专利名称：一种检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用纳米金颗粒检测甲型Hmi流感病毒DNA或RNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于 疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的 意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法 都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis发 明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应 用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr. Mullis为此还获得了 1993 年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其 反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室 和医院里。2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸 扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩 增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规 的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需 要特殊的仪器，因此限制了 LAMP技术的实际应用。甲型Hmi流感为急性呼吸道传染病，其病原体是一种新型的甲型Hmi流感病毒， 在人群中传播。与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和 人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型Hmi流感病毒普遍易感，并可以人传染人， 人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和 疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。目前针对甲型Hmi流感病 毒缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测甲型Hmi流感病毒经环介导等温核 酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，从而判定甲型Hmi流感病毒的存在与否。本发明试 剂盒结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种 操作简单、快速、准确、成本低廉、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、 临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的流感病毒检测。本发明试剂盒包括两部分1.标记有可以识别甲型Hmi流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；2.可以扩增待检测样品中的甲型Hmi流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩 增待检测样品中的甲型Hmi流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。
该试剂盒的工作原理为1.纳米金颗粒标记有能识别甲型Hmi流感病毒特定序列的分子探针，分子探针 被固定在纳米金颗粒的表面。2.待检测样品中的甲型Hmi流感病毒DNA分子或甲型Hmi流感病毒RNA经环介 导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，甲型Him流感病毒的目标 片段被放大IO9倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。3.混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，甲型Hmi流感病毒经环介导等 温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别甲型Hmi流感病毒特定序列的分 子探针杂交。4.纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体(如附图所 示)，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可 以判断待测样品是否具有甲型Hmi流感病毒DNA或RNA。
四
标记有分子探针的纳米金颗粒与甲型Hmi流感病毒经环介导等温核酸扩增技术 以后的产物DNA杂交示意图，纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成 聚集体。
五具体实施例方式本发明试剂盒包括2管溶液，一管中是标记有可以识别甲型Hmi流感病毒特定 序列的分子探针的纳米金颗粒溶液50 μ 1，一管中是250 μ 1可以扩增待检测样品中的甲型 HlNl流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的甲型Hmi流感病毒RNA 的环介导等温核酸扩增体系。纳米金颗粒溶液中含有直径为20nm的纳米金颗粒，浓度为1. 2nM，纳米金颗粒表 面标记有巯基修饰的DNA探针。环介导等温核酸扩增体系成分如下0. 2μ M F3禾口 Β3弓丨物，1·6μΜ FIP和BIP引 物，0. 4Mbetaine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，IOmM MgSO4,1. 4mM dNTPs, 1 X ThermoPol reactionbuffer(New England Biolabs, Ipswich, MA),80 U Bst DNA polymerase(New England Biolabs) ,6. 25 U AMV 逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。巯基修饰的DNA探针序列5' -ATGTGAAGAACTTATATAAAAAAAA-SH-3引物序列甲型Hmi流感病毒的F3引物5 ‘ -AAGTTGATGATGGTTTCCTG-3‘甲型Hmi流感病毒的B3引物5 ‘ -GACACTTTCCATGCACGT-3‘甲型Hmi流感病毒的FIP引物5 ‘ -CGTGGTAGTCCAAAGTTCTTTCATTCATTTGGACTTACAATGCCG-3‘甲型Hmi流感病毒的BIP引物
5' -GAAGCCAGTTAAAAAACAATGCCACATTTGTGGTAAAATTCAAAGCAG-3‘操作过程如下1.向装有环介导等温核酸扩增体系的管中加入10 μ 1提取的核酸或者血液样品。2.将装有混合物的管放入60°C的水浴中30分钟。3.再向步骤2中的管中加入纳米金颗粒溶液，此时混合后的溶液为红色。4.60°C水浴反应15分钟。观察反应后管中溶液的颜色，溶液保持红色不变则不含有流感病毒感染特异性 RNA或甲型Hmi流感病毒DNA ；如果溶液变为浅紫色，则判定样本中含有流感病毒感染特异 性的RNA或甲型Hmi流感病毒DNA。此种情况下，如果样品是血液样品，那么提供血样的人 已经被甲型Hmi流感病毒所感染。
权利要求
一种用纳米金颗粒检测甲型H1N1流感病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下部分(1)标记有可以识别甲型H1N1流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的甲型H1N1流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的甲型H1N1流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。
2.根据权利要求1，该试剂盒的工作原理为(1)用环介导等温核酸扩增技术扩增待检 测样品中的甲型Hmi流感病毒DNA或先经过逆转录过程后用环介导等温核酸扩增技术扩 增待检测样品中的甲型Hmi流感病毒RNA ； (2)纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技 术产物DNA杂交；(3)杂交引发纳米金颗粒聚集，导致纳米金颗粒聚集处颜色改变，以此判 断待检测样品是否含有甲型Hmi流感病毒DNA或RNA。
3.根据权利要求1，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分 是固定在纳米金颗粒表面的分子探针，该探针可以识别甲型Hmi流感病毒的特定序列。
4.根据权利要求2，待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是甲型 HlNl流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以和 环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、相同反应容器中同时进行。
6.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以发 生在溶液中或者固体表面。
7.根据权利要求2，纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交引发溶 液或固体表面颜色改变，这种变化可由肉眼直接判断，也可利用分光光度计等光学仪器检 测。
8.根据权利要求3，分子探针是指可以识别环介导等温核酸扩增技术产物DNA的功能 分子，这些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白质，化学分子。
9.根据权利要求4，相同反应条件包括但不限于溶液组成，成分浓度，PH值，温度，反 应时间等。
全文摘要
本发明涉及一种用纳米金颗粒检测甲型H1N1流感病毒DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的甲型H1N1流感病毒检测。本发明试剂盒包括两部分(1)标记有可以识别甲型H1N1流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的甲型H1N1流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的甲型H1N1流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。
文档编号C12Q1/68GK101824492SQ20101017447
公开日2010年9月8日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者孙国明 申请人:天津朝海科技有限公司