一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于血液制品领域，设及血浆的综合利用，尤其设及从制备人血白蛋白的 废弃物中回收制备抗凝血酶IIIW及多种功能蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 血液蛋白制品由健康人的血液、血浆或特异免疫人血浆分离提纯制成的有明确临 床应用意义的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子 (天然或重组的）、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防，在临床上发挥着重要 作用。
[0003] 血浆蛋白的分离纯化，根据各种血浆蛋白的理化性质或生物特性的不同对其进行 分离。目前采用的方法有低溫乙醇法、层析法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇沉淀法和热 乙醇法等等。其中低溫乙醇法又称Cohn法，是由E.J.Cohn等发明的采用冷乙醇分离人血浆 蛋白的方法，包括一系列改进。运些方法目前仍被国内外血液制品企业广泛采用。例如，美 国、日本主要是用Cohn6+9法(CohnH3ncl巧法），而西欧国家则使用Nitschmann和Kistler法 (简称N-K法）。我国的生产单位根据各自情况分别采用运两种方法。
[0004] Cohn法采用一系列不同浓度的乙醇对人血浆进行分级沉淀，富集和分离目标产 品。W经典的N-K法为例，可把血浆蛋白分级为I-V的组分，其中分别制备成人血白蛋白（组 分V)、凝血因子(组分I)和人免疫球蛋白（组分ΙΙ+ΙΠ )，组分IV则被当成废弃物。
[0005] 表1. N-K法分离血浆蛋白的组分
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[0007] Cohn组分IV沉淀(Cohn F IV)作为低溫乙醇法中的废弃组分，其中含有多种具有 药用价值的血浆蛋白。沉淀中的主要蛋白成分(见表1)为白蛋白和一些血浆中含量较少的 微量蛋白，如运铁蛋白、AT-III(抗凝血酶ΙΙΙ)、α1-ΑΤ(α1-抗膜蛋白酶)和结合珠蛋白等。运 些蛋白中间，目前具有实际临床应用价值的蛋白主要是ΑΤ-ΙΙΙ和α1-ΑΤ，其他几种微量蛋白 在成药性方面目前还处于研究阶段。国外已有多种ΑΤ-ΙΙΙ和α1-ΑΤ制品上市，而国内目前还 没有AT-III和α1-ΑΤ制品进入市场，特别是在现在血浆蛋白产品市场供应短缺的情况下，从 Cohn法组分IV沉淀中回收运些功能蛋白具有重要意义。
[000引目前已有大量从Cohn法组分IV沉淀中回收单一功能蛋白的报道。例如，吴强等公 开了一种从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的方法，采用阳G沉淀加两步肝素亲和层析，获 得的AT-III比活为6.9IU/mg，参见专利201210544111.X。采用运种方式制备AT-III在规模 化生产时需要大量的PEG和肝素亲和凝胶，其最大的缺点就是制备成本较高。胡吉军等人公 开了采用一步肝素亲和层析法从Cohn法组分IV沉淀中制备ΑΤ-ΠΙ的专利，参见专利 200310030446.4。运种方法虽然成本较小，但是制备的AT-III比活度不高，纯度也难达到 100%。从组分IV沉淀中回收各种功能蛋白，在投浆量较小的情况下，如何既能有效的降低 投入产出比，又能得到质量属性相对较高的产品是目前国内血液制品行业面临的一个难 题，现有制备AT-III的主流工艺基本都采用PEG沉淀加肝素亲和层析或两步肝素亲和层析， 且都是一种单一制品的制备模式，运些方式要么成本较高，要么质量标准不高。
[0009] 另外，叶生亮等公开了 一种从Cohn法组分IV沉淀中分离纯化α 1-AT制剂的工艺，分 别采用阳离子交换层析CM Seipharose FF和阴离子交换层析Q Sepharose FF获得α1-ΑΤ，比 活为0.94PU/mg，纯度达95%W上，活性回收率为38.2%，参见《中国输血杂志》，2012(51): 65-66，但是采取运种方法却无法有效的将白蛋白和α 1 -抗膜蛋白酶进行分离。
[0010] 近年来也有一些Cohn法组分IV沉淀综合利用，同时回收多种功能蛋白的报道。例 如，白高英等报道对Cohn法组分IV沉淀预处理液首先进行疏水层析，分成Ξ个组分:第一组 分采用离子交换层析得到运铁蛋白；第二组分采用离子交换层析得到α1-ΑΤ;第Ξ组分采用 肝素亲和层析分别得到ΑΤ-ΙΙI和白蛋白，获得的ΑΤ-ΙΙI、α 1-ΑΤ收率分别为70%和65%，参 见2010年兰州大学硕±学位论文《Cohn组分IV沉淀中血浆蛋白的分离工艺及过程自动化研 究》。苏志国、李岩等公开了一种综合利用Cohn法组分IV沉淀的方法，作者采用不同抑的溶 液对沉淀进行分步溶解，将不同的蛋白富集在不同的pH缓冲液中，再将溶出液用离子交换 层析进行处理，最后得到了AT-III、α1-ΑΤ、铜蓝蛋白W及白蛋白等蛋白，参见专利 CN201210438973.4dW上两种Cohn法组分IV沉淀的综合利用方法只是实验室规模的试验， 未设及到各功能蛋白的病毒灭活和活性检测，一些有关收率、比活等方面的关键质量指标 都没有公开，从放大至规模化生产的角度来看还缺乏足够的数据支持，而本领域迫切需要 可用于大规模生产的Cohn法组分IV沉淀综合利用方法。
【发明内容】
[0011] 本发明提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取 出纯度为99.5% W上的AT-III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。
[0012] 此外，本发明还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取α1-抗膜蛋白酶、抗凝血 酶IIIW及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现巧中产品的分离，可有效降低α1-抗膜 蛋白酶和抗凝血酶ΠI的生产成本，并可实现大规模工业化生产。
[0013] 一方面，本发明提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III (ΑΤ-ΙΙI) 的方法，所述方法包括：将血浆Cohn法组分IV沉淀依次进行阴离子交换层析、肝素亲和层 析、疏水层析，并收集疏水层析之后的穿流液，得到抗凝血酶ΠΙ(ΑΤ-ΙΠ )。
[0014] 优选的，所述提取抗凝血酶ΙΙΙ(ΑΤ-ΙΙΙ)的方法在层析步骤之前还包括病毒灭活 的预处理步骤，更优选的，所述病毒灭活的预处理步骤是通过S/D法进行或己氏灭活法进 行。
[0015] 更优选的，本发明提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT- III)的方法，所述方法包括W下步骤：
[0016] (1)S/D病毒灭活:采用终浓度为l%Tween-80/0.3%TNBP，对血浆Cohn法组份IV沉 淀溶液进行病毒灭活，24 ± rC条件下揽拌解育化，用肥1调至抑6.00~7.50;
[0017] (2)阴离子交换层析去除杂蛋白：用抑6.00~7.50的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交 换层析柱3~6个柱体积后上样，用pH6.00~8.5的缓冲液洗柱2~5个柱体积，用pH6.00~ 8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
[001引（3)肝素亲和层析吸附目的蛋白：将肝素亲和柱用含0.1~0.5M化C1的PH6.0~ 8.5的缓冲液平衡层析柱2~6个柱体积，将步骤(2)的洗脱液上样层析柱，用抑6.0~8.5并 含有10~500mmol/L巧樣酸和0.5~2mol/L NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
[0019] (4)疏水层析进行精纯:将疏水层析柱用抑6.0~8.5并含有10~500mmol/L巧樣酸 和0.5~2mol/L NaCl的缓冲液平衡2~6个柱体积后，上样步骤(3)的洗脱液，收集上样后的 流穿液；
[0020] (5)将步骤(4)的流穿液脱盐、浓缩、膜过滤除病毒、除菌分装、冻干，得到抗凝血酶 ΠΙ制品。
[0021] 另一方面，本发明提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的 方法，所述方法包括:通过上述方法收集抗凝血酶III(AT-III)，并通过AAT Select亲和层 析收集α1-抗膜蛋白酶(αΙ-ΑΤ)。
[0022] 其中所述AAT Select亲和层析可W在阴离子交换层析和肝素亲和层析之间进行， 也可W在肝素亲和层析之后进行。并且，所述肝素亲和层析和AAT Select亲和层析还可W 采用串联的形式，从而实现一次上样，样品流经两种层析柱，