鸡快慢羽基因型的鉴别方法及雏鸡雄雌鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡快慢羽基因型的鉴别方法和一种雏鸡雄雌鉴别方法，所述基因型鉴别方法对鸡血样中的DNA进行PCR扩增，所用正向引物F为5'-GCACATTCAAGTAAGCAGTAGTTT-3'，反向引物R为5'-AAAAAAAAAAAAAATTGCACTTTAATAGTACCATCTATTC-3'，以TaqI内切酶对扩增产物进行酶切，检测酶切后的片段长度并由此判断鸡的羽速基因型，所述雏鸡雄雌鉴别方法以上述基因型鉴别方法获得的羽速基因型构建配套系并以快慢羽性状进行雏鸡的雄雌自别。本发明可以有效地鉴别出鸡快慢羽的各种基因型，极大程度缩短羽速自别雌雄配套系的建系时间。
【专利说明】鸡快慢羽基因型的鉴别方法及雏鸡雄雌鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鸡快慢羽基因型的鉴别方法及一种采用上述基因型建系下的雏鸡雄雌鉴别(自别)方法，属于分子生物学【技术领域】和动物养殖【技术领域】。
【背景技术】
[0002]雌雄鉴别在现代养鸡生产中发挥着重要作用。当前用于雌雄鉴别的技术主要有翻肛鉴别和利用羽色、羽速等雌雄自别。由于翻肛鉴别需要对鉴别人员进行特殊培训，且在鉴别过程中会对鸡群造成伤害，因此，为了给蛋鸡饲养者提供更为优质的雏鸡，保证其经济效益，采用一种对鸡群无伤害的雌雄自别技术显得格外重要。
[0003]关于雌雄自别技术，目前主要通过羽色和羽速来实现，应用最多的是羽速鉴别。羽速鉴别相对于翻肛鉴别，其鉴别速度快，准确率高，并且鉴别人员也不需要进行特殊培训，最重要的是对雏鸡损伤小，疾病交叉感染机率低，因此，在现在种鸡饲养中被广泛使用。虽然利用羽速进行雏鸡雌雄鉴别的方法相比翻肛鉴别要容易得多，但是该方法也存在一定的局限:一是鉴别时间:在利用羽速进行雌雄鉴别时，一般需在雏鸡出壳后24小时内完成；二是成本投入:要实现羽速自别雌雄，需要构建相应的配套系，通过羽速表型构建配套系至少需要经过2-3个世代才能实现，并且建系时需从雏鸡开始；三是鉴别标准:对于雏鸡如何分辨快羽和慢羽，当前普遍认为雏鸡出生时，主翼羽长于覆主翼羽2mm以上的为快羽，主翼羽比覆主翼羽长2mm以下、等长或略短的为慢羽(邱祥聘，1997)。
[0004]关于快慢羽的证明，早期是通过检测内源病毒ev21 (Endogenous Virus-21, ev21)的插入来进行判断的，研究发现ev21在白来航群体中，与慢羽基因K有十分紧密的联系(遗传距离〈0.3cM) (Bacon et al, 1988)，因此，慢羽个体中存在ev21的插入，而快羽个体中不存在。但是后来研究发现，在一些褐壳系鸡群中，少量快羽个体中也有ev21的插入，而且一些慢羽个体中不存在ev21的插入(Tixier-Boichard et al, 1994),因此表明ev21的插入，只是慢羽的紧密连锁的位点，并不是充要条件。Elferink等(2008)发现了快羽基因k位点与慢羽基因K位点的差异，并推测慢羽的形成，其实是由催乳素受体(PRLR)基因3’端的一部分和编码精子鞭毛蛋白2 (SPEF2)基因5’端一部分以及两基因中间的非编码区组成的重复片段导致的。罗成龙(2012)随后利用SNP对来自同一群体的12个快羽和12个慢羽杏花鸡个体羽速性状进行了基因组关联分析，并证实了 Elferink等人的猜想。然而，李竞一(2012)通过连锁不平衡对国内地方品种鸡快慢羽基因进行定位时发现，国内一些地方品种快羽个体中也有一些存在重复片段。同时，慢羽性状对快羽性状是显性，现有的利用重复片段鉴定鸡群快慢羽的方法只能检测表型，不能检测基因型，这就需要通过两到三个世代来纯化。另外，在某些褐壳品系中通过重复片段或者Mbo I酶切来鉴别时，不能有效进行扩增，从而导致鉴定失败。
【发明内容】
[0005]为克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种鸡快慢羽基因型的鉴别方法，还提供了一种基于所鉴别基因型的雏鸡雄雌鉴别(自别)方法，本方法的基因型鉴别不受时间限制，适宜于包括褐壳品系在内的各种鸡系，可以有效地鉴别出各种纯合和杂合基因型，依据这种基因型鉴别结果，可以极大程度地缩短羽速自别雌雄配套系的建系时间。
[0006]本发明实现上述目的的技术方案为:
一种鸡快慢羽基因型的鉴别方法，对鸡血样中的DNA进行PCR扩增，获得长度为171bp的扩增产物(目的基因)，以Taq I内切酶对扩增产物进行酶切，检测酶切后的基因片段长度并据此判断羽速基因型，
所述扩增引物为:
正向引物 F:5’ -GCACATTCAAGTAAGCAGTAGITT-3’，
反向引物 R:5’ -AAAAAAAAAAAAAATTGCACTTTAATAGTACCATCTATTC-3’，
所述Taq I内切酶的识别序列为:T 1 CGA,
所述基因型的判断标准为:
扩增产物经酶切后存在长度分别为132bp和39bp的两种片段的，为慢羽纯合；
扩增产物经酶切后存在长度分别为171bp、132bp和39bp的三种片段的，为慢羽杂合；扩增产物经酶切后只存在长度为171bp的片段的(实际上是不受酶切，但为表述上的便利，目标基因无论是否被酶切，经过酶切步骤后，均称为酶切后的片段)，为快羽纯合。
[0007]通常，可以采用琼脂糖凝胶下的电泳检测方法进行所述扩增产物经酶切后片段长度的检测。
`[0008]例如，在所述电泳检测中，琼脂糖凝胶可以采用1.5% - 2%的琼脂糖凝胶，电泳电压可以采用100V，电泳时间可以为35分钟。
[0009]当所述电泳检测中39bp条带因长度太小而检测不到时，以其余条带作为判断依据:电泳结果仅有132bp —条条带时，为慢羽纯合；电泳结果有171bp和132bp两条条带时，为慢羽杂合；电泳结果仅有171bp —条条带时，为快羽纯合。
[0010]优选地，所述PCR扩增的反应体系可以为:
2XPCR Mix7μ L
ddH206 μ L
正向引物F (4μΜ)0.5μ L
反向引物R (4μΜ)0.5μ L
DNA 模板(20-50ng/ μ L )I μ L
相应的反应程序可以为:
①95 O5min
②95°C30sec
③55°C30sec
④72°C30sec
⑤Goto ② for 40 cycles
⑥72。。7min
⑦4°C保存。
[0011 ] 上述2 XPCR Mix为2倍浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和缓冲液，可以选用相应的市售产品，例如，生产厂家:北京汇天东方科技有限公司，商品名:2 X Taq PCR Mix，产品编号:HT201，规格:1 X lml/支。
[0012]一种雏鸡雄雌鉴别方法，依据上述方法获得的羽速基因型构建配套系并进行雏鸡的雄雌自别，以纯合快羽公鸡和慢羽母鸡生产的子代中，慢羽雏鸡为公鸡，快羽雏鸡为母鸡。
[0013]本发明的有益效果为:鉴别方法简单，工艺成熟，数据可靠，能够检测出慢羽杂合型等现有技术下难以检测的基因型，并且适宜于包括褐壳系在内的各种鸡系，依据检测获得的基因型，只需一个世代就可以建立起基于羽速的雏鸡雄雌自别配套系，极大地降低了培育成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1-4分别为本发明涉及若干样本的琼脂糖凝胶电泳检测图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步作描述。
[0016]以下实施例中所使用的技术手段，除非特别说明，均可采用现有技术手段；所使用的仪器设备、试剂等，除非特别说明，均可通过公开途径获得。
[0017](I)引物设计和制备:
根据现有技术下的研究成果，快慢羽定位在10.38Mb - 11.63Mb区间(2.1版本鸡基因组物理图谱为 9.86Mb — 11.11Mb) (ICGSC Gallus_gallus_4.0/galGal4, Nov.2011，UCSC)，筛选该区域内的SNP位点，得到在快羽和慢羽中表现不同的SNP位点，进行引物设计，通过不同的个体进行检测，验证。
[0018]利用上述在鸡Z染色体上IlMb附近区间发现的SNP进行引物设计，并由上海生工进行引物合成(序列信息如下:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nucleotide/358484578?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=l&RID=ZC50TA3B01R),其中:
正向引物 F:5’ -GCACATTCAAGTAAGCAGTAGITT-3’，
反向引物 R:5’ -AAAAAAAAAAAAAATTGCACTTTAATAGTACCATCTATTC-3’，
上述两种引物的浓度均为4 μ M。
[0019](2)鸡血DNA的提取和扩增模板:
①从鸡血中提取DNA的优选方法:
先制备下列溶液:
Buffer A 溶液:制备成 100 mM Tris-Cl (pH 7.5)，100 mM EDTA，100 mM NaCl,0.5%SDS的ddH20溶液，室温保存。
[0020]Buffer B溶液:取200 ml 5 M乙酸钾溶液和500 ml 6 M氯化锂溶液，充分混匀即可，4°C保存。
[0021]提取步骤:
1)取鸡血50μ L，加Buffer A溶液500-550 μ L，充分混匀；
2)65°C恒温水浴2-4小时；
3)加Buffer B 溶液 850 μ L ；
4)充分混匀后冰浴15-30分钟；5)12000 rpm常温离心15分钟； 6)吸上清600-800μ L (如有必要再次12000rpm常温离心15分钟，吸上清，以保证在上清液不足或离心不充分时，通过再次离心获得所需的上清液)；
7)加氯仿600μ L,充分混合2-3分钟；
8)12000 rpm 离心 10 分钟；
9)吸取上清约600μ L，加异丙醇600 μ L，充分混合2_3分钟；
10)12000 rpm常温离心10分钟；
11)去上清，加70%的酒精ImL洗涤沉淀；
12)12000 rpm常温离心3-5分钟；
13)去上清，真空离心抽风10分钟；
14)加TE200yL，4°C下溶解，由此形成用于PCR扩增的DNA模板；
②快速提取鸡血DNA的方法:
也可以采用下列方式快速提取鸡血DNA:
10XPCR Buffer10 μ L
蛋白酶 K(20mM)30 μ L
ddH2060 μ L
上述混合液分装，每管10 μ L，然后加入I μ L抗凝血(加入抗凝剂的鸡血)，55°C下消化30min，95°C下15min，4°C保存，由此形成的裂解液也可以用作PCR扩增的DNA模板。
[0022]依据现有技术或其他可能的技术从鸡血中提取DNA并制备扩增模板，也可以用于本发明，通常情况下，所获得和使用的DNA模板的浓度可以为20-50ng/y L 。
[0023](3)PCR反应体系(15yL)和反应程序(参数):
2XPCR Mix7μ L
ddH206 μ L
正向引物F(4yM)0.5μ L
反向引物R(4yM)0.5μ L
DNA 模板(20-50ng/ μ L) I μ L
其中，2XPCR Mix的生产厂家为北京汇天东方科技有限公司，商品名为2 X Taq PCRMix，产品编号为HT201，规格为I X Iml/支。
[0024]扩增反应程序:
①95O5min
②95°C30sec
③55°C30sec
④72°C30sec
⑤Goto ② for 40 cycles
⑥72。。7min
⑦4°C保存。
[0025]依据现有技术或其他可能的技术，也可以以本发明的引物实现本发明涉及的扩+?
>曰ο
[0026] 申请人:对本说明书提及的扩增试验所获得的各快羽和慢羽个体PCR扩增产物长度进行了试验验证，均为171bp。
[0027](4) Taq I酶切体系、参数和酶切结果:
酶切体系(20 μ L):
IOXBuffer Taq I2 μ L
Taq KlOU/μ L)I μ L
ddH207 μ L
PCR扩增液(扩增后体系)IOyL 混匀，65°C消化16小时。
[0028]PCR扩增片段用Taq I内切酶进行酶切，该内切酶识别序列和酶切位点为:T I CGAo
[0029]经酶切后，快羽个体的扩增产物不能被酶切，电泳检测为171bp单一条带，慢羽纯合个体的扩展产物可被完全切开，电泳检测为132bp和39bp两条条带，慢羽杂合个体的扩增产物则只能被切开一条 核酸链，另一条核酸链不能被切开，因此电泳检测为171bp、132bp和39bp三条条带。
[0030]通过现有技术或其他可能的技术，也可以以上述内切酶Taq I实现本发明涉及的酶切并获得相同的结果。
[0031 ] (5)琼脂糖凝胶电泳检测
采用1.5% - 2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用100V，电泳时间为35分钟。
[0032]由于琼脂糖凝胶电泳检测效率问题，39bp条带可能因为长度太小而检测不到。因此，慢羽纯合个体经酶切后，显示出的电泳结果仅为132bp —条条带，慢羽杂合个体经酶切后，显示出的电泳结果仅为171bp和132bp两条条带。
[0033](6)检验上述方法的可靠性:借助390份已知快慢羽表型个体的鸡血样DNA (样本来自本发明 申请人:的养殖场)，利用该上述方法鉴定其基因型，将基因型结果与已知的表型结果进行对比，由此检验该鉴定方法的可靠性。
[0034]①选择已知快慢羽表型个体共255个，采集血液，提取DNA，进行PCR扩增，然后再采用Taq I内切酶进行酶切，部分结果如图1-3所示，其中，图1中，1、2、4、8、9、10、11、12泳道为母鸡，只有一条171bp的条带，为快羽；3、5、6、7泳道为公鸡，有171bp和132bp两条条带，为杂合慢羽；13-23泳道为母鸡，没有171bp条带，只有132bp条带，为慢羽，Marker为 DL500，从下向上分别为 50bp, IOObp, 150bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp ;图 2 中，所检测样本均为公鸡，1-8泳道只有171bp条带，为纯合快羽；9-16，19-24只有132bp条带，没有171bp条带,为纯合慢羽；17，18泳道显示171bp和132bp两条条带,为杂合慢羽,Marker为DL2000，从下向上分别为 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, 1000bp, 2000bp ;图 3 中，所检测样本均为母鸡，1-8泳道为快羽，只有171bp条带；9-24泳道为慢羽，只有132bp条带，没有171bp条带，Marker 为 DL2000，从下向上分别为 IOObp，250bp, 500bp, 750bp, 1000bp，2000bp。
[0035]②依据非检测人员提供的135个血样样本进行盲测:提取DNA，进行PCR扩增，然后再采用Taq I内切酶进行酶切。通过检测结果进行快慢羽表型判别，然后与血样提供人员的血样记录中的快慢羽表型进行核对，部分检测结果如图4所示，图4中，所检测样本公母未知，1、4、8-12泳道只有171bp条带，为快羽；2-3,5-7泳道显示有171bp和132bp两条条带，为杂合慢羽，为公鸡，13-23泳道只有132bp条带，为慢羽，Marker为DL500，从下向上分别为 50bp, IOObp, 150bp，200bp，300bp，400bp，500bp。
[0036]上述390份样本的检测结果与快慢羽表型100%吻合。
[0037]由于快慢羽位点位于Z染色体上，其中慢羽(K)对快羽(k)为显性，利用快羽公鸡(ZkZk)与慢羽母鸡(ZkW)交配，子代雏鸡中公鸡全部为慢羽(ZKZK)，母鸡全部为快羽(ZkW)，由此根据快慢羽性状就可以确定子代雏鸡的雄雌，因此，根据本发明的基因型检测结果，可以选择性相应的基因型，建立其能够实现雏鸡自别雄雌的配合系。
[0038]与现有技术相比，本发明具有如下特点:
(I)利用已知快慢羽表型建立起的鸡快慢羽基因型和表型的鉴定方法，通过鉴别结果与已知表型之间的对比，快慢羽表型准确率100%。
[0039](2) 申请人:已将本发明的方法用于本公司褐壳系的120份样本中，成功扩增并得到基因型鉴别，经与表型对比确认准确率也在100%，解决了在褐壳系中快慢羽鉴别效率低的问题。
[0040](3)利用该方法，可以成功鉴别慢羽杂合公鸡个体，减小了因为公鸡慢羽杂合导致鉴别效率低的问题，提高了公鸡使用价值。
[0041](4)利用该鉴别方法，可极大程度缩短羽速自别雌雄配套系的建系时间(利用一个世代就可以完成)，节省了培育成本。
[0042]本发明涉及同一体系或配比中各组分的量(包括按照浓度换算的量)，应视为对相关各组分之间比例关系的限定，而不是`对各自用量的绝对值的限定。
【权利要求】
1.一种鸡快慢羽基因型的鉴别方法，对鸡血样中的DNA进行PCR扩增，获得长度为171bp的扩增产物，以Taq I内切酶对扩增产物进行酶切，检测酶切后的基因片段长度并据此判断羽速基因型， 所述扩增引物为:
正向引物 F:5’ -GCACATTCAAGTAAGCAGTAGITT-3’，
反向引物 R:5’ -AAAAAAAAAAAAAATTGCACTTTAATAGTACCATCTATTC-3’， 所述Taq I内切酶的识别序列为:T 1 CGA, 所述基因型的判断标准为: 扩增产物经酶切后 存在长度分别为132bp和39bp的两种片段的，为慢羽纯合； 扩增产物经酶切后存在长度分别为171bp、132bp和39bp的三种片段的，为慢羽杂合； 扩增产物经酶切后只存在长度为171bp的片段的，为快羽纯合。
2.如权利要求1所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于采用琼脂糖凝胶下的电泳检测方法进行所述扩增产物经酶切后片段长度的检测。
3.如权利要求2所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于在所述电泳检测中，琼脂糖凝胶采用1.5% - 2%的琼脂糖凝胶，电泳电压采用100V，电泳时间为35分钟。
4.如权利要求3所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于当所述电泳检测中39bp条带因长度太小而检测不到时，以其余条带作为判断依据:电泳结果仅有132bp —条条带时，为慢羽纯合；电泳结果有171bp和132bp两条条带时，为慢羽杂合；电泳结果仅有17 Ibp —条条带时，为快羽纯合。
5.如权利要求1、2、3或4所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为: 2XPCR Mix7μ L ddH206 μ L 正向引物F，4yM0.5μ L 反向引物R，4yM0.5μ L DNA 模板，20-50ng/ μ LI μ L 相应的反应程序为: ①95 O5min ②95°C30sec ③55°C30sec ④72°C30sec ⑤Goto ② for 40 cycles ⑥72。。7min ⑦4°C保存。
6.如权利要求5所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于所述DNA模板的制备方式为: 1)取鸡血50μ L，加Buffer A溶液500-550 μ L，充分混匀； 2)65°C恒温水浴2-4小时； 3)加BufferB溶液850 μ L，充分混匀；4)冰浴15-30分钟； 5)12000 rpm常温离心15分钟； 6)吸上清600-800μ L (如有必要再次12000rpm常温离心15分钟，吸上清)； 7)加氯仿600μ L,充分混合2-3分钟； 8)12000 rpm 离心 10 分钟； 9)吸取上清600μ L，加异丙醇600 μ L，充分混合2_3分钟； 10)12000 rpm常温离心10分钟； 11)去上清，加70%的酒精ImL洗涤沉淀； 12)12000 rpm常温离心3-5分钟； 13)去上清，真空离心抽风10分钟； 14)加TE 200yL，4°C溶解，
所述Buffer A溶液:100 mM Tris-Cl (pH 7.5)，100 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% SDS,室温保存， Buffer B溶液:取200 ml 5 M乙酸钾溶液和500 ml 6 M氯化锂溶液，充分混匀，4°C保存。`
7.如权利要求5所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于所述DNA模板的制备方式为: 10XPCR Buffer10 μ L 蛋白酶 K(20mM)30 μ L ddH2060 μ L 分装，每管1(^1^，然后加入14 1^抗凝血，551:下消化301^11，951:下15min，4°C保存。
8.如权利要求5所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于所述2XPCRMix是2倍浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和缓冲液。
9.根据权利要求5所述的所述的鸡快慢羽基因型的鉴别方法，其特征在于所述PCR扩增产物用Taq I内切酶进行酶切的酶切体系和方式为: IOXBuffer TaqI2 μ L TaqIdOU/μ L)I μ L ddH207 μ L PCR 产物IOyL 混匀，65°C消化16小时。
10.一种雏鸡雄雌鉴别方法，依据上述权利要求1-9中任意一种方法获得的羽速基因型构建配套系并进行雏鸡的雄雌自别，以纯合快羽公鸡和慢羽母鸡生产的子代中，慢羽雏鸡为公鸡，快羽雏鸡为母鸡。
【文档编号】C12Q1/68GK103509874SQ201310502809
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】韩文朋, 吴桂琴, 刘爱巧, 宋海泉, 石凤英, 李竞一, 赵春江 申请人:北京市华都峪口禽业有限责任公司