专利名称：一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及治疗和预防人乳头瘤病毒感染和子宫颈癌相关的领域，尤其在设计和 使用的El解旋酶抑制剂，以预防或治疗HPV相关宫颈癌和其他疾病。
背景技术：
子宫颈癌(Cervical Cancer)是世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的 第二号杀手(国际卫生组织资料)，每年造成约超过30万成年女性因患子宫颈癌而死亡。 目前已证实导致宫颈癌的病因是人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)的DNA 致癌病毒的侵染所致。该病毒主要通过两性接触传染，专性侵染人体上皮细胞特别是生殖 器官，部分病毒携带者在反复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型(HPV16、HPV18 等)病毒感染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成I-III的宫颈内皮细胞瘤样 变(CINI-III)和浸润性宫颈癌变(ICC)，最终发展成致命的子宫颈癌。HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、HPV18等13种高危 险类型，已被确认能够导致宫颈癌症。部分低危险型(HPV6、HPVll等)病毒感染可导致男 女两性生殖器官部位的尖锐湿疣。HPV除了直接导致宫颈癌，新的研究质料也提供了证据， HPV的感染很可能和支气管肺癌、直肠癌、口腔癌和皮肤癌等癌症有这紧密的关系。根据国 际卫生组织WHO的有关资料，除了导致宫颈癌，HPV感染还可能和60 %的皮肤癌，60 %的食 管癌，50%的肺癌、50%的乳腺癌、25%的口腔癌等人类重大癌症的发病相关。目前国内外还没有任何有效的预防和治疗人乳头瘤病毒的化合物，主要是由于很 难通过常规的手段(如普遍撒网的大通量筛选等)找到针对该病毒的具有特异性高的抑制 剂化合物。而由于我们对人乳头瘤病侵染毒繁殖所必须的解旋酶的分子结构和分子机理的 掌握和了解，我们可以通过对分子结构进行计算机的模拟和分析，并通过以结构为基础的 分子对接用计算机对大分子库进行有效的筛选，从而能从几十万到上百万的分子库中很快 的选出能结合目标蛋白的少数的化合物，从而通过试验筛选很快验证和确定具有对目标蛋 白有高特异性的抑制功能的化合物。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述缺陷，提出一种方便、省时、高效的预防和 治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，并提供了通过上述筛选方法筛选出来 的特异性高、针对性强的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，由其指出了其在 预防和治疗HPV感染、子宫颈癌及尖锐湿疣等疾病上的应用。实现上述目的的技术方案如下—种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，采用结构计算机 辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒El解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制El的候选 化合物。
进一步地，所述的以人乳头瘤病毒El解旋酶结构为基础包括(a) 一个由原子坐标确定下来的El蛋白分子结构和由El形成的六聚体的结构；(b) 一个由原子坐标确定下来的El蛋白分子与ATP或ADP相结合的复合体结构；(c) 一个El蛋白单独的结构或与一个化合物或多肽结合的复合体结构。进一步地，上述筛选方法还包括El解旋酶功能检测，所述El解旋酶功能检测方法 采用电泳迁移率试验。本发明还提供了利用上述筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病 的化合物，所述化合物为曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物。进一步地，本发明所述的人乳头瘤病毒感染类疾病包括子宫颈癌或尖锐湿疣。即本发明主要是使用乳头瘤病毒El解旋酶的三维分子结构，来设计和筛选特异 对El抑制剂，用于治疗和预防HPV感染及相关的宫颈癌和尖锐湿疣药物。本发明所述阐明 了一个通过结构和计算分析设计，以及试验筛选的方法来找到针对El分子靶点的有效抑 制化合物。这些化合物结合在El空间分子结构的不同的点，用于破坏El自身的功能，阻断 El与DNA，与三磷酸腺苷，以及与E2的相互作用，所有这些都是El对病毒基因组复制必不 可少的功能。本发明提供了对抑制El功能的抗HPV病毒分子药物的设计，筛选，识别和检 测的方法，同时还提供对这类抑制剂化合物在预防和治疗病毒感染和癌症(包括但不限于 在HPV和宫颈癌和尖锐湿疣上使用这些化合物)中的应用。本发明主要是基于以下原理进行相关化合物筛选的HPV是DNA病毒，病毒的基因是DNA。病毒进入人体上皮细胞后，其DNA基因必须 在细胞内复制，才能完成病毒的繁殖和侵染，而病毒DNA基因的复制必须要HPV病毒的解 旋酶，El蛋白，来打开病毒DNA双链。同时，HPV El和HPV E2蛋白的结合和相互作用也对 病毒DNA的复制起动有着关键的作用，因而，HPV El和HPV E2也称DNA复制启动子。上述 HPV El蛋白的功能为ATP酶和DNA解旋酶；以六倍复合体的形式识别并结合在DNA复制的 病毒起源点；它是病毒DNA复制所必须要的。HPV E2蛋白的功能为病毒基因转录的主要 调节因子；以二聚物的形式与病毒转录引物结合；参与病毒DNA复制过程；与El相互作用 并使El补充到病毒复制起源点。人乳头瘤病毒的复制，需要有几个不同的生物活性环节，包括病毒DNA由病毒的 DNA解旋酶El把DNA双链打开，并以此作为复制模板由细胞的酶聚合酶启动DNA复制引物。 El解旋酶的突变或El酶的抑制化合物可导致病毒DNA复制失败，阻断病毒的复制，以达到 预防和抑制HPV病毒的侵染，从而预防和治疗子宫颈癌的效果。人乳头瘤病毒El解旋酶和人体细胞的解旋酶(称MCM)几乎没有氨基酸序列的保 守性，MCM解旋酶是为人体细胞染色体的复制的酶。HPV El和MCM在立体结构上有着根本 的不同(Brewster et al，PNAS，2008)。由于El的解旋酶对HPV病毒的复制是必不可少的， 而El和MCM解旋酶的序列和结构都不同，这样，El解旋酶提供了一个极好的特异性很高的 防病毒的药物靶点。因为El是针对病毒的高特异性分子靶，针对El的药物可以帮助降低 对人体细胞的毒性。由于解析出了 HPV El蛋白分子的晶体结构，我们能够通过分子结构的分析和建立 分子结构模型来设计和开发El酶的有效的抑制剂作为抗病毒和抗子宫癌的小分子药物。 这些El酶的有效小分子抑制剂同时也可作为分子工具，用来进一步研究解旋酶的功能和调控机制。到目前为止，尚无任何有效的药物来抑制人乳头状瘤HPV病毒的复制，侵染和繁 殖。针对人乳头状瘤病毒El的解旋酶的小分子药物，是一种全新的抑制HPV病毒复制的有 效药物。根据在此显示的El和核苷酸(ATP和ADP)复合体的原子结构模型，我们能够通过 对结构模型的详细的计算分析，来帮助我们设计对El解旋酶的小分子抑制剂，以便达到对 El本身活性的抑制，或对El与DNA或与E2或其它DNA复制蛋白的相互结合的抑制，从而能 有效地抑制HPV病毒的复制，可用于治疗HPV感染以及相关的子宫颈癌和尖锐湿疣等疾病。下面对本发明中涉及的结构计算机辅助药物设计的结构基础-人乳头瘤病毒El 解旋酶结构作进一步的介绍本发明所指的人乳头状瘤病毒(HPV)El蛋白是指包含50个或更多氨基酸的El多 肽序列，或更长的El，包括全长El蛋白，El本身，或作为El融合蛋白。一个同源蛋白的蛋白质，包括不是天然出现的蛋白质，并且有一个或几个氨基酸， 但不局限于一个或几个氨基酸的不同或被删除(例如，蛋白质截断的片段)，或被插入倒， 取代和/或衍生(如糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蔻酰化，异戊二烯化等)。最好是一个具有 特定同源蛋白质的氨基酸序列至少和一种天然蛋白质有约30%的相似性。一个纯化的蛋白质，根据本发明，是一个已经从它的天然环境(即已受人为操做 过程)，可以包括纯化或部分纯化的蛋白质，基因工程产生的蛋白质，或是合成产生的蛋白 质。因此，“纯化”并不反映蛋白质纯化的何种程度。最好是一个纯化的蛋白质，尤其是其片 段，使用基因工程产生的蛋白质，或是合成产生的蛋白质(如果是一个较小的蛋白质肽)。 术语“片断”是指蛋白质的一部分。作为对人乳头状瘤病毒El的结构数据分析的结果，这 个蛋白质的各个部分的结构和功能特性对计算机辅助药物设计方法具有重要的价值。使用 的人乳头状瘤病毒El多肽蛋白部分片断的结构和功能来设计和筛选药物的方法是本发明 的一部分。本发明所提到的人乳头状瘤病毒E 1解旋酶，包括人乳头状瘤病毒HPV类型6，11， 16，18，35，52，58和所有其他已知的HPV类型的El解旋酶蛋白，以其一级结构(例如，序列) 和二级结构，和三级结构的相似。换言之，包括任何一种HPV病毒的El解旋酶以及具有相 似的结构和功能的解旋酶。因此，人乳头状瘤病毒El的病毒解旋酶蛋白，通过举例的方式， 可以包括纯化，部分纯化，重组，突变/修饰，合成蛋白质多肽。本发明提供了 HPV El解旋酶与核苷酸复合物的三维结构的原子坐标。本发明也 提供了根据这三维结构信息来确定能抑制该El解旋酶的药物结合部位，包括阻止六聚体 的形成，核苷酸的结合，及与HPV E2的相互作用。本发明还包括了特异针对El的解旋酶抑 制剂药物的筛选实验。本发明的一个体现，涉及到以结构为基础来鉴定抑制剂化合物，用于调节和抑制 乳头状瘤病毒El解旋酶在病毒复制中的作用。这种抑制化合物可以调节El蛋白结合核苷 酸或DNA的能力，或是与另一乳头状瘤病毒E2蛋白的结合能力。该方法是一个结构计算机 辅助药物设计方法为基础，包括如下步骤(1)提供可以确定El三维结构的原子坐标，包括 此处所述的El三维结构的原子坐标；及(2)通过对三维结构的分析计算机模拟来筛选出结 合在某一个特定结构区域的抑制剂化合物。这里披露了合适的结构和模式结构可用以作对El的药物设计。在结构为基础的药物设计方法的首选的目标结构，包括用任何建模方法产生的任何结构模型，如通过结构 分子置换和同源序列的模型建立。根据本发明，首选的药物设计步骤从一个或多个化合物的数据库通过计算机筛 选，根据El三维结构来和化合物的数据库进行匹配和对接。如果由本发明的方法筛选确定 合适的化合物后，可以直接合成和测试该化合物本对一个或多个人乳头瘤El解旋酶的调 节和抑制作用，以及和El的结合的具体方式。本发明的以El结构为基础的药物设计中的一个体现，是包括能根据El单体或六 聚体的结构来确定能与之结合化合物，此化合物能结合的条件之一是和结合部位有互补的 形状。这种方法在此被称为“几何方法”。在一个几何方法中，内部自由度(和相应的分子 构象空间的局部极小值)通过只考虑两个，刚体(硬球)的几何相互作用可以得到降低， 其中一个刚体含有一个“口袋”或“沟”的位点用于结合第二个刚体(及与之形状上互补的 分子，如配体，或化合物)。这种几何方法在Kuntz et al. , J. Mol. Biol. ,vol. 161, p. 269, 1982中也有描述。用这种几何方法确定的化合物分子可以通过设计和修改，来以满足这些 化合物在这个口袋或沟的结合位点具备化学互补性，形成如氢键，离子键，或范德华键等相 互作用。根据本发明，使用本发明的方法测试合适的入选的化合物可包括蛋白质，多肽或 其他有机分子和无机分子。合适的有机分子包括有机小分子。肽是指小分子量的化合物经 水解产生两个或两个以上氨基酸。多肽是指两个或两个以上肽。首选治疗化合物的设计包 括“L”和/或“D”氨基酸组成的肽，有机小分子，或同质或异质聚合物，包括直链或有支链 聚合物。一个能结合El并能调制(调节，修改，上调，下调)E1解旋酶的活性的候选化合 物可通过本发明以上讨论的以结构为基础的筛选方法来确定。至于候选的化合物对El蛋 白靶点的实际结合能力可用在一些下面详细讨论的已知的技术来确定。一个“推定的化合 物”是一个未经证实是否有调节抑制活性的化合物，至少对于这样一个化合物对El的结合 能力和/或调节生物活性来说。因此，一个公认的化合物库可使用这里讨论的以结构为基 础的筛选鉴定方法，来筛选出可以结合并调节，甚至模仿其中的目标蛋白质或位点的一个 或多个候选化合物。另外，一个能结合El的目标蛋白候选化合物也可以使用以上讨论的结 构为基础的药物设计来从头设计。本发明用以测试这些筛选出的化合物的实际效果可以包括基于细胞的检测和非 基于细胞的检测。一个特别优选的非细胞为基础的检测，是电泳迁移率试验(EMSA)。更具 体地说，电泳迁移率试验(EMSA)可以用来监测双链DNA是否在有ATP时被El成功的解旋。 可以利用这种技术来评估在候选化合物的存在和缺席的时候El解旋酶体外的功能变化。 这种方法对筛选El的解旋酶分子抑制剂非常有用。其他合适的检测衡量候选化合物结合的蛋白质的能力的方法，和/或衡量这 些化合物能够影响蛋白质结合其它蛋白或配体的方法包括，免疫印迹，酶联免疫吸附法 (ELISA)，放射免疫法(RIA)，免疫沉淀，表面等离子体共振，化学发光，荧光偏振，磷光，免疫 组织化学分析，基质辅助激光解吸/电离时间飞行(WMALDI-TOF)质谱，microcytometry， 基因芯片，显微镜，荧光激活细胞分选(流式细胞仪)和流式细胞仪。本发明的一个组成部分，是由上述方法鉴定出的化合物，通过对El解旋酶的抑制作用，可用来预防或治疗HPV感染和子宫颈癌。这些化合物既可以通过本行业所知的传统 的固相合成与制备。这项发明的范围不仅包括各种异构体可能存在，但也可能形成的各种异构体的混 合物。本发明中的化合物在有碱性氨基时与酸形成盐，或在有酸性基团(如羧酸膦酸) 时与碱形成盐。所有这些新产品的盐有利于分离和/或纯化。这类酸和碱的盐如是药学上 可接受的话具有特别价值。医药上可以接受的酸类盐包括盐酸，草酸，硫酸，硝酸，苯磺酸， 对甲苯磺酸，醋酸，马来酸，酒石酸等。药物使用基本盐类包括钠，钾，钙，镁的盐。除了用理性的基于结构的药物设计，其与El结合的抑制剂可以通过上述的解旋 酶功能检测来发现，也就是以测定某种化合物对解旋酶的抑制能力。用这种方式，我们已确 定了一些能结合El六聚体的化合物，并对El六聚体解旋酶功能有抑制作用的化合物，包括 曲伐沙星(trovafloxacin)与加替沙星(gatifloxacin)。因此，本发明的一个方面是一种 通过在为需要接受这种治疗哺乳动物上使用travafloxacin或gatifloxacin及其衍生物 来预防或治疗HPV感染和宫颈癌的方法。本发明的化合物可以用来为病人直接使用。较好的病人是一种动物，更好是哺乳 动物，最好为人类。这种化合物可以通过各种形式和路线进行使用，例如，口头或肠外。肠 外使用包括但不限于由下列使用路线静脉注射，肌肉注射，皮下注射，眼科，口腔和舌下； 局部包括眼科，皮肤，眼，鼻和直肠通过充气和气溶胶吸入；腹腔和直肠系统性，生殖系统。医生将决定本治疗药物最合适的剂量用于预防或治疗目的，它会随特定的病人而 定。医生通常会先从小剂量开始递增，直到达到最佳治疗效果的剂量。治疗剂量一般都可 以从约0. 1至约1000毫克/天，最好是从大约10到100毫克/天，或约0. 1到50毫克/ 公斤体重量，最好每天约0. 1至约20毫克/公斤体重的身体，可以在几个不同的剂量单位 的使用。高剂量，在约2倍到4倍左右的剂量可用于口服使用。目前国内外还没有任何有效的预防和治疗人乳头瘤病毒的化合物。本发明的技术 和成果可以用来找到和开发针对该病毒的具有特异性高的抑制剂化合物作为预防和治疗 人乳头瘤的感染和其引起的疾病。与现有技术相比(如普遍撒网的高劳力强度的大通量筛 选)，本发明具采用了现代蛋白分子结晶学，计算机对分子结构的模拟和分析和基于结构的 分子对接，以及有效的试验测试系统的建立，从而能从几十万到上百万的分子库中很快的 选出能结合目标蛋白的少数的化合物，并通过试验筛选很快验证和确定对目标蛋白有高特 异性的抑制功能的化合物作为抗人乳头瘤的有效药物。
图1为HPV 35E1蛋白Superdex-200的洗脱峰不同部分的凝胶电泳图；图2为HPV35 El蛋白的Superdex-200柱层析图；图3为El解旋酶的解旋双链DNA活性测试结果图；图4为El解旋酶对ATP水解活性的检测结果图；图5为El的分子结构图其中A为El六聚体的侧视结构示意图；B为El六聚体 的俯视结构示意图；C为El单体的N-端结构域；D为El单体的C-端结构域；图6为根据结构进行计算机分子对接所得到的结果图其中A为曲伐沙星(trovafloxacin)对接在El六聚体结构的结合部位图，B为加替沙星(gatifloxacin)对接 在El六聚体结构的结合部位图；图7为候选化合物曲伐沙星的结构图；图8为候选化合物加替沙星的结构图；图9为候选化合物曲伐沙星和加替沙星对El解旋酶的抑制剂作用图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。所有百分比是按重量和所有溶剂混 合比例是按体积，除非另有说明。实施例1 人乳头瘤病毒(HPV)El蛋白的制备和酶活性的测定(一 )人乳头瘤病毒(HPV)El蛋白的制备人乳头瘤病毒(HPV)El蛋白的制备将以HPV35型的El解旋酶为例。HPV35 El解 旋酶的的表示和提纯是用大肠杆菌表达系统。用的质粒是PGEX-2T为载体。诱导El蛋白 表达的条件是0. 4mM的IPTG，16度，16小时。细胞破碎是在50mM Tris-HCl, pH 8. 0 度 下)，0.25M NaCl, 5mM EDTA, 5mM DTT，5%甘油，0. 2% NP-40的溶液中，用法式破碎机或超 声波机。细胞破碎物离心40000xG，上清液里的GST-El用谷胱甘肽(glutathione)以亲和 层析的方法提出。GST-El融合蛋白使用凝血酶切开，洗脱的El蛋白用Superdex-200柱层 析来提纯。如图1所示，经Superdex-200提纯后的El蛋白有很高的纯度。纯化的El蛋白 在IOOmM HEPES，pH7. 5，250mM NaCl,5mM DTT，和5%的甘油的溶液里浓缩后，在-80度下保 存。( 二)六聚体聚合能力的检测六聚体的聚合是El体现解旋酶功能的必备条件。El单体分子形成六聚是用 Superdex-200凝胶过滤色谱法。蛋白质O毫克/毫升，Img总蛋白)和ImMATP注入 Superdex-200柱子上。如图2所示，HPV35 El蛋白在Superdex-200柱层析分析法中，形成 六聚体和小部分单体，以六聚体和少量单体流出柱子。而化合物对六聚体形成的抑制作用 可用此法检测。(三)解旋酶活性检测解旋酶活性的检测使用的底物是从两个互补链退火而成的。两条互补链的序列 是(dT) 44GCTCGTGCAGACGTCGAGGTGAGGACGAGCTCCTCGTGACCACGand CGTGGTCACGAGGAGCTCGTC CTCACCTCGACGTCTGCACGAGC (dT) 44。((dT) 44是指44个dT)。此底物包括44核甘酸的两个单 链DNA分叉尾巴和44个核苷酸的双链DNA，5 ‘末端有32P的放射标记。El解旋酶活性检 测是在65°C，60分钟，20微升含0. 5nM双链DNA底物，75nM El蛋白单体，30nM Tris (pH8), 75mM NaCl，50nM 醋酸钾，IOmM MgAcetate, 5mM ATP，ImMDTT 和 0. 1 毫克 / 毫升牛血清白蛋 白。反应终止是用5ul含有IOOmM EDTA，0. 5% SDS，0. 1 %二甲苯蓝，0. 1 %溴酚蓝和50% 甘油。反应物经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用放射自显影法来检测和量化底物DNA的解 旋程度，从而的出解旋酶的活性程度。如图3所示为El解旋酶的解旋双链DNA活性测试结 果，双链DNA(dsDNA)底物被El解旋酶解开成单链DNA (ssDNA)产物，第1_5道El蛋白浓度 递减，第6道只有dsDAN底物，第7道dsDNA底物加热到100度。
(四)ATP酶活性测定El解旋酶对ATP的水解用两种方法进行。第一中方法是(参见Greenleaf et al.，2008)，没有同位素标记的 ATP 10_500uM 和 IOuM 的 γ -32Ρ 标记的 ATP (3000Ci/mmol) 以及IuM的El六聚体蛋白混合后在25度下反应30分钟，然后用薄版层析法检测ATP水 解程度(如图4所示)。第二种方法是，使用Enzchek的检测试剂盒Gnvitrogen公司)， 检测El解旋酶对ATP的水解和磷释放。所有的反应进行解旋酶在65度进行，使用InM的 El单体蛋白，50-2500μΜ的ATP。所用的溶液是解旋酶活性测定的溶液相同。数据米氏 (Michaelis-Menten)方程式来分析数据。如图4所示为El解旋酶对ATP水解活性的检测， 随着El解旋酶浓度的增加，ATP被水解成ADP的量也越大。实施例2 乳头瘤病毒El解旋酶蛋白的结晶，分子结构模型和药物筛选(一)乳头瘤病毒El解旋酶蛋白的结晶以牛乳头瘤病毒El为例。此El蛋白表达 和分离提纯可用实例1所描述的进行。乳头瘤病毒El蛋白结晶是用20mg/ml的蛋白浓度， 在含有 IOOmM MES (pH 7. 5), 300mM KP04 (pH 7. 5)，190mM NaCl, 8% PEG6K 的溶液里，用悬 滴气相扩散法，在18度的条件下进行。结晶的晶包常数为P2(1)2(1)2(1)，a = 133.211， b = 179. 192，和 c = 185. 350, α = β = g = 90。晶体衍射分辩率为 3. 1 挨。( 二 )晶体结构分子模型El的六聚体的总体结构如图5 (A、B)所示，El亚基组装成有一中央通道的同源六聚结构。从侧面看，六聚 体环显示为两个不同直径的环，在顶部小环和底部大环。这两个层次的环六聚体的厚度大 约是80埃。从顶部看，在六聚体环从六个点从较大的底部环中心辐射出去。六聚体的总体构象具有不对称的外观，不同亚基之间有不同空间距离。这些每个 亚基之间存在着较大的底部是ATP的结合部位，亚基间ATP结合和水解驱动El六聚体构象 变化用来打开DNA双链或解旋。ATP具体的结合位点位于在较大底部的AAA+的Walker-A 域处。一个亚基贡献 Walker-A(GPPNTGKS)和 Walker-B (AALVDD)和传感器 1 (VTSNI)用来 结合ATP的磷酸部分，而邻近的亚单位提供了一个精氨酸“手指”(Arg538)对ATP水解至关 重要，传感器2(Lys425)和其他一些周边的氨基酸也参与结合和水解ATP。El的单体结构在El的单体结构中包含两个单独的结构域，较小的N-端结构域和大C端的AAA+ 域。N-端的结构域全是α-螺旋，但C-端的结构域有5个结构形成的对版，如图 5(C、D)所示。整体结构非常象SV40大T抗原的结构(Li el al. ,Nature, 2003 ；Gai et al.， Cell，2004)，有一个长的α -螺旋连接的N-端域到C-端域。在C-端域，它包含了 β-发 夹结构，是位于六聚体中央通道里，对DNA结合和解旋起很重要的作用。(三)计算机模型药物筛选根据牛乳头瘤病毒El的晶体结构，通过计算机模拟建立了人乳头瘤病毒16和18 型El解旋酶的结构模型，并以此结构模型，对小分子化学数据库进行计算机对接，以筛选 出能结合El的化合物。用这种方法，我们筛选出一些能结合在人乳头瘤16型El上的化合 物，其中两种候选化合物曲伐沙星和加替沙星(trovafIoxacin和gatifloxacin)的结构如 图7、8，所示它们结合在El蛋白上的位点分别如图6A、B所示，两个分子对接的自由能分别 是-7. 69kcal/mol 禾口 -6. 95kcal/mol。
(四)对El活性抑制剂的检测基于结构和计算模拟筛选出的候选化合物曲伐沙星与加替沙星(trovafloxacin 和gatifloxacin)对El解旋酶抑制剂作用用实样来检测，以测验这些化合物是否能抑制 El解开双链DNA底物的活性。如图9所示，曲伐沙星加在HPV16E1解旋酶反应混合物中， 让反应进行60分钟，然后用凝胶电泳分析反应结果。曲伐沙星(trovafloxacin)浓度使用 为20uM,40uM,80uM, 160uM。由图9可以看出，曲伐沙星(trovafloxacin)浓度以线性方式 抑制El双链DNA解旋成单链的功能。同样，加替沙星(gatifloxacin)浓度的增加(40uM， 80uM, 120uM，和MOuM)也对El的解旋酶呈现出类似的线性抑制活性，不过其抑制作用没有 曲伐沙星强烈。4-7道显示出trovaf loxacin浓度增加对El解旋酶功能抑制的增强。8_11 道显示出gatifloxacin浓度增加对El解旋酶功能抑制的增强。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
权利要求
1.一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，其特征在于，采用 结构计算机辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒El解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑 制El的候选化合物。
2.根据权利要求1所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法， 其特征在于，所述的以人乳头瘤病毒El解旋酶结构为基础包括(a)一个由原子坐标确定下来的El蛋白分子结构和由El形成的六聚体的结构；(b)一个由原子坐标确定下来的El蛋白分子与ATP或ADP相结合的复合体结构；(c)一个El蛋白单独的结构或与一个化合物或多肽结合的复合体结构。
3.根据权利要求2所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病化合物的筛选方法，其 特征在于，还包括进一步的El解旋酶功能检测，所述El解旋酶功能检测方法采用电泳迁移 率试验。
4.一种利用权利要求3的筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化 合物，其特征在于，所述化合物为曲伐沙星及其衍生物。
5.一种利用权利要求3的筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化 合物，其特征在于，所述化合物为加替沙星及其衍生物。
6.根据权利要求4或5所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，其特征 在于，所述人乳头瘤病毒感染类疾病包括子宫颈癌或尖锐湿疣。
全文摘要
本发明公开了一种预防和治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染类疾病的化合物的筛选方法，该方法采用结构计算机辅助药物设计，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物；上述筛选方法具有方便、省时、高效的特点；本发明还公开了利用上述筛选方法得到的化合物，如曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物，这些人乳头瘤病毒E1解旋酶的抑制剂具有特异性高、针对性强的特点，有助于预防和治疗人乳头状瘤病毒感染，以及和HPV感染有关的疾病，如子宫颈癌和生殖器疣等疾病。
文档编号C07D401/04GK102086468SQ201010175420
公开日2011年6月8日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者李大伟, 楼慧强, 陈小江, 陈林 申请人:小江生物技术有限公司