利用rt-lamp快速检测甘蔗黄叶病毒的方法
【专利摘要】利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法，根据甘蔗黄叶病毒的保守序列设计RT-LAMP检测的特异性引物共2对：一对外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，在61-63℃条件下恒温反应60-80min，利用电泳或者荧光染料的方法检测甘蔗黄叶病毒。采用本发明既能保证检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，并且也节省了成本，为甘蔗黄叶病毒的检测提供了一种快速、简便、有效的方法。
【专利说明】利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法，属于农业科学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甘鹿黄叶病又称作甘鹿黄叶综合症(Sugarcane yellow leaf syndrome, YLS),在上个世纪90年代初期由美国夏威夷首次报道，在留尼汪岛第一次利用电镜观察和血清学试验的方法鉴定该病害的病原为甘鹿黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV)。在2000年发布的ICTV第七次报告上,该病毒被确定为黄症病毒科未归属成员，命名为甘鹿黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV)。近年，该病毒在世界各鹿区迅速蔓延，并在多个蔗区造成严重危害。
[0003]环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其原理为:利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65°C左右)下保温几十分钟，即可实现核酸的扩增。反应结果可通过反应副产物焦磷酸镁白色沉淀的形成进行肉眼观察，或者通过浊度仪检测焦磷酸镁白色沉淀的混浊度来判定，也可在反应管中加入荧光染色试剂目测判定。该方法操作简单，无需特殊的仪器(PCR仪)，且此方法具有特异性强、灵敏度高等优点，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛的应用于人类和动植物各种病毒、细菌、真菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。
[0004]目前鉴定植物病毒常用的方法有:生物学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子生物学检测。其中分子生物学方法以PCR最为常见，但是PCR费时且需要昂贵的仪器(PCR仪)；而血清学检测方法中，较为常见的有ELISA及DIBA等，但是灵敏度不够高，特异性易受到限制。目前尚未见到使用LAMP方法检测甘蔗黄叶病毒的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法，能够灵敏、特异的检测出甘蔗黄叶病毒。
[0006]本发明所提供的一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法，包括如下步骤:
[0007]I)根据NCBI已报道的甘蔗黄叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物,其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP。
[0008]2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的总RNA ；
[0009]3 )利用M-MLV反转录酶把提取的RNA转化为cDNA ；
[0010]4)设置不同的Mg2+浓度、dNTPs的浓度以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT-LAMP扩增反应，确定最佳的反应条件。[0011]5)在最佳反应参数的条件下，以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性；
[0012].6)实验结果可以通过肉眼判断和1.5%的电泳检测进行验证。
[0013]7)本发明提供的引物序列如下:
[0014]F3:5-GCAATCGCACTTGAAGTGGA-3
[0015]B3:5-GCATTCAAATCGGCAGACG-3
[0016]FIP:5-TTCTTGGCGTTCCTCTTGACGG-TGCTCCCAAACAACAACAGG-3
[0017]BIP:5-ACGTCAGCTGACCAGTTTTGGT-TTGTCCTGCTAGGCTCGA-3
[0018]RT-LAMP的反应温度为61_63°C，反应时间为60_80min。利用电泳检测或者荧光染料检测可以检测出甘蔗黄叶病毒。
[0019]本发明的突出优点在于:
[0020]既能保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，并且也节省了成本，为甘蔗黄叶病毒的检测提供了一种快速、简便、有效的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为不同浓度的dNTP条件下RT-LAMP结果的电泳图。
[0022]图中，M:标准分子量；1、0.2mM ;2、0.8mM ;3、1.4mM ;4、2mM ;5、阴性对照。
[0023]图2为电泳检测甘蔗黄叶病毒的结果。
[0024]图中，M:标准分子量；1、甘蔗花叶病毒；2、阴性对照。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]甘蔗黄叶病毒RT-LAMP反应条件的优化
[0027]1、引物的设计:
[0028]F3:5-GCAATCGCACTTGAAGTGGA-3
[0029]B3:5-GCATTCAAATCGGCAGACG-3
[0030]FIP:5-TTCTTGGCGTTCCTCTTGACGG-TGCTCCCAAACAACAACAGG-3[0031 ] BIP:5-ACGTCAGCTGACCAGTTTTGGT-TTGTCCTGCTAGGCTCGA-3
[0032]甘蔗黄叶病毒RT-LAMP的dNTP的浓度优化设置梯度实验
[0033]RT-LAMP反应体系为:外引物F3和B3各0.25 μ M,内引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA 聚合酶(8U) I μ L，IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜碱 2 μ L，25mM MgS041 μ L，模版 2 μ L，DEPC处理的灭菌水加至25 μ L。dNTP混合物分别为:0.2mM、0.8mM、l.4mM、2mM ;63°C恒温反应lh，80°C反应5min终止RT-LAMP反应，实验结束之后取10 μ L扩增产物上样，在1.5%的琼脂糖胶上进行电泳，结果显示在1.4mM恒温反应条件下有明显的阶梯状扩增条带，如图1所示，因此本发明的RT-LAMP的最佳dNTP浓度为1.4mM。
[0034]实施例2
[0035]甘蔗黄叶病毒RT-LAMP反应的特异性试验
[0036]为了验证RT-LAMP的特异性，选择未感染甘蔗黄叶病毒的材料作为阴性对照，RT-LAMP反应体系为:外引物F3和B3各0.25 μ M，内引物FIP和BIP各1.5μΜ, Bst DNA聚合酶(8U) I μ L，IOXBst buffer2.5μ L，甜菜碱 2μ L，25mM MgSO4I μ L, dNTPl.4mM、模版2 μ L，DEPC处理的灭菌水加至25 μ L。63°C恒温反应Ih，80°C反应5min终止RT-LAMP反应，实验结束之后取IOyL扩增产物上样，在1.5%的琼脂糖胶上进行电泳，结果显示阴性对照没有出现阶梯状扩增条带，而有甘蔗黄叶病毒的RNA样本扩增出目的产物，如图2所示，这表明该RT-LAMP反应的特异性较好。
【权利要求】
1.利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)根据NCBI已报道的甘蔗黄叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物,其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP ； 2)利用RNAisoPlus法提取甘蔗植株的总RNA ； 3)利用M-MLV反转录酶把提取的RNA转化为cDNA； 4)设置不同的Mg2+浓度、dNTPs的浓度以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT-LAMP扩增反应，RT-LAMP反应温度为61-63°C，反应时间为60_80min ； 5)在最佳反应参数的条件下，以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性； 6)实验结果通过肉眼判断和利用1.5%的电泳检测进行验证或者荧光染料检测可以检测出甘蔗黄叶病毒。
2.根据权利要求1所述的利用RT-LAMP快速检测甘蔗黄叶病毒的方法，其特征在于，所述2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP的序列为:
F3:5-GCAATCGCACTTGAAGTGGA-3
B3:5-GCATTCAAATCGGCAGACG-3
FIP:5-TTCTTGGCGTTCCTCTTGACGG-TGCTCCCAAACAACAACAGG-3
BIP:5-ACGTCAGCTGACCAGTTTTGGT-TTGTCCTGCTAGGCTCGA-3。
【文档编号】C12Q1/70GK103509881SQ201310502520
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】陈保善, 司慧娟, 温荣辉, 吕榜丽, 周龙武 申请人:广西大学