、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
[0034] 按常规方法对所有35日龄小猪注射PolyI:C后4小时内采血。
[0035] 二、T细胞亚群测定
[0036] 试剂采用英国Southernbiotech公司的小鼠抗猪⑶3单克隆抗体、小鼠抗猪⑶8 单克隆抗体及小鼠抗猪⑶4单克隆抗体。主要仪器采用美国Beckman-Coulter公司的EPICS ALTRA流式细胞仪，488nm激发光源，EXP032软件进行分析。流式检测分析方法：流式管加 入6y1混合抗体，留下一管做空白对照。加入猪抗凝血30y1，混匀，避光孵育20min。加 入流式细胞溶血试剂2ml混匀，室温避光孵育13min，直至液体澄清透明。1500r/min离心 5min,去掉上清液。2ml的PBS清洗，1500r/min离心5min，将细胞悬浮于0. 5ml的PBS中， 震荡混匀后上机检测。
[0037] 三、猪基因组DNA的提取与检测
[0038] 试验采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒（TIANampGenomic DNAKit，按照试剂盒的说明书操作）从猪（杜洛克与二花脸杂交所得的F2群体）血液中 提取猪基因组DNA，具体操作步骤如下：
[0039] 1)将采自试验猪的猪血液加入抗凝管，加200 y 1裂解液，加入200 y 1缓冲液体 GA(该试剂盒自带），振荡至彻底悬浮。
[0040] 2)加入20y1蛋白酶K溶液（该试剂盒自带），混匀，置于56°C水浴锅消化过夜。
[0041] 3)加入200y1缓冲液GB(该试剂盒自带），充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶 液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0042] 4)加入200 y 1无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0043] 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(~13, 400Xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0044] 6)向吸附柱CB3中加入500y1缓冲液⑶（该试剂盒自带），12000rpm离心30秒， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0045] 7)向吸附柱CB3中加入600y1漂洗液PW(该试剂盒自带），12000rpm离心30秒， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0046] 8)重复操作步骤7)。
[0047] 9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,OOOrpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0048] 10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200y1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,OOOrpm离心2分钟，将溶液收集到离心管 中。
[0049] 11)取2yL上一步所得的DNA溶液和1yL加样缓冲液混匀，上样于1. 2%的琼脂 糖凝胶，120V电压电泳20分钟左右，紫外灯下观测电泳结果并拍照，以判断DNA的完整性。 用NanoDrop2000 核酸蛋白分析仪（ThermoFisherScientific，USA)对提取后的DNA进 行质量检测，A260/A280的比值在1. 7-2. 1之间，A260/A230在1. 8-2. 2之间被判定为合格。 对合格的DNA进行浓度测定，然后将浓度统一稀释至200ng/yL，放入-20°C的冰箱存放。不 合格的DNA样品则需要重新提取。
[0050] 四、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控
[0051] 将293头试验猪血液中提取的基因组DNA样品在Illumina公司研制的 PorcineSNP60BeadChips全基因组芯片上杂交，步骤根据iScan系统（Illumina，USA)标准 说明书操作。该芯片中包含61177个SNP位点。
[0052]米用PLINK软件（http://pngu.mgh.harvard,edu/~purcell/plink/)对所有个 体的原始基因型数据进行质控检验，以SNP基因型检出率（SNPcallrate)>90%、最小等 位基因频率（minorallelefrequency,MAF) >0.01、哈代-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)检验的P值 <10e_6 以及样本检出率（samplecallrate) >90%等指标 为标准。
[0053] 五、数据整理与分析
[0054] 1)表型数据分析
[0055] 利用R统计分析软件（http://www. r-project. org/)，对血液T细胞亚群测定值， 进行正态转化。
[0056] 2)全基因组关联分析
[0057]米用GAPIT软件（http://www.maizegenetics.net/# !gapit/cmkv)，进行GWAS 分析。申请人运用下述混合线性模型分析数据。模型公式为：
[0058] Y = X 0 +Zu+e,
[0059] 其中，Y为处理后的性状值；0为固定效应，y为随机加性效应；X和Z为已知设 计矩阵；e为未观测到的残基向量。
[0060] 3)检验SNP与性状关联的显著性。
[0061] 当某个SNP符合P〈l〇e-8条件时，我们就判定这个SNP达到了全基因组的基因组 水平显著。
[0062] 4)SNP定位和注释
[0063]根据芯片SNP信息，在Ensembl网站（www.ensembl.org)的SusscrofaBuid10. 2 数据库中，运用VariantEffectPredictor工具，注释该SNP，即确定SNP位点所在染色体 及其在染色体上的物理位置，并由此确定这些显著SNPs在Ensembl数据库中是已知基因的 内部还是侧翼区域内。然后利用生物信息学方法，根据Ensembl、NCBI(www.ncbi.nlm.nih. gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等网站提供的基因结构、基因类型、基因功能和通 路等信息，对目标区域内的基因进行功能注释。进一步确定与猪T细胞亚群性状相关联的 SNPs〇
[0064] 5)单倍型分析
[0065] 选定染色体上包含所有与T细胞亚群相关的显著SNPs的区域，并利用 Haploview(Version4. 2)进行连锁不平衡分析和单倍型分析。具体步骤如下：将分析的SNP 相应的map文件和ped文件导入到Haploview软件中进行分析。其中，map文件有两列，一 列是SNP的ID号，一列是该SNP在染色体上的位置（参照NCBI数据库猪10. 2版的基因 组）；ped文件的前六列是固定的，依次为家系ID、个体ID、父本ID、母本ID、性别（"1"代 表公畜；"2"代表母畜），表型值，第七列后是基因型。在Haploview软件中点击LDplot可 以得到连锁单倍型图，并可输出两个SNP(MARC0028162和ALGA0105397)的连锁不平衡系数 0'）用来判断是否存在连锁不平衡，并可得到基因型的频率值。
[0066] 六、结果分析
[0067] 利用R统计试验猪血液T细胞亚型数目表型性状数据检测统计结果见表1-3所 述。
[0068] 表1 T细胞亚型数目表型性状
[0069]
【主权项】
1. 一个猪T细胞亚群性状SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如 下所示： GGATTTTAAATATCTTGGCAAAACARGAGAAAGTTGGTATTAGAATCCTTA上述序列的第26位的碱基R是A或G，该突变导致多态性。
2. -个猪T细胞亚群性状SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如 下所示： CAGGAATTTGGGCAGAGCTGGGTTGRGGAAGTCTCCGGTGTGAGGTGGCCT上述序列第26位中的碱基R是A或G，该突变导致多态性。
3. 权利要求1或2所述的分子标记单独或组合使用在检测猪T细胞亚群性状中的应 用。
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种检测猪T细胞亚群性状的SNP分子标记。本发明包括所述的与T细胞亚群性状相关的SNP分子标记和由这两个SNP构成的单倍型定位及应用。本发明的SNP分子标记由全基因组关联分析中得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的26bp处存在一个等位基因的突变，导致多态性。利用所得到的SNP分子标记经单倍型分析得到一个如图6所示的相应的单倍型。本发明的标记及单倍型可用于猪T细胞亚群性状相关检测中。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104711346
【申请号】CN201510089345
【发明人】赵书红, 陈俭海, 朱猛进, 李世军, 刘向东, 李新云, 曹建华, 李长春, 谢胜松
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年2月27日