与菠菜性别基因y共分离的分子标记s5.7及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子遗传育种领域，具体涉及与菠菜性别基因Y共分离的的分子 标记S5. 7及其应用。
【背景技术】
[0002] 菠菜（SpinaciaoleraceaL.)，别名波斯草、赤根菜，黎科菠菜属作物，栽培历史 悠久，是我国重要的蔬菜作物之一。菠菜营养丰富，抗寒性强，适应性广，生产周期短，复种 指数高，产量产值高，深受生产者和消费者欢迎。
[0003] 菠菜一般是雌雄异株作物，少量植株表现为雌雄同株。菠菜性型受遗传因素和环 境因素的影响。Rosa等（1925)认为菠菜性型主要受遗传因子控制，并不受土壤肥力、株间 距离、光照强弱、种植期等外界因素的影响。Nicolaisen等（1940)报道菠菜性型受外界 环境因素的影响，在瘠薄土地上生长时多雄株，夏播比秋播多雌株。Janick等（1955)研 宄表明菠菜性型受环境条件的影响，高温短日照能使雄性增强雌性减弱，日温26. 6°C、夜温 24°C比日温21°C、夜温18°C有增加雄性的趋势；不论温度高低，在15~18h光照下都比在 12h光照下多雌株雌花，但是温度愈高则长短日之间的差异愈小。Ge〇rge(1985)研宄表明 少数菠菜品种性型仅受遗传因子的控制，而不受其他环境因子的控制。徐跃进等（1996)对 65个菠菜品种的性型表现进行调查分析，植株群体雌雄比约为1: 1，但是有1/3的品种雌雄 之比不符合1: 1，进一步对其中的4个品种进行分析，其中潍坊尖叶的性型表现仅受遗传因 子控制，而其它3个品种的性型既受遗传因子控制，也受环境因子影响。
[0004] 国内外学者普遍认为菠菜的性型遗传主要受存在于性染色体上的一对X和Y基因 的控制，菠菜植株群体中雌雄比约为1:1，但是可能同时还受其它的基因控制，据此提出了 不同的假说，但是至今还没有一种得到普遍认同。Janick等（1954)经过研宄认为性基因 型为XX的植株表现为雌株，XY型的植株为能结少量或不结种子的雄株，YY型的植株为不 能结籽的雄株。Janick等（1955,1961，1963)还认为雌雄同株性别受另一个与X及Y等位 的基因Xm控制，另有一些修饰基因影响雌花和雄花的比例，即雌雄同株性状是由Xm基因控 制的，Xm和X和Y是等位基因，XmXm的表型是雌雄异花同株而多雄花，XmX为雌雄异花同株 而多雌花，XX为雌株（谭其猛，1980)。Bemis和Wilson(1953)经过研宄提出性别连锁基因 平衡假说，认为除性染色体（X/Y)外，在常染色体上还存在二对强连锁的性平衡基因Aa和 Gg，A能使XX株表现为雌两性株，G能使XY株表现为雄两性株。当二对基因呈平衡状态时， 如AG/AG或AG/ag或ag/ag时，XX为纯雌株，XY为纯雄株。但在发生交叉、互换破坏平衡 后，就产生两性株。白密斯等的假说，虽大体上能解释一些遗传现象，但缺乏充分的后代验 证（谭其猛，1980)。
[0005] 菠菜在苗期难以区分雌雄株，菠菜只有生长至抽薹期时，性型表型才能有效区分， 因此为更早对菠菜植物性型进行鉴定及提升育种效率，国内外针对菠菜性型进行分子标记 研宄，获得了一些与性型基因连锁的分子标记。Akamatsu(1998)开发与菠菜X/Y位点连锁 的分子标记T11A、V20A，可用于鉴别菠菜雌雄植株。Khattak等（2006)认为菠菜性型受X/ Y位点控制，用AFLP和SSR技术构建菠菜的七个遗传连锁图，总长为580cM，标记间平均距 离为5. 18cM，X/Y位点被定位在连锁群3上较小的遗传区域内，与SSR标记S04相距1. 9cM。 Onodera等（2011)利用BSA法筛选到10个AFLP标记与菠菜X/Y位点紧密连锁，4个标记 与Y位点共分离；验证已发表的与Y位点连锁的SSR标记T11A、V20A，其均于Y位点连锁； 发现了一个单独的、不完全显性的强雄两性基因，其与X/Y位点连锁标记S04相距4. 3cM， 证实雌雄同株决定基因不是X/Y位点的等位基因，但是与X/Y位点紧密相连。目前国内外 已发表的与菠菜性别基因Y连锁标记有4个，第一个是T11A、V20A与菠菜性别基因Y共分 离，但是在大群体验证时V20A扩增效果不够稳定，T11A与Y共分离；第二个是S04,其与菠 菜性别基因Y相距4. 3cM，在群体中验证时不连锁，在该基因片段上开发另外的SSR进行分 析，遗传距离约为llcM;第三个为杨金华（2009)通过ISSR分析，筛选到一个与雌性相关的 标记，全长1176bp，并将其转化为SCAR标记，该标记在群体中验证时不连锁。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种与菠菜性别基因Y共分离的分子标记。
[0007] 本发明另一目的是提供一种利用分子标记鉴别菠菜性别的方法。
[0008] 为实现本发明的目的，首先利用菠菜杂交一代商业品种冬绿1号（F1)中的雌株X 雄株构建F2群体，提取343个F2单株的基因组DNA，研宄菠菜性别基因的遗传基础，利用SRAP标记筛选与性别基因连锁的分子标记，对连锁的特异片段进行克隆测序，并将其转化 成SCAR标记，利用转化成功的SCAR标记在菠菜其他7个群体中进行雌雄性别鉴定，分子标 记鉴定结果与表型鉴定结果一致。
[0009] 本发明提供的与菠菜性别基因Y共分离的分子标记为SCAR标记S5. 7,在菠菜雄 株里可以扩出了 126bp的特异条带，在雌株里没有扩出条带。性别基因Y位于菠菜Y染色 体上，SCAR标记S5. 7与Y基因共分离，处在Y染色体特异片段上。
[0010] 进一步地，本发明的SCAR标记S5. 7通过以下特异性引物对扩增获得：
[0011] 上游引物F:5' -TGAGTCCAAACCGGAAGTCGTATC-3'
[0012] 下游引物R: 5' -TGACTGCGTACGAATTCAAGATAAAT-3 '。
[0013] 本发明提供了用于检测SCAR分子标记S5. 7的特异性引物对，其为：
[0014]上游引物F :5，-TGAGTCCAAACCGGAAGTCGTATC-3，(SEQ ID NO. 2)
[0015]下游引物R:5，-TGACTGCGTACGAAITCAAGATAAAT-3'(SEQIDNO. 3)〇
[0016] 本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。
[0017] 本发明提供了分子标记S5. 7在菠菜性别鉴定中的应用。
[0018] 本发明提供了分子标记S5. 7在菠菜分子标记辅助育种中的应用。
[0019] 本发明提供了SEQIDNO. 2-3所示的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂 盒在菠菜性别鉴定中的应用。
[0020] 本发明提供了SEQIDNO. 2-3所示的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂 盒在菠菜分子标记辅助育种中的应用。
[0021] 本发明还提供了一种鉴定菠菜性别的方法，包括以下步骤：
[0022] (1)提取待测菠菜的基因组DNA;
[0023] (2)以待测菠菜的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO. 2-3所示的特异性引物对进 行PCR扩增反应；
[0024] (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，若扩出了 126bp的特异条带，则为雄性， 若无扩增条带，则为雌性。
[0025] 上述方法中，步骤（2)中PCR扩增反应10yL体系为：20-25ng/yLDNA2yL， 10uM上、下游引物各 0.2yL，10XPCRbufferlyL，2.5mMdNTP0.8yL，Taq酶