专利名称：脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法
技术领域：
本发明涉及一种表达hPEPT2的海拉细胞的构建方法，尤其是一种操作简单、转染率高的脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法。
背景技术：
药物代谢动力学是研究药物活性成分、组分等在体内吸收、分布、代谢和排泄 (ADME)的动态变化规律，体内量-时效关系，并用数学函数加以定量描述的一门科学。药物在体内进吸收、分布、代谢以后，最终以原形或代谢产物经由尿、粪便等途径排出体外，因此药物排泄尤其是以经肾的尿排泄过程是药物研究中重要的一环。由于转运体是介导分子或离子转运跨过生物膜的物质，其作用贯穿于ADME过程的始终，为此，国内外药物代谢研究领域聚焦在CYP450代谢酶和转运体两大方面。PEPT2 (peptide transporter幻是一种高亲和力、低容量的人寡肽转运体，它在人体中分布广泛，主要表达在肾近端小管，在肾小管重吸收中起重要作用。PEPT2不仅能转运二、三肽，也可以识别和转运许多仿肽类药物，如内酰胺抗生素、血管紧张素转换酶抑制剂、贝他定等。目前，已有可表达hPEPT2的海拉(hela)细胞，为药物的排泄过程研究提供了一个高效、完整的生物体外模型，可以为药物的筛选、合理应用以及毒副反应的预测提供重要的理论依据。现有的表达hPEPT2的海拉细胞的构建方法基本上是DEAE-葡聚糖法及磷酸钙法， DEAE-葡聚糖法虽然相对便宜，但对细胞有一定的毒副作用，常用于维持时间较短的瞬时转染；磷酸钙法虽操作简便但重复性差。尽管脂质体介导也是构建转染细胞模型的常用方法，具有操作简单、转染率高等特点，但是迄今为止还没有将脂质体介导法应用于构建表达 hPEPT2的海拉细胞的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、转染率高的脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法。本发明的技术解决方案是一种脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，其特征在于按如下步骤进行—种脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，其特征在于按如下步骤进行a.将处于对数生长期的海拉细胞用0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA混合消化液制成单细胞悬液；b.将单细胞悬液接种于6孔培养板上，接种密度为5*105/ml，在细胞转染前，将培养液更换为无血清、无双抗的DMEM培养液；C.制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物；d.当海拉细胞融合度达到60 70%时，将6孔板中的海拉细胞用D-Hanks冲洗后，再加入2ml无血清、无双抗的DMEM培养液；6孔板的每个单孔中均逐滴加入500 μ 1脂质
3体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物，摇动培养板，轻轻混勻，置于37°C，5%的CO2,相对湿度90 %的细胞培养箱中6小时，更换含有血清、无双抗的DMEM培养液，重新置于37°C，5 % 的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养48h，完成细胞转染；e.用浓度为lg/ml的G418配制含有血清无双抗的DMEM培养液，0. 22 μ m滤膜过滤，4°C保存；取空质粒转染的海拉细胞接种于M孔细胞培养板中，细胞密度1000个/ml， 将培养液同时更换为至少6个梯度含G418的有血清无双抗DMEM培养液，每孔^il,置于 37°C，5%的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养；每3天更换相应浓度G418有血清无双抗DMEM培养液，以在10 14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度为筛选浓度标准， 以紧邻筛选浓度标准的高一梯度G418浓度作为筛选浓度；f.将d步骤所得完成细胞转染的细胞传代于新6孔板中，加入筛选浓度的含G418 的有血清无双抗DMEM培养液，待细胞集落形成后，采用挑单克隆技术，将筛选后的细胞转移至M孔板中，置于37°C，5%的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养。所述c步骤是配制溶液I :240 μ 1无血清、无双抗的DMEM培养液加入10 μ 1脂质体转染试剂，混勻，室温下静置5min ；配制溶液II 200 μ 1无血清、无双抗的DMEM培养液加入50 μ 1浓度为80 μ g/ml 的hPEPT2质粒溶液，混勻，室温下静置5min ；将溶液I、溶液II混勻，得到总体积为500 μ 1的制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物，混勻，室温下静置20min。所述至少6 个梯度为 G418 浓度为 300，500，700，800，900 和 1000 μ g/ml。本发明是用脂质体转染法将hPEPT2的质粒转入海拉细胞中，并筛选出稳定转染的细胞。操作简单，没有免疫原性，对细胞没有毒副作用，重复性好，hPEPT2基因转染效率高达30 40%。
具体实施例方式a.将处于对数生长期的海拉细胞用0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA混合消化液，制成单细胞悬液；b.将单细胞悬液接种于6孔培养板上，接种密度为5*105/ml，在细胞转染前，将培养液更换为无血清、无双抗的DMEM培养液；c.制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物；具体制备方法是配制溶液I :240 μ 1无血清、无双抗的DMEM培养液加入10 μ 1脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000，混勻，室温下静置 5min ；配制溶液II 200 μ 1无血清、无双抗的DMEM培养液加入50 μ 1浓度为80 μ g/ ml的hPEPT2质粒溶液(质粒提纯后经琼脂糖凝胶电泳定量分析测得hPEPT2质粒浓度为 80 μ g/ml)，混勻，室温下静置5min ；将溶液I、溶液II混勻，得到总体积为500 μ 1的制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物；，混勻，室温下静置20min ；d.当海拉细胞融合度达到60 70%时，将6孔板中的海拉细胞用D-Hanks冲洗
4两遍后，再加入2ml无血清、无双抗的DMEM培养液；6孔板的每个单孔中均逐滴加入500 μ 1 制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物，摇动培养板，轻轻混勻，置于37°C，5 %的 CO2,相对湿度90%的细胞培养箱中6小时，更换含有血清、无双抗的DMEM培养液，重新置于 37°C，5%的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养48h，完成细胞转染；e.用浓度为lg/ml的G418配制含有血清无双抗的DMEM培养液，0. 22 μ m滤膜过滤，4°C保存；取空质粒转染的海拉细胞接种于M孔细胞培养板中，细胞密度1000个/ml， 将培养液同时更换为6个梯度含G418的有血清无双抗DMEM培养液，每孔^il,即4个孔的培养液为同一梯度，6个梯度是G418浓度为300，500，700，800，900和1000 μ g/ml，然后将 24孔细胞培养板置于37°C，5%的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养；每3天更换相应浓度G418有血清无双抗DMEM培养液，以在10 14天内能够杀死所有细胞的最小G418 浓度(700 μ g/ml)为筛选浓度标准，以紧邻筛选浓度标准的高一梯度G418浓度(800 μ g/ ml)作为筛选浓度；f.将d步骤所得完成细胞转染的细胞传代于新6孔板中，加入G418浓度为 800 μ g/ml的有血清无双抗DMEM培养液培养，待细胞集落形成后，采用挑单克隆技术，将筛选后的细胞转移至M孔板中，置于37°C，5%的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中扩大培养。原料来源见下表
权利要求
1.一种脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，其特征在于按如下步骤进行a.将处于对数生长期的海拉细胞用0.25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA混合消化液制成单细胞悬液；b.将单细胞悬液接种于6孔培养板上，接种密度为5*105/ml，在细胞转染前，将培养液更换为无血清、无双抗的DMEM培养液；c.制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物；d.当海拉细胞融合度达到60 70%时，将6孔板中的海拉细胞用D-Hanks冲洗后， 再加入2ml无血清、无双抗的DMEM培养液；6孔板的每个单孔中均逐滴加入500 μ 1脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA复合物，摇动培养板，轻轻混勻，置于37°C，5%的CO2,相对湿度 90 %的细胞培养箱中6小时，更换含有血清、无双抗的DMEM培养液，重新置于37°C，5 %的 CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养48h，完成细胞转染；e.用浓度为lg/ml的G418配制含有血清无双抗的DMEM培养液，0.22 μ m滤膜过滤，4°C 保存；取空质粒转染的海拉细胞接种于M孔细胞培养板中，细胞密度1000个/ml，将培养液同时更换为至少6个梯度含G418的有血清无双抗DMEM培养液，每孔^iil，置于37°C ,5% 的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养；每3天更换相应浓度G418有血清无双抗DMEM 培养液，以在10 14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度为筛选浓度标准，以紧邻筛选浓度标准的高一梯度G418浓度作为筛选浓度；f.将d步骤所得完成细胞转染的细胞传代于新6孔板中，加入筛选浓度的含G418的有血清无双抗DMEM培养液，待细胞集落形成后，采用挑单克隆技术，将筛选后的细胞转移至 24孔板中，置于37°C，5%的CO2，相对湿度90%的细胞培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，其特征在于所述c步骤是配制溶液I :240 μ 1无血清、无双抗的DMEM培养液加入10 μ 1脂质体转染试剂，混勻， 室温下静置5min ；配制溶液II 200 μ 1无血清、无双抗的DMEM培养液加入50 μ 1浓度为80 μ g/ml的 hPEPT2质粒溶液，混勻，室温下静置5min ；将溶液I、溶液II混勻，得到总体积为500μ 1的制备脂质体转染试剂ΛΡΕΡΤ2质粒DNA 复合物，混勻，室温下静置20min。
3.根据权利要求1或2所述的脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，其特征在于所述至少6个梯度为G418浓度为300，500，700，800，900和ΙΟΟΟμ g/ml。
全文摘要
本发明公开一种脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法，是用脂质体转染法将hPEPT2的质粒转入海拉细胞中，并筛选出稳定转染的细胞。操作简单，没有免疫原性，对细胞没有毒副作用，重复性好，hPEPT2基因转染效率高达30～40％。
文档编号C12N5/10GK102154212SQ20101061588
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者刘克辛, 刘琦, 孟强, 王长远, 郭鑫金 申请人:大连医科大学