文中载体 pZH36D 应用了质粒ColEl的复制起始位点和来源于质粒pVSl的复制起始位点分别在大肠杆菌和农杆菌中起始复制；下文中其余的载体包括分子A、B、C、D、E均用来源于质粒pBR322的复制起始位点起始复制。大肠杆菌 DH5 a {F endAl gin V44 thi~l recAl reIAl gyrA96 deoR nupG080dlacZA MJ5 Δ (lacZYA~argF)U169 hsdR17(rK %Λ』_)被应用于重组分子的转化及回收。
[0038])载体A的构建载体A含有2个不同的不可逆重组位点Al和A2，Al与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点Al的另一端连有可逆的重组位点A’ ；载体A中还含有筛选标记基因。在本实施例中不可逆重组位点Al为phiC31 a?/重组位点，不可逆重组位点A2为Bxbl组位点，可逆的重组位点A’为Cre 1x重组位点，筛选标记基因为氯霉素抗性基因和抗除草剂基因如r，插入的目的基因为如图1 (a)所述。
[0039]载体A的具体构建过程如下所述:
来源于载体 pYWSP3 (Lili Hou, Yuan-Yeu Yau, Junjie Wei, Zhiguo Han, ZhichengDong, David ff.0w An Open-Source System for In Planta Gene Stacking by Bxbland Cre Recombinases.Molecular Plant, Dec 2014)的 phiC31 attP~lox DNA 片段由 PCR 扩增得到，引物为 5’ -CCCA AGCTTAAATATGATATCTGGGCCCC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-AGCTTTGTTTAAACTCGGTG ATAACTTCGTATAATGTA-3，( SEQ ID N0:2)，并通过作￡? I 和Hind I I I限制性酶切位点插入到pC35ScreB (来自Ow lab)中，从而获得中间载体pDTOlo 严(CaMV 35S promoter)~gus~ nos 3， (nopaline synthase gene terminator)DNA 片段由 PCR 从 pCAMBIA1301 载体中扩增得到，引物为 5’_CGAGCTCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGA-3’ (SEQ ID NO:3)和 5，_CCCAAGCT TCTCTTAGGTTTACCCGCCAATAT-3，(SEQ ID NO:4)，并插入到PDTOl载体的历III和I位点之间，获得载体pDTC^dDTO〗中的户55被从载体 pYWSP72( Yuan-Yeu Yau.Yueju Wang.James G.Thomson and David ff.0w Methodfor Bxbl-mediated site-specific integrat1n in planta.Methods Mol.B1l.2011)中通过PCR扩增而得到的竹节花黄斑驳病毒(CommelinaYellowMottleVirus, CoYMV)启动子所取代，从而得到载体PDT03。Cai基因(氯霉素抗性基因)由PCR从载体pACY⑶uet_l(N0VAGEN)中扩增得到并插入到载体 pYWJTSB2 (Yuan-Yeu Yau.Yueju Wang.James G.Thomson and David ff.0w Method for Bxbl-mediated site-specific integrat1n inplanta.Methods Mol.B1l.2011)白勺 I Pvu I 之间，得到载体 pCat。由 CaMV 35Stermiriator-bai^F^5S-F-gus-nos3f -phiC31所组成的 DNA 片段通过 PCR 的方法从载体 PDT03 中扩增得到，引物为 5’ - ATTTGCGGCCGCGACGCTT AGACAACTTAATAAC-3’ (SEQID N0:5)和 5’- GGACTAGTTCGGTGATAACTTCGTAT AATGTA-3’ (SEQ ID NO:6)，并插入到载体pCat的Abi I和分e I之间，得到载体pDT04。然后把一段人工合成的Bxbl attB序列(5，- CCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCC GTCGTCAGGATCATCC-3’ (SEQ ID NO:7))插入到载体PDT04的说oR I位点上，从而得到pDT05。最后，位于载体pDT05 Pst I和Hind III之间的1x重组位点被一段人工合成的1x位点所取代(用以改变1x的方向，序列不变)，从而得到最终载体A。
[0040])载体B的构建
载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有BI，BI的另一端连有可逆的重组位点B’ ；载体B中还含有筛选标记基因。在本实施例中不可逆重组位点BI为Bxbl ai拔重组位点；B2和B3均为phiC31 ai拔重组位点，二者同向；可逆的重组位点B’为Cre 1x重组位点，筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因办/A插入的目的基因为hc，如图1 (a)所述。
[0041]载体B的具体构建过程如下所述:
由ph1> I a ttB-loM.成的DNA片段通过PCR从载体pYWJTSB2中扩增得到，引物为 5’ -CGAG CTCCGGGATCCATGGACCAGATGGGTGAGGTG-3，(SEQ ID NO:8)和 5’ -GGACTAGTAGTGTCGTGCTCCACCATGGT-3’ (SEQ ID NO:9)，并通过 TA 连接插入到 pMD18 中，得到分子phiBB’ -lox-Τ。一段人工合成的Bxbl aiii?序列被插入到位于phiC31 和1x之间的 Sac II 位点之间得到分子 phiBB，-BxbIBB? -1ox-T0 分子 phiBB，-BxbIBB? -1ox-T 中的phiC31 attB-Bxbl attB-lox序列由Spe I和Sac I酶切得到，并连接到载体pYWJTSB2的骨架(骨架也用分e I和Sac I双酶切)中，得到分子pDDOl。由phiC31 attB_Pd35S (CaMVpromoter with duplicated enhancer)-1uc (firefly luciferase)-ocs3> (octopinesynthase terminator)组成的DNA序列由PCR的方法获得，并分两部分克隆到pDDOl中得到分子 PDD03。第一部分由引物 5’- CG AGCTCGGGGTACCAAGCTTTCCATGGAAGACGC-3’ (SEQID NO:10)和 5，-CGGGATCCT GAATGGTGCCCGTAACTTT-3’ (SEQ ID NO: 11) PCR 扩增得到，并通过SacI和BamHI位点克隆到pDDOl中，获得载体pDD02。第二部分由引物5’-CGAGCGTGTCCTCTCCAAAT-3’ (SEQ ID NO: 12)和 5’- CGAGCTCCATCATGATGGACCAGATGG-3’(SEQ ID NO: 13)PCR扩增得到，并通过SacI和HindII I位点克隆到pDDO中，获得pDD03。
[0042]然而，测序发现在P35s上游多了一 phiC31 位点，因此该位点通过Abi I和Pac I双酶切去掉并将粘性末端DNA用DNA聚合酶I大片段抹平，并进行平末端链接，进而得到分子PDD04。pDD04中的1x位点最后由一个人工合成的1x位点取代，用以改变其方向(序列不变)，最终得到分子B。
[0043])分子C的构建
载体C中含有3个不可逆重组位点C1、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有Cl，Cl的另一端连有可逆的重组位点C’ ；载体C中还含有筛选标记基因。在本实施例中不可逆重组位点Cl为Bxbl组位点；C2和C3均为phiC31 重组位点，二者同向；可逆的重组位点C’为Cre 1x重组位点，筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因办/A插入的目的基因为67?如图1 (a)所述。
[0044]载体C的具体构建过程如下所述:
由ph1> I a t成的DNA片段通过PCR从载体pYWSP3中扩增得到，引物为5’- CGAGCTCCCCGGAATTCAAATATGATATCTGGGCCCC-3’ (SEQ ID NO: 14)和 5’- GGACTAGTTCGGTGATAACTTCGTATAATGTA-3’ (SEQ ID NO:15)，并通过 TA 连接插入到 pMD18 中，得到分子phiPP’-1ox-T ;再将一段人工合成的Bxbl 序列被插入到位于phiC31 attP$\ 1x之间的 Pst I 位点之间得到分子 phiPP’ -BxbIBB? -1ox-T0 分子 phiPP’ -BxbIBB? -1ox-T中的phiC31 attP-Bxbl attB-lox序列由Spe I和Sac I酶切得到，并连接到载体pYWJTSB2 的骨架中，得到分子 pDD05。由 j?AiC31 aii/^-sugarcane Bacilliform viruspromoter (,)-green fluorescent protein (gfp) -nos terminator 组成的 DNA 序列由PCR 的方法从载体 pYWSP3 上扩增获得，引物为 5’ - CGAGCTCCCCTTGTGTCATGTCGGCGAC-3’(SEQ ID N0:16)和 5’- CGGAATTCACCCATGAGAGCCCTGGTAGTC-3，(SEQ ID N0:17)，并连接到PDD05的Sac I和AcoR I中得到分子pDD06。pDD06中的Bxbl attB -1ox序列被一段人工合成的Bxbl-Asc1-1ox序列所取代，该过程目的为改变原有1x位点的方向，从而得到分子C。
[0045])载体D和E的构建