蚕丝素非结晶区氨基酸序列分为如SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:2,SEQ ID N0:3所示的三段氨基酸序列，设计了编码SEQ ID NO: K SEQID NO:2, SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子。本发明所述Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子的5’端和3’端含有可以配对的同尾酶， 如Linkl的3’端限制性核酸内切酶NheI与Link2的5’端限制性核酸内切酶SpeI是一对同尾酶；Link2的3’端和Link3的5’端也是一对同尾酶Nhel/Spel。当三段基因连接后，两对同尾酶的位点NheI和SpeI被限制性内切酶切除后连接，形成符合非结晶区氨基酸的丙氨酸Ala和丝氨酸Ser的三联密码子。优选的，所述将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中的具体步骤包括a、用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSLl ；b、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL1，收集大片段，与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL2 ；C、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL2，收集大片段，与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接即得。本发明步骤a先用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集质粒pSLFA1180FA中BglII与NheI之间的大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到含有双链DNA分子Linkl的质粒PSLl。其中，所述的质粒pSLFA1180FA为具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列质粒。本发明步骤b用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化含有双链DNA分子Linkl的质粒PSLl，收集HindIII与NheI之间的大片段，所述HindIII与NheI之间大片段含有双链DNA分子Linkl，然后与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到含有双链DNA分子Linkl和Link2的质粒PSL2。本发明步骤c用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化含有双链DNA分子Linkl和Link2质粒PSL2，收集HindIII与NheI之间的大片段，所述HindIII与NheI之间大片段含有双链DNA分子Linkl和Link2，然后与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接得到含有双链DNA分子Linkl、Link2和Link3的质粒F (I)，即含有完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。将含有完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确，Nhel/Hindl 11双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。优选的，本发明所述双链DNA分子Linkl的编码链链具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。优选的，本发明所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。优选的，本发明所述双链DNA分子Link3的编码链具有如SEQ ID NO: 7所示的核
苷酸序列。为了更好地研究丝素蛋白非结晶区的结构和功能，需要获得不同聚合度类丝素非结晶区的蛋白，本发明还提供了一种克隆多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法。一种克隆多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，包括以下步骤I、合成分别编码SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三个双链DNA分子；其中Link4的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link5的5’端和3’端
分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link6的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点；II、将Link4、Link5、Link6连接到质粒pSLFA1180FA中，得到含有单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(I)；III、用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化步骤II得到的质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(I)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有二倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(2)；IV、重复步骤III，用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F (2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有三倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(3);用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(2)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F (2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(4)；V、分别将质粒F⑴、F⑵、F(3)和F(4)转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Agel/HindHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得单倍、二倍、三倍和四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。本发明设计了编码SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三个双链DNA分子。与上述克隆单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法的方案相似，所述Link4、Link5、Link6三个双链DNA分子的5’端和3’端含有可以配对的同尾酶，如Link4的3’端限制性核酸内切酶NheI与Link5的5’端限制性核酸内切酶SpeI是一对同尾酶；Link5的3’端和Link6的5’端也是一对同尾酶Nhel/Spel。当三段基因连接后，两对同尾酶的位点NheI和SpeI被限制性内切酶切除后连接，形成符合非结晶区氨基酸的丙氨酸Ala和丝氨酸Ser的三联密码子。优选的，本发明所述克隆方法步骤II将Link4、Link5、Link6连接到质粒PSLFA1180FA中的具体步骤包括i、用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Link4混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL3 ；i i、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindl 11消化质粒PSL3，收集大片段，与双链DNA分子Link5混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL4 ；iii、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL4，收集大片段，与双链DNA分子Link6混合，T4DNA连接酶连接即得。本发明步骤i先用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集质粒pSLFA1180FA中BglII与NheI之间的大片段，与双链DNA分子Link4混合，T4DNA连接酶连接后得到含有双链DNA分子Link4的质粒PSL3。本发明步骤ii用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化含有双链DNA分子Link4的质粒PSL3，收集HindIII与NheI之间的大片段，所述HindIII与NheI之间大片段含有双链DNA分子Link4，然后与双链DNA分子Link5混合，T4DNA连接酶连接后得到含有双链DNA分子Link4和Link5的质粒PSL4。本发明步骤iii用限制性核酸内切酶Nh el/Hindlll消化含有双链DNA分子Link4和Link5的质粒PSL4，收集HindIII与NheI之间的大片段，所述HindIII与NheI之间大片段含有双链DNA分子Link4和Link5，然后与双链DNA分子Link6混合，T4DNA连接酶连接得到含有双链DNA分子Link4、Link5和Link6的质粒F (1)，即含有完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。此外，本发明合成的三个双链DNA分子中，在Link4的5’端紧接BglII位点的下游还含有AgeI的识别位点，在Link6的3’端紧接HindIII位点的上游还含有NgoMIV的识别位点，AgeI和NgoMIV是一对同尾酶。在一个完整的非结晶区基因克隆完成后，获得一个含有类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (1)，然后利用Link4的5’端和Link6的3’端设计的同尾酶进行类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的加倍克隆。具体方法是用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F (I )，收集大片段，插入BamHI/NgoMIV消化F (I)获得的小片段，T4DNA连接酶连接。由于AgeI和NgoMIV为同尾酶，酶切连接后，AgeI和NgoMIV 2个位点均消失，形成了符合非结晶区氨基酸的丙氨酸Ala和甘氨酸Gly的密码子，得到含有二倍类家蚕丝素蛋白非结晶区编码基因的质粒F (2)。按照上述方法，用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F (2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有三倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(3);用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(2)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (4)。同理，按照上述方法，用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有奇数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有偶数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有奇数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒；用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有偶数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有偶数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有偶倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。当然，按照上述方法用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有奇数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有奇数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接后也可得到含有偶数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒；用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有偶数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有奇数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接后也可得到含有奇数倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。本领域技术人员可以按照上述方法，自由选择用限制性核酸内切酶BamHI与AgeI和BamHI与NgoMIV酶切含有不同倍数类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，得到含有任意倍数的非结晶区编码基因的质粒F (η)。本发明在步骤V将质粒F(1)、F(2)、F(3)和F(4)转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Agel/Hindlll双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段分别得到单倍、二倍、三倍和四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。同理，本领域技术人员可以按照上述方法将含有任意倍数的非结晶区编码基因的质粒F (η)转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Agel/Hindlll双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得任意倍数的非结晶区编码基因。之后，将得到任意倍数的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因转入表达载体pGEX-Agel 中表达即可获得不同聚合度的类家蚕丝素非结晶区蛋白。在具体实施方式
中，所述将完整的不同倍数的非结晶区基因转入表达载体中表达的方法具体为用Agel/Hindlll酶切表达载体pGEX-Agel，插入Agel/Hindlll酶切得到的任意倍数的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因，构建表达载体，然后转化大肠杆菌BL21 (DE3)诱导表达类家蚕丝素蛋白非结晶区基因即得。其中，所述的表达载体PGEX-AgeI为具有SEQID N0:8所示的核苷酸序列载体。优选的，本发明所述双链DNA分子Link4的编码链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。优选的，本发明所述双链DNA分子Link5的编码链具有如SEQ ID NO: 10所示的核
苷酸序列。优选的，本发明所述双链DNA分子Link6的编码链具有如SEQ ID NO: 11所示的核
苷酸序列。在具体实施方式
中，本发明通过对构建的含有单倍、双倍、四倍、八倍和十二倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (1)、F (2)、F (4)、F (8)和F (12)分别采用限制核酸性内切酶BamHI和限制核酸性内切酶Bglll/Hindlll进行单酶切和双酶切消化，然后将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，结果显示，与提供的标准DNA分子量(M)对比，所有质粒酶切后得到的条带均符合理论值。对质粒进行DNA测序鉴定，结果显示所有质粒中的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因全部正确，没有发生任何基因缺失或基因突变，表明本发明所述方法克隆的准确性高。本发明提供了一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法和一种克隆多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法。本发明所述方法操作简便，通过本发明所述方法获得的单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因和多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因准确性高，转入表达载体中表达即可获得类家蚕丝素非结晶区蛋白和不同聚合度的类家蚕丝素非结晶区蛋白，适合于类家蚕丝素蛋白非结晶区蛋白的大量生产。
图I示克隆单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的流程图2示克隆多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的流程图；图3示质粒pSLFA1180FA的图谱；图4示表达载体pGEX-Age I的图谱；图5示实施例3对构建的含有单倍及多倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒的BamHI酶切凝胶电泳图，其中，泳道F (12)为含有十二倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (8)为含有八倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (4)为含有四倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (2)为含有二倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (I)为含有单倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道M为DL2000DNA分子量标准(购自Takara公司)；图6示实施例4对构建的含有单倍及多倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒 的Bglll/Hindlll酶切凝胶电泳图，其中，泳道F (12)为含有十二倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (8)为含有八倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F
(4)为含有四倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (2)为含有二倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道F (I)为含有单倍的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，泳道M为DL2000DNA分子量标准(购自Takara公司)。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种克隆类家蚕丝素非结晶区基因的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。实施例I :I、编码类家蚕丝素重链核心区的非结晶区氨基酸序列的DNA分子片段的设计与合成根据丝素蛋白主要组成部分的重链核心区域非结晶区氨基酸序列及其编码基因信息，设计并合成(Invitrogen公司)了三个双链DNA分子，分别命名为Linkl、Link2和Link3。Linkl的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基。其中，所述双链DNA分子Linkl的编码链具有如SEQID NO: 5所示的核苷酸序列，所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQID N0:6所示的核苷酸序列，所述双链DNA分子Link3的编码链具有如SEQID N0:7所示的核苷酸序列。2、用限制性内切酶Nhel/Bgl 11消化pSLFAl 180FA质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下pSLFA1180FA 质粒l.ug
FastDiges产NheI (IFDU)I μ L
FastDigest^Bglii (IFDU)ΙμΙ
ΟχFastDigestrt Buffer2μΙ.
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μΕ。在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Linkl混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系
双链 DNA 分子 Link I6μ (I OOmM)
酶切后的pSLFA1180FA质粒 2pL(l%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
Τ4 DNA 连接SIΙμΕ
IOx连接酶 BLiffcrIpL
连接体系总量为ΙΟμ 。将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(Invitrogen公司)鉴定获得正确质粒，即中间质粒PSLl。3、用限制性内切酶Nhel/Hindlll消化中间质粒PSLl质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下
PSLl 质粒IiUg
FastDigestiiNheI (IFDU)Ιμ
FastDigestftHindIIi (IFDU )I μ
lOxFastDigesf" Buffer2μΙ
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL.在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Link2混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系、双链 DNA 分子 Link2 6‘uL (I OOmM)
酶切后的PSLl质粒 2μ χ %琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
Τ4 DNA连接酶IpL
I Ox连接酶 BufferΙμ
连接体系总量为lOpL。将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(Invitrogen公司)鉴定获得正确质粒，即中间质粒PSL2。4、用限制性内切酶Nhel/Hindlll消化中间质粒PSL2质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下
PSL2 质粒I pg
FastDigest^NheI (IFDU)I μL
FastDigestwHindIII (IFDU)I μ.L
I Ox FastDigest'1 Buffer2(liL
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20pL。在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Link3混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系
双链 DNA 分子 Link3 6μΙ. (IOOmM)
酶切后的PSL2质粒2μΙ^1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
Τ4 DNA连接酶Ιμ
I Ox连接酶 BufferΙμΕ
连接体系总量为l0μL.将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(InvitiOgen公司)鉴定获得含有完整单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。5、将含有完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒转化ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中培养，抽提质粒，Nhel/Hindlll双酶切，反应体系如下质粒I pg
FastDigest^ Nhel( I FDU)I μ
FastDigest^ HindIII (I FDU)I μL
I Οχ FastDigest i7 Buffer2^iL
加入灭菌蒸镏水补足体系总量至20pL。
在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行DNA凝胶电泳，回收小片段即得完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。实施例2 I、编码类家蚕丝素重链核心区的非结晶区氨基酸序列的DNA分子片段的设计与合成根据丝素蛋白主要组成部分的重链核心区域非结晶区氨基酸序列及其编码基因信息，设计并合成(Invitrogen公司)了三个双链DNA分子，分别命名为Link4、Link5和Link6。Link4的5，端和3，端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link5的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link6的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点。其中，所述双链DNA分子Link4的编码链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述双链DNA分子Link5的编码链具有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列，所述双链DNA分子Link6具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。2、用限制性内切酶Nhel/Bgl 11消化pSLFAl 180FA质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下
pSLFA1180FA 质粒Ipg
FastDigest^NheI (IFDU)IμL
FastDigestwBglII (I FDU)I pL
I Ox FastDigestif Buffer2μΙ
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20pL。在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Link4混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。 连接反应体系双链 DNA 分子 Lmk46‘uL (I OOmM)
酶切后的pSLFA1180FA质粒2pL(l%琮脂糖凝胶电泳回收的上清液)
Τ4 DNA连接酶 I Ox连接酶 BufferIiLiL
连接体系总量为ΙΟμΙ将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(Invitrogen公司)鉴定获得正确质粒，即中间质粒PSL3。
3、用限制性内切酶Nhel/Hindlll消化中间质粒PSL3质粒(所用内切酶及相应缓 冲液为fermentas产品)，反应体系如下
PSL3 质粒I .Hg
FastDigestitfNheI (I FDlJ)I μ L
FastDigest li HindIII (I FDU)I μL
I Ox FastDigestti Buffer2 μ. L
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μΕο在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Link5混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。
连接反应体系
双链 DNA 分子 Link5 6‘uL (I OOmM)
酶切后的PSL3质粒 2pL(l%琼脂糖凝肢电泳回收的上清液)
Τ4 DNA连接酶1μ[
1()χ连接酶 BufferΙμ
连接体系总量为_L。将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(Invitrogen公司)鉴定获得正确质粒，即中间质粒PSL4。 4、用限制性内切酶Nhel/Hindlll消化中间质粒PSL4质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下PSL4 质粒l.ug
FastDigesiirt NheI (I FDU)I μL
FastDigestirt HindIII (I FDU)I μL
I OxFastDigestlrt Buffer2μ[
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μLo
在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Link6混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系
双链 DNA 分子 Link66^iL (IOOmM)
酶切后的PSL4质粒2pL(l%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
Τ4 DNA连接酶IpL
I Ox连接酶 Buffer1μ[
连接体系总量为10μ 将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(InvitiOgen公司)鉴定获得含有单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (I)。5、用限制性内切酶BamHI/Agel消化F(I)质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下
F⑴质粒
FastDigestifl BamH I (IFDU)I μL
FastDiges产Agel (I FDU)I ‘liL
I Οχ FastDigestii Buffei-2μ L
加入灭菌蒸德水补足体系总量至20μL<>在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与AgeI之间大片段。用限制性内切酶BamHI/NgoMIV (所用BamHI及相应缓冲液为fermentas产品,所用NgoMIV及相应缓冲液为promega产品)消化F⑴质粒,反应体系如下F⑴质粒Ιμ$
FastDigesPBamHI (15υ/μ )IiLiL
Οχ FastDigestlrt Buffer2(uL
加入灭菌蒸镏水补足体系总量至20pL。在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀抽提DNA，再配置如下反应体系NgoMIV (lOU/μ L)I μ LIOXBuffer2 μ L
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20 μ Lo在37°C恒温水浴f2h进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与NgoMIV之间小片段将BamHI与AgeI之间大片段与BamHI与NgoMIV之间小片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系
BamHI与AgeI之间大片段 3pL(l%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)BamHI与NgoMIV之间小片段5pL(l%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
Τ4 DNA连接酶I .uL
I Οχ连接酶 BufferIpL
连接体系总量为ΙΟμ 。将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(InvitiOgen公司)鉴定获得含有双倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (2)。6、用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化双倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (2)，收集BamHI与AgeI之间大片段，与BamHI/NgoMIV消化F (2)获得的BamHI与NgoMIV之间小片段混合，T4DNA连接酶连接后得到含有四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F (4)。重复上述操作，用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化F (4)，收集BamHI与AgeI之间大片段，与BamHI/NgoMIV消化F(4)获得的BamHI与NgoMIV之间小片段混合，T4DNA连接酶连接后得到含有八倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(S)。用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化F (8)，收集BamHI与AgeI之间大片段，与BamHI/NgoMIV消化F (4)获得的BamHI与NgoMIV之间小片段混合，T4DNA连接酶连接后得到含有十二倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(12)。实施例3:用限制性核酸内切酶BamHI对实施例2获得的F (I)、F (2)、F (4)、F (8)和F
(12)进行酶切消化，反应体系如下质粒Ipg
FastDigest' BamH (IFDU)I μL
IOxF astD i gesf" B uffer2 μ L
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μ 。在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，用EB染色观察，结果如图5。图5结果可见，与提供的标准DNA分子量(M)对比，质粒F (I)、F (2)、F (4)、F(8)和F (12)酶切后得到了条带大小正确，与3381bp、3513bp、3777bp、4305bp和4833bp的理论值相符合，表明所有质粒单酶切后得到的条带均符合理论值。实施例4: 用限制性核酸内切酶Bglll/Hindlll对实施例2获得的F (I)、F (2)、F (4)、F
(8)和F (12)进行酶切消化，反应体系如下
质粒I Pg
FasiDigest^BglII (IFDU)Ιμ
FastDiges产HindIiI (I FDU)I pL
IOxFastDigestii Buffer2^iL
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μΙ。在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，用EB染色观察，结果如图6。图6结果可见，质粒F (I)、F (2)、F (4)、F (8)和F (12)酶切后均得到了 2个条带，与提供的标准DNA分子量(M)对比，所有质粒酶切后的大片段均为3237bp，与理论值相符，所有质粒酶切后的小片段分别为144、276、540、1068和1596bp，与理论值相符。表明所有质粒双酶切后得到的条带均符合理论值。实施例5:将实施例2 获得的 F (I)、F (2)、F (4)、F (8)和 F (12)送 Invitrogen 公司测序，结果显示各含有类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒中的非结晶区基因与设计的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的核苷酸片段序列一致，没有发生任何基因缺失或基因突变。实施例6:用限制性内切酶Agel/Hindl 11酶切表达载体pGEX-Agel质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品),反应体系如下
pGEX-Age丨质粒Hig
FastDiges产AgeI (I FDU)I μL
FastDiges产HindIII (IFDU)Iμ
I Οχ FastDigesf Buffer2μΙ
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μΕ。
在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，并进行DNA凝胶回收。回收片段分别与质粒F (1)、F (2)、F (4)、F (8)和 F (12) Agel/Hindlll 双酶切后获得的完整的单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区编码基因或不同倍数的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系
任意倍数的非结晶区DNA 5μL (I %琼脂糖凝胶电泳回收的上清液) 酶切后的pGEX-Agel3μ χ %琼脂糖凝胶电泳回收的上清液) Τ4 DNA连接酶IpL
I Ox连接酶 BufferIiLiL
连接体系总量为_L。将连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导表达类家蚕丝素非结晶区蛋白。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
1.一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，其特征在于，包括以下步骤 A、合成分别编码SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子；其中Linkl的5，端和3，端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基； B、将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Nhel/Hindl 11双酶切、琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得。
2.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中的具体步骤包括 a、用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSLl ； b、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL1，收集大片段，与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL2 ； C、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL2，收集大片段，与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接即得。
3.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Linkl的编码链具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link3的编码链具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列。
6.一种克隆多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，其特征在于，包括以下步骤 I、合成分别编码SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三个双链DNA分子；其中Link4的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link5的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link6的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点； II、将Link4、Link5、Link6连接到质粒pSLFA1180FA中，得到含有单倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(I)； III、用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化步骤II得到的质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(I)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有二倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(2)； IV、重复步骤III，用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F (2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有三倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(3);用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(2)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒F(4)；V、分别将质粒F(2)、F(3)和F(4)转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Agel/Hindl 11双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得二倍、三倍和四倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。
7.根据权利要求6所述克隆方法,其特征在于,所述将Link4、Link5、Link6连接到质粒pSLFA1180FA中的具体步骤包括 i、用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Link4混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL3 ； ii、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL3，收集大片段，与双链DNA分子Link5混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL4 ； iii、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL4，收集大片段，与双链DNA分子Link6混合，T4DNA连接酶连接即得。
8.根据权利要求6所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link4的编码链具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求6所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link5的编码链具有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求6所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link6的编码链具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法以及克隆不同倍数的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法。所述方法为将人工合成的末端分别含有可以配对的同尾酶的三个双链DNA分子连接到质粒中，两对同尾酶的位点分别被限制性内切酶切除后再连接，形成符合非结晶区氨基酸的三联密码子，转化、筛选获得含有完整类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，再利用在完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因5’端和3’端设计的同尾酶进行加倍克隆，转化、筛选获得含有多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。最后双酶切后得到单倍和多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。本发明所述方法操作简便，获得的基因准确性高。
文档编号C12N15/66GK102703488SQ20121014994
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者卢神州, 李明忠, 杨云星, 王建南, 裔洪根, 黄海燕 申请人:苏州大学