专利名称：一种abo血型基因分型的pcr-sbt方法及试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于ABO血型基因分型的分子生物 学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂。
背景技术：
人类ABO基因位于9号染色体(9q34. 1 34. 2)，由A、B和0三个复等位基因控制， 包含长度大小从28 688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，总长大 约为18 20kb。其基因编码产物是糖基转移酶，多数编码序列(1062bp中823bp)位于第6 和第7外显子上，负责编码糖基转移酶的催化区域。这些转移酶控制ABO血型抗原的生物合 成，从而决定其血型。ABO血型的其它等位基因DNA序列高度保守，与AlOl的DNA序列紧密 相关，仅有几个碱基替换或单个碱基缺失。对汉族人群中ABO血型进行频率调查发现，主要 为A102、B101、001、002这几种等位基因。A102等位基因与AlOl等位基因相比只是在467位 的单个碱基替换(C/T，Pro/Leu)，两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异。BlOl基因仅 在297、526、657、703、796、803、930和1096位碱基8个位置与AlOl有改变，导致糖基转移酶 多肽链上有 4 个氨基酸替代C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A (Leu/Met)、G803C(Gly/ Ala)。001等位基因与AlOl的差异是第261位核苷酸G缺失，引起了阅读框移动，在351至 354位置产生终止密码子，肽链合成在117位氨基酸终止，产生一条无催化能力的短肽链。除 此之外，人群中还存在大量的亚型和罕见基因型，通常也是由于单个核苷酸变异形成的。现有技术中，人类ABO血型检测方法主要有两种一是经典的血清学方法，二是基因分 型方法。血清学方法具有简单实用等特点，但也存在一定的局限性，首先需要新鲜红细胞样品，对 样本要求较高；其次方法检测的范围较窄，只能对ABO血型中的常见血型进行定型，对于一些亚 型标本以及罕见样本，在血型检测时易出现正反定型不符，难以定型或定型错误的现象，且不能 确定其具体基因型。基因分型的方法在某种程度上弥补了经典血清学方法在这方面的不足。目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR_序列特异性引物)，但该 方法需要进行多管扩增，需有进一步改进的基因扫描技术可进行单一管扩增。并且PCR-SSP 方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的 ABO血型进行基因分型，对于一些特殊的亚型或存在的新突变位点则难以明确。而ABO血型 PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术)分型方法可以克服前两 者的上述缺陷和局限性。但现阶段的ABO血型PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较 集中的6、7号外显子的测定来确定其基因型，而对第1-5号外显子不进行测序，尤其是含有 起始密码子的1号外显子，其GC含量比较高，PCR扩增较难获得，这种操作方法存在两个缺 陷第一，由于6、7号外显子单核苷酸多态性非常集中，而各个ABO血型之间的差异可能仅 有单个或几个核苷酸的变异所引起，容易造成SNP位点(单核苷酸多态性位点)的漏检，引 起血型基因型的误判。第二，第1-5号外显子以及所包含的内含子中同样存在大量的基因 信息，对确定样本基因型和解决ABO血型相关问题具有重要的意义。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于AB。血型分型的PCR—SBT方法，以克服现有血型分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案
它包括下述步骤
(1)制备人基因组])NA；
(2)设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组])NA中AB。基因外显子l1外显子2—41外显子5—7的三个片段，其中l号外显子采用含GC缓沖液的PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(4)设计测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；
(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠一乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
本发明另一个所要解决的技术问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案它包括3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增AB。血型基因的l号外显子12—4号外显子以及5—7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析。
所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下
l号外显子扩增引物
Ml 3一E lF5’一GTAAAA(GACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG一3’
M13一ElR5’一CAG(；AAA(AGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC一3’
2—4号外显子扩增引物
E24F25’一GAGGGTGAGTGATGTGATT一3’
E24Rl5’一ACTGG(2AA(；AGGGACTAA(一3’
5—7号外显子扩增引物
E57F5’一CTGCTAAAA(CAAGGGCG一3’
E7R5’一CTGCCCACAGT(3AATTGAGA一3’
所述18条寡核苷酸测序引物序列如下
外显子l片段的测序引物
Ml 3F5’一GTAAAA(GACGGCCA一3’
Ml 3R5’一CAG(}AAA(AGCTATGAC一3’
外显子2—4片段的测序引物
5 18F5’ 一aCCaCCCtCCtgCCCaCC一3’
252]F’5’一aCagaaggtCCCagaaCCaaga一3’
l 7 lF5’一gggtCaCCtggataCCtCtgg一3’
682]F’5’一CCtCtgttgggaCCaCtCttg一3’
306]F’5’一atCgCCaCagtgatggttgt七一3’
44lF5’一CCtggg(tCaagtgattCtCC一3’
955]F’5’一ttttatgtCgggctCaaatCaC一3’
外显子5—7片段的测序引物
工6F5’一GTTCCCGCAGGTCC；AATGT一3’
I6R 5' -GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’E7F 5' -TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3，51R 5 ’ -AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’5IF 5' -CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’6IF1 :5’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3，6IR1 :5’ -CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’6IF2 :5， -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3，6IR2 :5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’本发明中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网 上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据Genebank(序列号AC000397)中人类 ABO血型基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而设计获得的。所有引物的 设计均避开突变位点，以免因位点的漏检而导致分型的错误。本发明以一对寡核苷酸引物 可以扩增包含几个外显子的长片段，使其简化为3对扩增引物即可保证包含所有外显子的 有效扩增。1号外显子含有大量GC碱基，较难获得有效扩增，同时与其他外显子之间隔有一 段长片断内含子，因此将其单独作为一个片段，利用GC缓冲液，保证其有效扩增。5-7号外 显子含有较多突变位点，同时考虑扩增片段长度及扩增效果，将此3个外显子合并成一个 片段扩增。余下的外显子作为单独的一个片段扩增。扩增引物的设计避开了 ABO血型抗原 编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检从而导致的基因型误判。测序引物的设 计能保证清晰准确测得所扩增片段的全长序列，对部分序列进行双向测序，从而将样本进 行精确的基因分型。其中所述1号外显子扩增引物在其5'包含一段M13通用引物，以保证 GC含量较高的1号外显子能有效地获得清晰的测序电泳图谱。本发明通过对ABO血型所有外显子进行全长序列测序，获得ABO血型相关外显子 的全长和部分内含子寡核苷酸序列，精确地对其基因进行分型。随着DNA序列分析仪的普 及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测，如药物相关的乙肝病毒变异测序、骨髓移植的HLA 高分辨测序分型等。高通量获得的所有ABO血型编码序列精确信息在基因定型，基因多态 性检测，基因频率调查分析等方面的应用受到广泛重视。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了 ABO亚型 的鉴定、疑难血型的判定、新突变位点的发现、基因之间的重组现象、基因多态性检测等问题，发 挥PCR-SBT对ABO基因定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的 相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
图1为本发明中检测样本的外显子1 (El)、外显子2-4(E2_4)、外显子5_7 (E5_7) 三个片段的PCR扩增电泳图谱，M为DNA Marker (DL2000, TaKaRa)。图2为本发明中对3例检测样本中的样本1 (A102/B101)的1_7号外显子的全部 测序电泳图谱。图3为本发明中对3例检测样本中的样本2(B(A)02/B101)的1_7号外显子的全 部测序电泳图谱。图4为本发明中对3例检测样本中的样本3 (B (A) 02/001)的1_7号外显子的全部测序电泳图谱。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明内容作进一步详细说明。实施例一般用抗A和抗B试剂来测定红细胞上是否有A抗原和B抗原，确定ABO血型称为正 定型；用已知有A和B抗原的红细胞对血清定型，称为反定型。正反定型相符，才能避免ABO血 型的误定。即试验中红细胞有A、B抗原，血清中无A、B抗体，可完全确信这次定型AB型是正确 的。正反定型不符即正定型和反定型的结果不一致，不能确定其正确的血型。本实施例中样本 正反定型不符即提示红细胞表达A、B抗原，其血清中有抗Al抗体，因此不能定义其血型。本实施例具体以对一例正反定型符合和两例正反定型不符个体进行ABO血型定 型为例对本发明内容做详细说明，本发明所采用的一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法 具体包括以下步骤1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。取待检全血200μ 1，按照invitrogen DNA isolation试剂盒说明书提取基因组 DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。2、合成3对扩增引物和18条测序引物，具体序列见前述发明内容中的序列，不再赘述。将扩增弓丨物用纯水稀释至25 μ M ；准备La-Taq酶(Lot :CK4501，TaKaRa)、10 X缓冲液 (Lot :CK4501, TaKaRa)、2XGC buffer I (Lot :A2801A，TaKaRa)、dNTP(Lot :CBG4301A，TaKaRa)、纯 水，与步骤1所制备的PCR扩增模板按表1、表2和表3所述体系配制PCR扩增体系表1 步骤2中1号外显子PCR扩增体系 表2 步骤2中2-4号外显子PCR扩增体系 表3 步骤2中5-7号外显子PCR扩增体系 用PCR仪(ABI9700)分别按以下程序扩增1号外显子扩增94°C预变性lmin，DNA双链充分解开；94°C变性30s，67. 5°C退火 30s，引物结合到模板上，72°C延伸35s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72°C，IOmin,扩 增片段充分延伸；2-4号外显子扩增94°C预变性5min，DNA双链充分解开；94°C变性30s，61°C退火 30s,引物结合到模板上，72°C延伸5min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72°C，lOmin， 扩增片段充分延伸；5-7号外显子扩增94°C预变性5min，DNA双链充分解开；94°C变性30s，63. 8°C退 火30s，引物结合到模板上，72°C延伸3min30s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72°C， lOmin，扩增片段充分延伸。3、扩增产物的双酶切纯化。检测样本所扩增的3个片段各取2 μ 1 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示， 确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶(SAP，IU/μ 1，Lot M820A, Promega)和核酸外切酶 I (Exo-I，5U/μ l，Lot :CK11011Β，TaKaRa)，利用虾碱性磷酸 酶(SAP)的DNA 5'端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo-I)的单链特异性3' -5'核 酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在25 μ 1扩增产物体系中加入SAP 2μ 1和Exo-I 1μ 1, 37°C 30min酶切反应，80°C 15min酶失活。4、对PCR产物进行测序PCR。将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入25 μ 1纯水稀释，混勻。测序引物用纯水 稀释至 1. 6 μ Μ，以 BigDye terminator v3. 1 sequencing kit (美国 ABI 公司)试剂按照表 3配制反应体系表3 步骤4中PCR产物的PCR测序体系
反应体系体积(μ )5 X缓冲液1. 6BigDye mix0. 8测序引物1DNA2H204. 6总体积10 三个样本以所扩增纯化的片段为模板，分别进行18个反应，用PCR仪(ABI9700) 按以下程序扩增96°C预变性lmin，DNA双链充分解开；96°C变性10s，50°C退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60°C延伸4min，延长扩增片段，25个循环。测序引物浓度为1.6μΜ， 稀释的上述纯化后DNA模板2 μ 1。5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR 产物中加入Ιμ EDTA (1.25 μ Μ)和25 μ 1醋酸钠(3Μ)/无水乙醇(1 40)混合液，混勻， 3000g离心30min ；去除上清，加入75%乙醇，3000g离心lOmin，去除上清，酒精挥发后加入 10 μ 1甲酰胺溶解，95°C变性3min，迅速在冰上冷却。6、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测 序结果利用SeqScape V2. 5软件进行序列比对，按照Blood Group Antigen Gene Mutation Database(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/gv/mhc/xslcgi. cgi ？ cmd = bgmut/ systems)数据库序列确定ABO血型的基因型。如图2、3、4所示，图2的样本1为正反定型符合的正常AB血型基因型结果，图3的 样本2和图4的样本3为两例正反定型不符个体AB血型基因型结果，即用血清学方法难以 判断其血型的疑难血型。3730测序仪毛细管电泳图谱分析结果显示，样本1基因为261G/G、 297A/G(R)、467C/T(Y)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/C、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、 930A/G(R)，基因型定为 A102/B101。样本 2 基因为 261G/G、297G/G、526G/G、657T/T、700C/ G(S)、703A/A、796A/A、803C/C、930A/A，基因型定为 B(A)02/B101。样本 3 基因为 261G/del、 297A/G(R)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/G(S)、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、930A/ G (R)，基因型定为B (A) 02/001。其中前面的数字代表碱基序列位置，括号中字母代表所对应 杂合碱基的缩写。样本1表现为正反定型符合的正常AB型。样本2和样本3的表现为正 反定型不符的A2B。AB型可分为AlB和A2B两种亚型，本实施例中此两例正反定型不符样 本所表现的A2B型属于一种罕见亚型，可引起正反定型不符，难以判断其正确的血型，而大 部分人群表现为普通AlB型。对三例样本的测序图谱比较分析，B (A) 02等位基因700位碱 基为G，703位碱基为A ；A102.001基因700位碱基为C，703位碱基为G ；BlOl基因700位碱 基为C，703位碱基为A，可见其700位G是其特征碱基，作为罕见基因B (A) 02的一个标志。 本实施例将疑难血型准确的加以定型。所以，采用本发明提供的ABO血型基因分型的PCR-SBT方法可以通过对ABO血型 所有外显子进行全长序列测序，获得ABO血型相关外显子的全长和部分内含子寡核苷酸序 列，可以精确地对其基因型进行分型，从而解决了 ABO亚型的鉴定、疑难血型的判定、新突 变位点的发现、基因之间的重组现象、基因多态性检测等问题，可发挥PCR-SBT对ABO基因 定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到 高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
权利要求
一种ABO血型基因分型的PCR SBT方法，其特征在于它包括以下步骤(1)制备基因组DNA；(2)设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中ABO基因外显子1、外显子2 4、外显子5 7的三个片段，其中1号外显子采用含GC缓冲液的PCR扩增；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(4)设计测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠 乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
2.如权利要求1所述的一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步骤 (2)中，三个片段扩增的反应体系和反应程序如下其特征在于步骤(2)中，外显子 1 扩增体系，以 25μ 1 计，包括2XGC buffer I 12. 5 μ 1,2. 5mM dNTP 2μ1、每 条引物终浓度均为0. 5ymol/L、La-Taq DNA聚合酶1. OUUOOng/μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余 量以纯水补足；外显子2-4扩增体系，以25 μ 1计，包括10XPCR缓冲液2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 2μ1，每 条引物终浓度均为 0. 5 μ mol/L, Mg2+ 终浓度 2. Ommo 1/L, La-Taq DNA 聚合酶 1. 0U, IOOng/ μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余量以纯水补足；外显子5-7扩增体系，以25 μ 1计，包括10XPCR缓冲液2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 2μ1，每 条引物终浓度均为 0. 5 μ mol/L, Mg2+ 终浓度 2. Ommo 1/L, La-Taq DNA 聚合酶 1. 0U, IOOng/ μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余量以纯水补足；扩增程序为1号外显子扩增94°C预变性lmin，DNA双链充分解开；94°C变性30s，67. 5°C退火30s， 引物结合到模板上，72°C延伸35s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72°C，IOmin,扩增片 段充分延伸；2-4号外显子扩增94°C预变性5min，DNA双链充分解开；94°C变性30s，61°C退火30s， 引物结合到模板上，72°C延伸5min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72°C，lOmin，扩增 片段充分延伸；5-7号外显子扩增94°C预变性5min，DNA双链充分解开；94°C变性30s，63. 8 °C退 火30s，引物结合到模板上，72°C延伸3min30s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72°C， lOmin，扩增片段充分延伸。
3.如权利要求1或2所述的一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述 步骤(2)和步骤(4)中的引物分别为3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所 述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外 显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析；所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下1号外显子扩增引物M13-E1F :5’ -GTAAAACGACGGCCA GGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’M13-E1R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’2-4号外显子扩增引物E24F2 :5’ -GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’ E24R1 :5’ -ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’ 5-7号外显子扩增引物 E57F :5’ -CTGCTAAAACCAAGGGCG-3， E7R 5' -CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3‘ 所述18条寡核苷酸测序引物序列如下 外显子1片段的测序引物 Ml3F 5 ’ -GTAAAACGACGGCCA-3’ Ml3R 5 ’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 外显子2-4片段的测序引物 518F -Bccaccctcctgcccacc-S' 252F -acagaaggtcccagaaccaaga-3‘ 171F -gggtcacctggatacctctgg-S' 682F -cctctgttgggaccactcttg-S' 306F -atcgccacagtgatggttgtt-3‘ 441F -cctgggctcaagtgattctcd' 955F -ttttatgtcgggctcaaatcac-S' 外显子5-7片段的测序引物 I6F :5’ -GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3， I6R :5’ -GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’ E7F :5，-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3‘ 51R 5 ’ -AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’ 5IF :5，-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3， 6IF1 :5’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3， 6IR1 :5’ -CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’ 6IF2 :5’ -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3， 6IR2 :5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3，。
4.如权利要求1所述的一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步骤 (4)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
5.一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂，其特征在于它包括3对寡核苷 酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因 的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分 析；所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下 1号外显子扩增引物M13-E1F :5’ -GTAAAACGACGGCCA GGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’ M13-E1R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’ 2-4号外显子扩增引物 E24F2 :5’ -GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’E24R1 :5’ -ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’ 5-7号外显子扩增引物 E57F :5’ -CTGCTAAAACCAAGGGCG-3， E7R 5' -CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3‘所述18条寡核苷酸测序引物序列如下外显子1片段的测序引物M13F5’ -GTAAAACGACGGCCA-3’M13R5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，外显子2-4片段的测序引物518F5，_accaccctcctgcccacc_3’252F5，-acagaaggtcccagaaccaaga-3171F5，-gggtcacctggatacctctgg-3'682F5，一cctctgttgggaccactcttg一3’306F5，-atcgccacagtgatggttgtt-3‘441F5，一cctgggctcaagtgattctcc一3’955F5，-ttttatgtcgggctcaaatcac-3外显子5-7片段的测序引物I6F 5，-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’I6R 5，-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’E7F 5，-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3，5IR 5，-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’5IF 5，-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’6IF15’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’6IR15，-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3 ‘6IF25’ -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3’6IR2；5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’。
全文摘要
本发明提供一种用于ABO血型分型的PCR-SBT方法，它包括下述步骤制备人基因组DNA；扩增ABO基因外显子1、外显子2-4、外显子5-7的片段；得到扩增产物进行双酶切纯化；将纯化产物进行测序PCR反应；将测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；将获得的序列通过软件分析，确定其基因型。本发明解决了ABO亚型的鉴定、疑难血型的判定、新突变位点的发现、基因之间的重组现象、基因多态性检测等问题，发挥PCR-SBT对ABO基因定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
文档编号C12Q1/68GK101921834SQ201010174588
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者严力行, 朱发明, 许先国 申请人:浙江省血液中心