免预培养高效菊苣遗传转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，尤其是一种免预培养高效菊苣遗传转化方法。
【背景技术】
[0002] 菊苣是菊科多年生草本植物，又称咖啡草或咖啡萝卜。其根、叶均可食，是一种重 要制糖原料、香料、蔬菜及饲草作物；同时是一种重要的制药原料，富含倍半萜烯内酯、糖 苷、类黄酮、香豆素、花青素、有机酸与细胞分裂素等，具有治疗腹泻、发热及呕吐功效。自从 20世纪80年代引入我国后，在山西、陕西、浙江、河南等地推广，现主要分布在西北、华北、 东北等暖温带地区。然而由于菊苣原产地在欧洲，我国拥有的野生种质资源比较匮乏，以常 规育种的方法对菊苣遗传改良受到极大的限制。同时其适宜性广，在全国各地都有种植，但 在各个区域可能面临不同的制约条件，所以借助现代分子生物学手段实现种质创新，是菊 苣育种的一个重要环节。转基因方法能够打破物种界限，快速定向的对目标性状进行遗传 改良，加快育种进程，是一种高效、经济的新技术。
[0003] 菊苣的体外再生体系从上个世纪80年代就已经开始研究，1985年Profumo等首 次利用悬浮细胞系成功诱导了体细胞胚，培育了再生植株，随后的科学家利用根结、叶片、 叶柄、茎等不同外植体都成功培育了再生植株。在随后的研究中，通过在培养基中添加甘 油、七叶树甙、硫酸腺嘌呤盐等物质提高菊苣组织培养过程中愈伤与体外再生植株形成的 概率，但转化效率仍然不高。最近的研究主要集中在对组织培养过程的激素种类和浓度进 行优化，特别是强细胞分裂素噻苯隆（TDZ)和6-苄基腺嘌呤（6-BA)的应用，显著提高了组 织培养过程中愈伤诱导与植株分化的成功率，组培体系的成功建立为转基因研究奠定了基 础。
[0004] 与其它农作物相比，菊苣转基因研究开展的相对较晚，涉及的目标基因主要包括 抗性基因#尸7；报告基因6K5和似7/^，功能基因的遗传转化仅限于抗冻基因^抗坏血 酸过氧化物酶也兄编码Na+/H+转运蛋白的基因等。这些遗传转化方法大都采用3-4 周的植株叶片作为外植体，在农杆菌转化之前，外植体材料需先经过一个预培养过程，经农 杆菌侵染之后的外植体因受到伤害较大而死亡，愈伤与再生芽的诱导率较低，整个过程较 为繁琐。错过外植体最佳取样时期、预培养时间不合适以及农杆菌侵染的毒副作用往往导 致转化效率下降甚至转化失败。因此，研究更加简单、高效、稳定的菊苣转基因方法是实现 对菊苣高通量遗传转化的前提与技术瓶颈。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是：提供一种免预培养高效菊苣遗传转化方法，它转化成功率高，能 减少玻璃化苗的比例，且转化程序简单、成本低廉，以克服现有技术的不足。
[0006] 本发明是这样实现的：免预培养高效菊苣遗传转化方法，将消毒好的菊苣种子播 种于种子培养基中，完全遮光培养3-5天；取分生能力旺盛的子叶组织为外植体；将农杆菌 采用农杆菌悬浮培养基进行活化后，直接用农杆菌侵染后，采用共培养培养基进行共培养、 采用愈伤诱导培养基进行诱导愈伤、采用分化培养基进行诱导再生芽，以及采用生根培养 基进行生根；利用光诱导子叶细胞快速分裂的特性，实现快速高效地对菊苣的遗传转化。
[0007] 所述的种子萌发培养基是以1/2MS为基础，包括10g/L蔗糖及8g/L琼脂；共 培养培养基是以MS培养基为基础，包括10g/L蔗糖、8g/L琼脂、0.01mg/LTDZ及lmg/L IAA;愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础，包括15g/L蔗糖、10g/L琼脂、2mg/L6-BA 、1mg/LIAA、300mg/L头孢霉素及25mg/L卡那霉素；分化培养基是以MS培养基为基础， 包括 15g/L鹿糖、10g/L琼脂、1mg/L6-BA、lmg/LIAA+300mg/L头孢霉素及 25mg/L 卡那霉素；生根培养基是以MS培养基为基础，包括10g/L蔗糖、7g/L琼脂、1mg/LNAA及 300mg/L头孢霉素。
[0008] 由于采用了以上技术方案，本发明采用子叶组织作为外植体，与传统外植体真叶 相比，常规外植体（4周大的叶片或叶柄等）比较脆弱，承受不了酒精和84消毒液(次氯酸 钠）的毒害而只能用剧毒的升汞来灭菌。本发明采用的子叶外植体可以由消毒的种子萌发 而来，而子叶由于有种皮保护，因此，可以采用酒精和84消毒液灭菌方法，同时也保护了实 验操作者和环境免受升汞的危害。本发明简化了实验步骤、缩短了实验时间、极大地减少 了实验成本。现有技术中，外植体准备需要4周，制备的外植体需要预培养2-3天，本发明 外植体准备只要3-5天，而且不需要经过预培养；由于子叶细胞贮存了丰富的营养物质，因 此利用黑暗条件抑制子叶细胞分裂，在恢复光照条件后其利用自身营养物质迅速分裂的特 点，不需要对外植体预培养可直接用于遗传转化，极大的减少了人力、物力与时间成本。本 发明方法简单，易于实施，成本低廉，使用效果好。
【附图说明】
[0009] 图1为转化菊苣所用载体示意图； 图2本发明进行遗传转化的效果图； 图3本发明改良的培养基与现有技术的培养基比较图； 图4为转基因植株检测效果图； 图5为本发明与已报道的菊苣遗传转化流程比较示意图。
【具体实施方式】
[0010] 本发明的实施例：转化菊苣所用载体的构建： RNA提取采用TRIZOLTMKit，cDNA第一链的反转录采用RevertAid?HMinusFirst StrandcDNASynthesisKit(Fermentas)，具体操作参照所用试剂盒说明进行。在Tair数 据库中检索拟南芥基因的序列，设计正向引物：[5'-CATGGAirCATCTTCATCGITTCTC AAITTCA-3 ' ];反向引物：[5 ' -CATGAGCTCCAITTATCAAACAAAACAACAAGAC-3 ' ]，克隆J 序列并将其连接到载体，挑选测序分析正确的克隆与-起用BamHl和 Sacl酶切，回收基因片段和载体片段并连接，挑选出阳性克隆，提取质粒并转化农杆菌 GV3101，具体流程参照图1。
[0011] 本发明的实施例2:菊苣遗传转化程序： 1、培养基的配方与准备 按照表1准备转化所需的培养基，灭菌备用。
[0012] M。:种子萌发培养 Mi:共培养培养基 M2:愈伤诱导培养基M3:分化培养基 m4:生根培养基 2、种子消毒与外植体制备 (1)挑选300粒饱满的菊苣种子，放入50ml离心管中（Nalgene，商业途径获得)，用45ml自来水浸泡10-15min,去除表面漂浮的劣质种子与自来水。
[0013] (2)加入45ml75%的酒精，剧烈震荡，消毒处理2-3min。
[0014] (3)去除酒精，加入45ml84消毒液(洁阿姨，商业途径获得)，剧烈震荡，消毒处理 10-15min〇
[0015] (4)去除84消毒液，重复步骤（3) -次。
[0016] (5)去除84消毒液，用45ml灭菌水清洗种子3-5次。
[0017] (6)将消毒好的种子播种于