专利名称：一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法，即一种克隆家蚕丝素重链高度重复区与类家蚕丝素重链非结晶区重组基因的方法。
背景技术：
家蚕丝素蛋白，又称丝素蛋白，是一种结构蛋白，由包括丝素重链(H链)蛋白、丝素轻链(L链)蛋白和糖蛋白P25三个部分组成的复合体，属于结晶高聚物，分为结晶态和无定形态两大部分。其中，丝素蛋白重链是丝素蛋白的主要部分，全长5363个氨基酸，包括20种氨基酸，富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，其主要包括N末端151个氨基酸残基的非重复区域、核心区域和C末端55个氨基酸残基的非重复区域三个组成部分。而丝素重链的核心区域又分为富含甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)的高度重复区域和非重复的间隔区，其中，高度 重复区域内一般以GAGAGS重复开始，以GAAS终止。非重复间隔区，又称非结晶区，主要为GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFG 的非重复序列。研究表明家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中主要为亲水性氨基酸，其编码的多肽用作美容用品应具有比丝素粉更优的护肤保湿的功效，但是家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中含有光照易生色的酪氨酸和色氨酸，不适合用作护肤品。为了使家蚕丝素蛋白非结晶区能获得更好的应用效果(如护肤品、敷料类生物材料等的功能肽)，本发明人设计了去除了家蚕丝素蛋白非结晶区中的酪氨酸和色氨酸的编码的多肽，其氨基酸序列为GSSGFGPVANGGSGEASSESDFG,命名为类家蚕丝素蛋白非结晶区。家蚕丝素重链高度重复区与类家蚕丝素蛋白非结晶区重组序列称为类家蚕丝素蛋白重链核心区。丝素蛋白作为生物材料，要具有与组织修复匹配的生物学性能，更要具有良好的细胞相容性和组织相容性。丝素凝聚态结构(空间结构)决定其力学性质，从而影响丝素材料的应用。而凝聚态结构应取决于蛋白质自组装形成过程中的各种因素，及一级结构即氨基酸的组成和排列顺序，后者是内因。为合理科学地设计满足不同组织要求的丝素蛋白生物材料，首先必须知道丝素肽链与凝聚态结构、性能(包括机械性能和生物学性能)之间的内在规律，但关于丝素蛋白这种高分子聚合物的微观结构(肽链序列结构)与宏观结构及性能之间明确的对应关系还不清楚，目前国内外仅有几篇报导化学合成丝素蛋白短肽及其结构的研究。意大利博洛尼亚大学Taddei等指出在(GA)n的肽段中插入GS、GY或GV，分子构象由SiIkI转变为SiIkII，随着六肽GAGAGS重复单元的减少，无规卷曲增加(Taddei P, etal. Biopolymers, 2005，78:249-258)。日本东京农工大学 Asakura 等化学合成了(AG) 15,指出沿着分子链每6个残基(-GAGAGA-)产生一个由分子内氢键结合形成II型β-转角结构(Asakura T, et al. J Mol. Biol.，2001，306 (2) : 291-305.)。日本群马大学 Akira Shoji等指出(AG)5形成稳定的SilkII结构,而较长(AG)n肽段(η彡6)形成稳定的SilkI结构(Kishi S，et al. Journal of Molecular Structure,2003，649:155-167.)。另一方面，丝素蛋白作为生物材料的应用研究越来越多，但丝素蛋白在能支持、促进细胞生长、诱导组织再生的特异性序列这方面的机理研究却很少。2004年日本国立农业科学研究所Tsubouchi研究组(Biomaterials，2004, 25:467-472)将丝素用胰乳蛋白酶消化，分离出各种肽段，通过序列鉴定和细胞培养，发现丝素H链N-末端有2段基序NINDFDED和VITTDSDGNE对人皮肤成纤维细胞增殖有促进作用。为了更好地研究类家蚕丝素蛋白重链核心区组成一结构一功能之间的内在关系及其应用，需要获得大量的高纯度的类家蚕丝素蛋白重链核心区的蛋白，即各种来自于丝素蛋白核心区域结晶区的高度重复序列[GAGAGXUXiA、S、Y和V)分别与不同聚合度的类家蚕丝素重链非结晶区的序列的重组蛋白。目前人们大多采用基因工程技术(如PCR技术)或人工合成多肽技术获得重组序列，但这些方法对于类家蚕丝素蛋白重链核心区序列，即家蚕丝素重链高度重复区与类家蚕丝素重链非结晶区的重组序列并不适合。一方面，由于采用人工合成肽的方法价格昂贵，主要问题是不能合成较大分子量的多肽，所以难以获得任意聚合度及各种组合的类家蚕丝素重链核心区的蛋白，不适合类家蚕丝素蛋白的大量生产。另一方面由于我们设计的类家 蚕丝素重链非结晶区的氨基酸发生了改变，去除了家蚕丝素蛋白非结晶区中的酪氨酸和色氨酸，以防止将来重组产物研究过程中或制备的产品因光照而生色，使类家蚕丝素蛋白重链非结晶区基因不同于家蚕丝素蛋白非结晶区基因，因此按照现有的基因工程技术(如PCR技术)以现有的家蚕丝素的cDNA为模板进行克隆，有误差，无法获得与类家蚕丝素重链非结晶区核苷酸序列一致的目的片段，也就无法获得家蚕丝素重链高度重复区与类家蚕丝素重链非结晶区重组序列及可变嵌段重组序列。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简便、准确性高的克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法，包括以下步骤I、合成分别编码SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3 三个双链 DNA 分子，将 Linkl、Link2、Link3 连接到质粒 pSLFAl 180FA中，得到含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒F(I);其中Linkl的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点；II、用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化步骤I得到的质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(I)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有二倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F(2)，重复操作制得含有多倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F (η)，用限制性核酸内切酶NgoMIV/Agel消化质粒F (I)、F⑵或F (η)，琼脂糖凝胶电泳收集小片段备用，其中η为大于2的正整数；III、用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的载体质粒，分别与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集的小片段连接，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒。BglII/Nhel双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得；其中所述载体质粒在编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的5’端含有AgeI的结合位点，所述X为A、S、Y或V，所述m为正整数。本发明通过对类家蚕丝素重链核心区的非结晶区氨基酸序列及其编码基因的分析，将类家蚕丝素非结晶区氨基酸序列分为如SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:2,SEQ ID N0:3所示的三段氨基酸序列，设计了编码SEQ ID NO: K SEQID NO:2, SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子。本发明所述Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子的5’端和3’端含有可以配对的同尾酶，如Linkl的3’端限制性核酸内切酶NheI与Link2的5’端限制性核酸内切酶SpeI是一对同尾酶；Link2的3’端和Link3的5’端也是一对同尾酶Nhel/Spel。当三段基因连接后，两对同尾酶的位点NheI和SpeI被限制性内切酶切除后连接，形成符合非结晶区氨基酸的丙氨酸Ala和丝氨酸Ser的三联密码子。优选的，本发明所述克隆方法步骤II将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFAl 180FA中的具体步骤包括i、用限制性核酸内切酶Nhel/BglII消化质粒pSLFAl 180FA，收集大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSLl ；i i、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindl 11消化质粒PSLl，收集大片段，与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL2 ；iii、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL2，收集大片段，与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接即得。本发明步骤i先用限制性核酸内切酶Nhel/BglII消化质粒pSLFAl 180FA，收集质粒pSLFAl 180FA中BglII与NheI之间的大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到含有双链DNA分子Linkl的质粒PSLl，其中，所述的质粒pSLFAl 180FA为具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列质粒。本发明步骤ii用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化含有双链DNA分子Linkl的质粒PSLl，收集HindIII与NheI之间的大片段，所述HindIII与NheI之间大片段含有双链DNA分子Linkl，然后与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到含有双链DNA分子Linkl和Link2的质粒PSL2。 本发明步骤i i i用限制性核酸内切酶Nhel/Hindl 11消化含有双链DNA分子Linkl和Link2的质粒PSL2，收集HindIII与NheI之间的大片段，所述HindIII与NheI之间大片段含有双链DNA分子Linkl和Link2，然后与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接得到含有双链DNA分子Linkl、Link2和Link3的质粒F (I),即含有完整的类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒。优选的，本发明所述双链DNA分子Linkl的编码链具有如SEQ ID NO: 5所示的核
苷酸序列。优选的，本发明所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQ ID NO:6所示的核
苷酸序列。 优选的，本发明所述双链DNA分子Link3的编码链具有如SEQ ID NO: 7所示的核
苷酸序列。将含有完整的类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定可获得正确的含有完整的类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒。此外，由于本发明合成的三个双链DNA分子中，在Linkl的5’端紧接BglII位点的下游还含有AgeI的识别位点，在Link3的3’端紧接HindIII位点的上游还含有NgoMIV的识别位点，AgeI和NgoMIV是一对同尾酶。在一个完整的非结晶区基因克隆完成获得一个含有类家蚕丝素蛋白类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒F (I)后，本发明步骤II利用Linkl的5’端和Link3的3’端设计的同尾酶进行类家蚕丝素重链非结晶区基因的加倍克隆。具体方法是用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F( I )，收集大片段，插入BamHI/NgoMIV消化F (I)获得的小片段，T4DNA连接酶连接。由于AgeI和NgoMIV为同尾酶，酶切连接后，AgeI和NgoMIV 2个位点均消失，形成了符合非结晶区氨基酸的丙氨酸Ala和甘氨酸Gly的密码子，得到含有二倍类家蚕丝素重链非结晶区编码基因的质粒F (2)。按照上述方法，重复操作制得含有多倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F(n)，η为大于2的正整数。
即用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F (I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有三倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒F(3);用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化质粒F(2)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F (2)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有四倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒F(4)。同理，按照上述方法，用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有奇数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有偶数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有奇数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒；用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有偶数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有偶数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有偶倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒。当然，按照上述方法用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有奇数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有奇数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接后也可得到含有偶数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒；用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化含有偶数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化含有奇数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接后也可得到含有奇数倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒。本领域技术人员可以按照上述方法，自由选择用限制性核酸内切酶BamHI与AgeI和BamHI与NgoMIV酶切含有不同倍数类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒，得到含有任意倍数的非结晶区编码基因的质粒F (η)。本领域技术人员也可以按照现有方法将质粒F(I)、F(2)、F(η)转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒。本发明步骤II用限制性核酸内切酶NgoMIV/Agel消化鉴定正确的质粒F (I) {⑵或F(n)，琼脂糖凝胶电泳收集小片段，即不同倍数的类家蚕丝素蛋白重链核心区基因，其中η为大于2的正整数。本发明所述克隆方法步骤III用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码家蚕丝素蛋白重链核心区肽段(GAGAGX) m的基因序列的载体质粒，所述载体质粒在编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的5’端含有AgeI的结合位点，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集的小片段连接获得含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复的基因序列的重组质粒。即用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的载体质粒，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集质粒F(I)所得的小片段连接，即限制性核酸内切酶NgoMIV/Agel消化质粒F(I)获得的单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因，插入含有编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的载体质粒中，获得含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复的基因序列的质粒。同理，按照上述方法，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集质粒F(2)所得的小片段连接，获得含有二倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复的基因序列的质粒。当然，按照上述方法，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集质粒F(n)所得的小片段连 接，即可获得含有多倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复序列的基因序列的质粒。本发明所述η为大于2的正整数，即本发明所述质粒F(n)为F(3)、F(4)、F(5)、F(6)等含有两倍以上类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒。在具体实施方式
中，所述η为大于2且小于等于12的正整数，即本发明所述含有多倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒为含有三倍到十二倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒。上述步骤所述m为正整数。在具体实施方式
中，所述m为小于等于16的正整数，即本发明所述重链核心区肽段单元高度重复序列GAGAGX的基因序列的倍数为f 16倍。其中所述本发明载体质粒优选为pCDNA- (GX) m，即pCDNA- (GA) m、pCDNA- (GS) m、P⑶NA-(GY)m或p⑶NA-(GV)m, m为正整数。在具体实施方式
中，所述m为小于等于16的正整数，即本发明所述重链核心区肽段单元高度重复序列GAGAGX的基因序列的倍数为f 16倍。在一个具体实施方式
中，本发明所述克隆方法步骤III所述含有编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的载体质粒为pCDNA-(GA)16，其编码链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。本发明所述克隆方法步骤III所述含有编码含有编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的载体质粒还可以为 pCDNA- (GS) 16、pCDNA- (GY) 16 或 pCDNA- (GV) 16，所述 pCDNA- (GS) 16、pCDNA- (GY) 16或pCDNA-(GV)16，编码链分别具有如SEQ ID N0:9 11所示的核苷酸序列。本发明所述克隆方法步骤III另一种系列重组方式用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码(GAGAGX)m的基因序列的载体质粒。所述载体质粒在编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的5’端含有AgeI的结合位点，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集的小片段连接获得含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区肽段单元GAGAGX高度重复的基因序列的重组质粒。即用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的载体质粒，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集质粒F(I)所得的小片段连接，即限制性核酸内切酶NgoMIV/Agel消化质粒F(I)获得的单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因，插入含有编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的载体质粒中，获得含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区肽段单元GAGAGX高度重复的基因序列的质粒。
同理，按照上述方法，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集质粒F(2)所得的小片段连接，获得含有二倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区肽段单元GAGAGX高度重复的基因序列的质粒。当然，按照上述方法，与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集质粒F(η)所得的小片段连接，即可获得含有多倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区肽段单元GAGAGX高度重复序列的基因序列的质粒。此步骤所述η为大于2的正整数，本发明中此步骤选择含单倍和二倍的类丝素非结晶区基因序列F(I)和F(2)与不同倍数的GAGAGX高度重复的基因序列进行重组研究。此步骤所述m为正整数。在具体实施方式
中，所述m为小于等于16的正整数，即本发明所述重链核心区肽段单元高度重复序列GAGAGX的基因序列的倍数为f 16倍。本发明所述克隆方法步骤III所述含有编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的载体质粒可以利用现有的基因工程技术制备得到。在具体实施方式
中，所述含有编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的载体质粒参照《类蚕丝丝素结晶区蛋白表达载体的构建与表达》(蚕业科学，2006, 32(1) :36-41)中的方法制备得到，具体包括步骤I、用NgoM IV酶切pCDNA 3. 1B-H后自连构建pCDNA-Ι，然后经Nhel/Mlul双酶切、DNA聚合酶I补平构建pCDNA-2，再用Hindlll/Nhel双酶切pCDNA-2，接入接头pb_pa、pb-ps、pb-py 或 pb-pv 构建 pCDNA-(GX) I, X 为 A、S、Y 或 V ；步骤2用限制性内切酶AgeI/ScaI、ScaI/NgoM IV酶切pCDNA-(GX) I，分别回收载体大片段和编码GAGAGX肽段基因序列的小片段，利用T4DNA连接酶连接得到p⑶NA- (GX) 2，重复操作制得含有(GAGAGX)多倍重复的基因序列载体质粒P⑶NA-(GX)m。本发明步骤III将获得含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和单倍重链核心区高度重复序列GAGAGX肽段基因序列的重组质粒转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Bglll/Nhel双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得类家蚕丝素蛋白重链核心区基因。同理，将获得含有多倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复序列GAGAGX肽段基因序列的重组质粒转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Bglll/Nhel双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得不同聚合度的类家蚕丝素重链非结晶区的基因与不同倍数重链核心区高度重复序列GAGAGX肽段基因的重组基因。本领域技术人员，可以将得到类家蚕丝素蛋白重链核心区基因转入表达载体中表达即可获得类家蚕丝素蛋白重链核心区蛋白。同理将不同聚合度的类家蚕丝素重链非结晶区的基因与不同倍数重链核心区高度重复序列GAGAGX肽段基因的重组基因转入表达载体中表达可获得不同倍数家蚕丝素重链高度重复区与不同聚合度类家蚕丝素重链非结晶区的重组蛋白。在具体实施方式
中，所述转入表达载体中表达的方法具体为用Agel/Hindlll酶切表达载体pGEX-Agel，插入得到的类家蚕丝素蛋白重链核心区基因序列，构建表达载体，然后转化大肠杆菌BL21 (DE3)诱导表达即得。其中，所述的表达载体pGEX-Agel为具有SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列载体。在具体实施方式
中，本发明通过对构建的含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区的基因与四种十六倍重链核心区高度重复序列肽段基因的重组基因质粒(gs)16+f(i)、(GA) 16+F(1)、(GY) 16+F(1)和(GV) 16+F(1)，分别采用限制核酸性内切酶HindIII和限制核酸、性内切酶Bglll/Nhel进行单酶切和双酶切消化，然后将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，结果显示，与提供的标准DNA分子量(M)对比，所有质粒酶切后得到的条带均符合理论值。对质粒进行DNA测序鉴定，结果显示所有质粒中的基因序列全部正确，没有发生任何基因缺失或基因突变，表明本发明所述方法克隆的准确性高。本发明提供了一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法。本发明所述方法操作简便，通过本发明所述方法获得的类家蚕丝素蛋白重链核心区基因准确性高，转入表达载体中表达即可获得高纯度的类家蚕丝素蛋白重链核心区的蛋白以及四种来自于丝素蛋白核心区域结晶区的高度重复序列[GAGAGXUXiA、S、Y和V)与不同聚合度的类家蚕丝素重链非结晶区的基因重组序列的重组蛋白，适合于类家蚕丝素蛋白重链核心区蛋白的大量生产。本发明所述方法还可以获得家蚕丝素重链高度重复区与类家蚕丝素重链非结晶区的各种嵌段组合，为能系统地揭示家蚕丝素蛋白重链序列-结构-功能的关系提供研究方法。
图I示质粒pSLFAl 180FA的图谱； 图2示以质粒P⑶NA-(GS)16为例的含家蚕丝素重链核心区高度重复序列基因的质粒图谱；图3示表达载体pGEX-Age I的图谱；图4示实施例6对构建的含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和四种十六倍重链核心区高度重复序列肽段基因的重组基因质粒的HindIII酶切凝胶电泳图，其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(购自Takara公司);泳道A为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGS肽段基因的重组基因质粒(GS)16+F(1);泳道B为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGA肽段基因的重组基因质粒(GA)16+F(1);泳道C为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGY肽段基因的重组基因质粒(GY)16+F(1);泳道D为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGV肽段基因的重组基因质粒(GV)16+F⑴；图5示实施例7对构建的含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和四种十六倍重链核心区高度重复序列肽段基因的重组基因质粒的Bglll/Nhel酶切凝胶电泳图，其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(购自Takara公司)；泳道A为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGS肽段基因的重组基因质粒(GS)16+F(1);泳道B为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGA肽段基因的重组基因质粒(GA)16+F(1);泳道C为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGY肽段基因的重组基因质粒(GY) 16+F⑴；泳道D为含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因和十六倍重链核心区高度重复序列GAGAGV肽段基因的重组基因质粒(GV) 16+F (I)。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种克隆类家蚕丝素非结晶区重组基因的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。实施例I :I、编码类家蚕丝素重链核心区的非结晶区氨基酸序列的DNA分子片段的设计与合成根据丝素蛋白主要组成部分的重链核心区域非结晶区氨基酸序列及其编码基因信息，设计并合成(Invitrogen公司)了三个双链DNA分子，分别命名为Linkl、Link2和Link3。Linkl的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点。其中，所述双链DNA分子Linkl的编码链具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述双链DNA分子Link3具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列。2、用限制性内切酶Nhel/Bgl 11消化pSLFAl 180FA质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下
pSLFAl I觀FA 质粒Ipg
]<nsii)iuesl,fNhe[ (!l;i)U)IjiL
l-iisfDigesl'Bglli (II DlI)Ιμ 在37°C恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收。回收片段与合成的双链DNA分子Linkl混合，在T4DNA连接酶的作用下4°C连接过夜(8 12h)。连接反应体系
双链 DNA 分子 Unk I(ψ (I OOmM) 酶切后的pSLFAl丨肋FA质粒2μ141%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液) Τ4 DNA连接導Ιμ I Οχ连接酶 BufferΙμ 连接体系总量为mpU将连接产物转化入ToplO感受态细胞，铺于含氨苄青霉素抗生素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素抗生素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序(Invitrogen公司)鉴定获得正确质粒，即中间质粒PSLl。3、用限制性内切酶Nhel/Hindlll消化中间质粒PSLl质粒(所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品)，反应体系如下
权利要求
1. 一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法，其特征在于，包括以下步骤 1.合成分别编码SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子，将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中，得到含有单倍类家蚕丝素重链非结晶区基因的质粒F(I);其中Linkl的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，在紧接其HindIII位点的上游含有NgoMIV的识别位点； II、用限制性核酸内切酶BamHI/Agel消化步骤I得到的质粒F(I)，收集大片段，与BamHI/NgoMIV消化质粒F(I)获得的小片段混合，T4DNA连接酶连接得到含有二倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F(2)，重复操作制得含有多倍类家蚕丝素蛋白重链核心区基因的质粒F (n)，用限制性核酸内切酶NgoMIV/Agel消化质粒F (I)、F (2)或F (n)，琼脂糖凝胶电泳收集小片段，其中n为大于2的正整数； III、用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的载体质粒与步骤II琼脂糖凝胶电泳收集的小片段连接，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Bglll/Nhel双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得家蚕丝素重链高度重复区几种典型基序与类家蚕丝素重链非结晶区的重组基因；其中所述载体质粒在编码(GAGAGX) m肽段的基因序列的5’端含有AgeI的结合位点，所述X为A、S、Y或V，所述m为正整数。
2.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中的具体步骤包括 i、用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSLl ； ii、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSLl，收集大片段，与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL2 ； iii、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL2，收集大片段，与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接即得。
3.根据权利要求2所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Linkl的编码链具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link3的编码链具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述n为大于2且小于等于12的正整数。
7.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述m为小于等于16的正整数。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开一种克隆类家蚕丝素蛋白重链核心区重组基因的方法，即克隆来自于家蚕丝素重链高度重复区几种典型基序与类家蚕丝素重链非结晶区重组基因的方法。所述方法为将人工合成的末端分别含有配对同尾酶的三个双链DNA分子连接到质粒中并加倍，获得含有不同倍数类家蚕丝素蛋白重链非结晶区基因的质粒，酶切后插入到用限制性核酸内切酶AgeI消化的含有编码(GAGAGX)m肽段的基因序列的载体质粒中，获得含有不同倍数类家蚕丝素重链非结晶区基因和不同倍数重链核心区高度重复序列GAGAGX肽段基因的重组质粒，最后双酶切即得各重组基因。本发明所述方法操作简便，获得的类家蚕丝素蛋白重链核心区基因准确性高。
文档编号C12N15/10GK102703425SQ201210149948
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者卢神州, 李明忠, 杨云星, 王建南, 裔洪根, 黄海燕 申请人:苏州大学