专利名称：脱水辅助蛋白复性的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，主要涉及变性蛋白的复性技术，包括氧化复性技术。
背景技术：
重组DNA技术使在细菌或其它宿主细胞中大量表达多肽和蛋白分子成为可能。重组表达的蛋白类产品已获得了许多成功。然而，异源宿主表达技术经常遇到蛋白产物在宿主细胞内沉淀的情况。沉淀的蛋白以包涵体形式存在，它们不具有天然的三维结构，处于变性状态，通常没有生物活性。变性蛋白需要在体外进行处理，使其获得具有生物活性的空间结构。该过程称为复性或蛋白折叠(重折叠)。体外复性常常是多肽和蛋白类产品生产过程成功的关键因素。Anfinsen理论认为，多肽分子的一级结构，即其序列是蛋白高级结构以及活性的决定因素[Anfinsen C B, Haber E, Sela M,et al. The kinetics of formation of native ribonuclease duringoxidation ofthe reduced polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA, 1961,47 :1309-1314]。该理论是现代蛋白质化学的重要理论基础。在蛋白复性和折叠过程中，会形成具有一定结构的部分折叠的分子形态，称为中间体。早期中间体可能与折叠过程中的蛋白聚集现象有关。部分折叠的中间体含有相邻的大片表面疏水区，使得这些中间体有很强的聚集倾向。中间体分子的特定疏水表面结构元素与相邻分子的配合疏水表面结构元素相互作用，导致其分子间聚集。最初的聚集物可能是二聚体或四聚体，为可溶性；当聚集体尺寸超过溶解性极限时，就形成沉淀[Anthony L Fink. Proteinaggregation :folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Folding&Design. 1998，3 :R9_R23]。一旦不溶性的聚集物形成，自然状态下，这一过程是不可逆的。如果折叠复性过程缓慢，中间体累积会促进聚集物形成，导致复性效率下降。多种蛋白分子，特别是由细胞分泌的具有重要功能活性的蛋白分子，内部通常含有天然二硫键；二硫键对于这些蛋白分子的结构稳定性和活性，有重要作用[Betz S F.Disulfide bondsand the stability of globular proteins.Protein Sci. 1993 ；2 1551-8]。在真核细胞中，蛋白分子合成后，借助二硫键氧化酶和二硫键异构酶的作用，数分钟甚至数秒内即可形成正确完整的二硫键连接。但在体外折叠复性时，二硫键的形成过程非常缓慢，并需要有合适的氧化性小分子和还原性小分子的适当配合，使错误配对的二硫键连接转换成正确二硫键，以促进复性。这些氧化性小分子和还原性小分子的配合，称为氧化还原对(redox)，如还原型/氧化型谷胱苷肽(GSH/GSSG)、还原型/氧化型二硫苏糖醇 (DTTred/DTTox)、半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/cysteamine)等。该复性过程称为氧化复性或氧化折叠。在蛋白变性、复性过程的折叠机制研究中，牛胰核糖核酸酶RNase A是最常使用的一个典型的模式蛋白，它全长1 个氨基酸残基中含有8个半胱氨酸，天然状态下形成4对二硫键(Cys^-Cys84，Cys58-Cysll0，Cys40-Cys95，Cys65-Cys72)。大量研究已经确定了其折叠中间体的存在禾口结构[Narayan M, Welker E, Wedemeyer WJ, Scheraga HA. OxidativeFolding ofProteins. Acc Chem Res. 2000 ;33 :805-12]。在经典的复性研究中，完全还原变性的RNase A在偏碱性溶液和适当氧化还原对存在下复性，形成含有不同二硫键数目的结构性或非结构性中间体(按二硫键数目分别称为13，25，35，4幻，35是主要的稳定中间体; 在1S，2S中间体甚至完全还原(R)的分子中，蛋白骨架的拓扑构象已趋近于天然蛋白，导致二硫键的形成更趋向于正确的连接，而错误连接的二硫键也通过改组(reshuffle)转换为正确类型。最终形成的3S中间体具有基本正确的二硫键连接和极近天然的高级结构，并具明 的 Blfi舌个生[ffedemeyer WJ, Welker E, Narayan M, Scheraga HA. Disulfide Bonds and Protein Folding. Biochemistry,2000 ;39，4207-4216]。不同的含二硫键的蛋白类型，其氧化折叠机制有很大差别，需要用不同的折叠模型描述[Arolas JLiAviles FX,Chang JY，Ventura S. Folding of small disulfide-rich proteins :clarifying thepuzzle. Trends Biochem Sci 2006,31 :292-301]。一些蛋白的氧化折叠，起始于随机配对的二硫键的形成，并由此导致蛋白分子的疏水塌缩，这种杂乱 (scrambled)种类分子随后形成二级结构，并在二硫键还原和改组(reshuffle)过程中，恢复正确的高级结构和正确二硫键连接。一些蛋白的氧化折叠，起始于近天然空间结构的出现，由此导致正确二硫键的形成，同时促进错配二硫键的改组、巯基序贯氧化，最终形成天然结构和天然二硫键连接。不同的复性条件如pH、离子强度、氧化还原对等，可能影响复性的效率和动力学。 对于许多天然状态下含有二硫键的蛋白，在偏碱性溶液和加入适当氧化还原对，是促进其氧化复性的必要条件。一些添加剂如精氨酸、去污剂、变性剂、伴侣分子、蛋白氧化还原酶以及蛋白异构酶等，可能辅助氧化折叠过程，并减少该过程中由于蛋白聚集引起的收率降低问题。体外复性时，即使加入二硫键异构酶，仍然需要有合适比例的氧化还原对，才能使其发挥催化的作用。[Lyles MM, Gilbert HF. Catalysis of the oxidative folding of ribonuclease A by proteindisulfide isomerase -dependence of the rate on the composition of the redox buffer. Biochemistry. 1991 ；30 :613-9.]体外复性时，通常采用的方法是通过稀释，透析或色谱层析等手段使变性蛋白处于适当的缓冲溶液中，使蛋白分子的结构逐渐恢复正常。这种复性方法，通常是在较稀的蛋白溶液中进行，以降低聚集物形成，为后续处理带来困难。一般复性时间要持续数小时甚至数天，降低了工业生产的效率。参与生命活动的生物分子，都是在水溶液中发挥作用的。蛋白质分子在体内和体外的折叠复性过程，也是在水溶液中完成的。水分子参与了蛋白折叠过程[Levy Y， Onuchic JN. Watermediation in protein folding and molecular recognition. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006 ;35 :389-415]。计算机模拟研究显示，在蛋白折叠的疏水塌缩期，疏水氨基酸残基周围的水分子被挤压排出疏水核心[Cheung MS, Garcia AE, Onuchic JN. Protein folding mediated bysolvation :Water expulsion and formation of the hydrophobic core occur after the structural collapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 ；99 (2) :685-90. Rhee YM，Sorin EJ，Jayachandran G，Lindahl E，Pande VS.Simulations of the role of water in the protein-folding mechanism. Proc Natl Acad Sci US A. 2004 ; 101 (17) :6456-61]，疏水核心脱水可能是蛋白折叠的驱动因素[Daidone I，Ulmschneider MB, Di Nola A，Amadei A，Smith JC. Dehydration-drivensolvent exposure ofhydrophobic surfaces as a driving force in peptide folding. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 ； 104 (39) :15230-5]。而且通过实验[Kimura T，Maeda Α，Nishiguchi S，Ishimori K，Morishima I，Konno Τ，Goto Y，Takahashi S.Dehydration of main-chain amides in the final folding step ofsingle-chain monellin revealed by time-resolved infrared spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 ； 105(36) :13391-6]也发现，疏水核心脱水可能是蛋白折叠的主要限速环节之一。对蛋白分子结构尺寸精细测量研究 Perncindez A, Scheraga HA. Insufficiently dehydrated hydrogenbonds as determinants of protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003；100(1) :113-8]显示，多肽链的水分子驱除也影响蛋白二级结构的形成，提示在蛋白折叠的疏水塌缩期后，脱水过程参与了二级结构的形成过程。这种脱水与高级结构形成过程的伴随现象，已在实验室蛋白折叠的实时研究中观察到[Kim SJ,Born B,Havenith M， Gruebele M. Real-time detection ofprotein—water dynamics upon protein folding by terahertz absorption spectroscopy. Angew Chem IntEd Engl. 2008 ；47 (34) :6486-9]。然而，目前还不清楚，脱水现象在体内和体外的蛋白质分子折叠复性过程中，是否具有明确的因果关系，还是仅仅只是一个伴随现象。本发明的目的，是提供实际可行的通过脱水，人为促进蛋白质分子折叠的策略和方案；提供使蛋白分子产生人为脱水的方法，有效地促进蛋白质分子折叠复性。
发明内容
本发明提供了一种将蛋白由变性状态迅速转化为活性状态，从而获得生物活性蛋白产品的方法。该方法中，含有变性蛋白、或/和其结构中间体的蛋白样品置于适合的溶液中，经过快速脱水处理，使变性蛋白、或/和其结构中间体迅速形成天然结构的蛋白分子。本发明中，“变性状态”或“变性蛋白”，是指目标蛋白处于无生物活性的状态，通常来源于重组表达的蛋白产物，经高浓度变性剂溶解包含体等步骤获得。如该蛋白是活性状态下含二硫键的蛋白，这种变性蛋白通常经过还原剂处理，以解除蛋白分子内或分子间的非正常二硫键连接；蛋白分子内正确的二硫键通常也被完全破坏；但这种还原处理并非必须。“中间体状态”或“中间体”，是指目标蛋白经由变性状态，达到具有完全生物活性的天然状态的过程中，形成的一些中间结构状态，它们可能没有生物活性或只具有部分生物活性， 容易聚集形成沉淀形式。从重组表达的蛋白产物或其它来源的目的蛋白，溶解制备成变性的蛋白样品，是一个本领域专业人员所公知的技术。尽管蛋白变性过程通常需要高浓度变性剂，其它可获得还原变性而能促进复性的温和变性方法[Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 2005 ；99(4) 303-10]也可以采用。高浓度变性剂溶解制备成变性的蛋白样品，需要进行溶液置换，以减低变性剂浓度或完全去除变性剂。公知的技术如稀释，透析，凝胶过滤等都可选择用于这一目的。残留的变性剂浓度以不明显影响蛋白折叠复性过程为度。在该溶液中加入的其它额外成分， 可以是阻止聚集的化学成分如精氨酸、低浓度变性剂、聚乙二醇等，或是促进折叠的伴侣分子、蛋白氧化还原酶以及一些蛋白异构酶等，或加入氧化还原剂，也是本发明的选项。通常，对这种溶液的条件，没有严格的限定，如温度，离子强度，PH等。本发明发现，将上述溶液中的变性蛋白、或/和其结构中间体蛋白样品，进行快速脱水处理，能够有效促进蛋白质分子折叠形成正确结构。特别对于活性状态下含二硫键的蛋白的还原变性制品，在开始氧化折叠反应后，无需添加氧化还原剂，经过快速脱水处理， 也能快速形成正确二硫键达到完全复性。本发明还发现，对于还原变性RNase A，脱水辅助复性的程度，依赖于RNase A的还原变性条件。还原变性程度很高时，复性的程度较低；还原变性程度较低时，既还原变性 RNaseA处于较好的复性起始状态时，脱水辅助复性的效果会更明显。脱水处理的方法，最简单地可以通过吸水性固态介质来有效介导。例如，将吸水性色谱基质预先进行脱水处理，然后将上述变性蛋白、或/和其结构中间体蛋白的适合溶液快速与该基质混合或接触，再按标准的色谱层析方法洗脱活性蛋白，进行后续处理。也可以将上述变性蛋白、或/和其结构中间体蛋白的适合溶液，先加入含有由溶液预先平衡的色谱基质，然后通过重力或压力变化，迅速排除基质中的水分，再按标准的色谱层析方法洗脱活性蛋白，进行后续处理。快速脱水处理也可通过其它可能的方式实现。蛋白质的喷雾干燥脱水技术，是活性蛋白质产品保存的常用技术。通过喷雾，温度或/和气压的快速变化， 使蛋白样品快速汽化，也可达到脱水的目的。但脱水处理应该是一个快速而短暂的过程，这种处理条件，应不影响复性后蛋白的稳定性为宜。如在吸水性固态介质介导的脱水处理时， 控制加入蛋白样品溶液的体积，以保证有充分的快速脱水，同时蛋白样品不至于干涸，以避免蛋白样品的损失。对于一些折叠难度较大的蛋白，也可以采用反复脱水的方法，促进活性蛋白的生成。总的来说，本发明提供的方法有以下一些优点能够使目的蛋白快速复性；获得高浓度复性产物；广泛的复性条件，通常不需要特别的添加物；简单易控的操作从而降低生产成本。本发明提供的方法，可以在实验室小规模操作，也可以在大规模工业生产上应用。 目的蛋白的处理能力可以从数毫克直到公斤级水平。
图1.还原变性RNase A经空气氧化㈧或氧化型谷胱甘肽(GSSG)⑶氧化时，不同时间取样经AEMTS烷化，质谱测定复性折叠过程中二硫键形成状况。谷胱甘肽明显促进 RNaseA的复性。图2.凝胶过滤脱水基质促进还原变性RNase A复性。在pH6. 5还原变性的RNase A(直接用IM AEMTS烷化，用离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱，质谱鉴定为a)，
SP基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱QOmM AEMTS烷化样品质谱鉴定为b) 获得的样品，取5ul用离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱，用20mM AEMTS烷化， 质谱鉴定。图3.基质脱水对AEMTS标记蛋白的影响。在pH6. 5还原变性的RNase A， 经kphadex SP基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱后20mMAEMTS烷化样品(a)，分别取 5yL(b)、20yL(c)、50yL(d)禾口 100 μ L(e)，用离心脱水的 kphadex G-IO 吸附后，离心洗脱，质谱鉴定。再次用5yL(f)、20yL(g)、50yL(h)和100 μ L⑴IM pH7. 0尿素清洗(b)、 (c)、(d)和(e)样品的基质，质谱检测。S印hadex G_10能够明显促进还原变性RNase A复性。图4.脱水基质对烷化样品残留的观察。在pH6. 5还原变性的RNase A(直接用 IM AEMTS烷化，用离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱除盐，质谱鉴定为a)，经 Sephadex SP基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱(20mM AEMTS烷化样品质谱鉴定为b)获得的样品，经离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱QOmM AEMTS烷化样品质谱鉴定为c)，或用20mM AEMTS烷化后，加NaCl至500mM (质谱鉴定为d)，用离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱(质谱鉴定为e)。高盐溶液的洗脱产物也为同样的复性产物。图5.脱水基质对烷化样品残留的观察。在pH6. 5还原变性的RNase A(直接用 IM AEMTS烷化，用离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱除盐，质谱鉴定为a)，经 Sephadex SP基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱后20mM AEMTS烷化样品，用离心脱水的 Sephadex G-IO吸附后，离心洗脱QOmMAEMTS烷化样品质谱鉴定为c)，或用20mMAEMTS烷化后，加NaCl至500mM(质谱鉴定为d)，再用400mMNaCl+lM尿素离心洗脱(质谱鉴定为d)。 尿素溶液的洗脱产物也为同样的复性产物。图6. RNase A变性状态对脱水复性的影响。在pH8. 0还原变性的RNase A，经 Sephadex SP基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱后，不经AEMTS (A)或经AEMTS (B)烷化的样品(烷化样品直接质谱鉴定，非烷化样品用20mM AEMTS烷化后质谱鉴定，为a)，分别经过离心脱水Wkphadex G-IO吸附后，离心洗脱(烷化样品直接质谱鉴定，非烷化样品用 20mMAEMTS烷化后质谱鉴定，为b)。此还原变性的RNase A，脱水后的复性效率明显较低。图7.脱水基质促进还原变性RNase A结构形成。在pH8. 0还原变性的RNase A， 经^^！^如“？基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱后，不经AEMTS (A)或经AEMTS (B)烷化的样品，分别经过离心脱水Wkphadex G-IO吸附后，离心洗脱。非烷化样品先经脉冲还原处理后，用20mM AEMTS烷化后质谱鉴定(a)，或不经经脉冲还原，加入IM (b)、2M(c)、4M(d)尿素后烷化；烷化样品不加或加入IM(b)、2M(c)、4M(d)尿素后再次烷化，质谱检测。Sephadex G-IO脱水辅助还原变性RNase A形成部分正确结构，该结构部分可被高浓度尿素破坏。图8.离子交换基质介导脱水辅助的蛋白复性。在pH8. 0还原变性的RNase A，经 Sephadex SP基质结合清洗，用IOOmM NaCl洗脱后(20mM AEMTS烷化样品质谱鉴定为a)，加入经离心脱水㈧或不脱水处理⑶的20mM pH7. OPB预先平衡的SP基质。用含有IOOmM NaCl的20mM ρΗ7. 0ΡΒ，连续洗脱三次(b、c、d)。洗脱样品用AEMTS烷化，质谱检测。离子交换基质也可通过脱水脱水作用，辅助蛋白的复性。图9.高浓度精氨酸对脱水复性的影响。在pH6. 5还原变性的RNase A(直接用 IM AEMTS烷化，用离心脱水的kphadex G-IO吸附后，离心洗脱除盐，质谱鉴定为a)，经 Sephadex SP基质结合清洗，用含IM精氨酸和IOOmM NaCl的PB洗脱后(20mM AEMTS烷化样品质谱鉴定为b)，经离心脱水的kphadex G-IO吸附，离心洗脱，20mM AEMTS烷化，质谱鉴定(c)。高浓度精氨酸对脱水复性的影响不大。
具体实施例方式下述实施例的陈述是为更好地理解本发明的原理和应用，而不限定本发明的使用范围。材料与方法1.蛋白样品牛胰RNase A购自北京沁源惠帜生物技术有限公司；电泳和质谱分析基本符合其理论分子量(13689. 33)。2.蛋白的还原变性RNaseA，在含有8M尿素和40mM DTT的磷酸缓冲液(20mM， pH6. 5或8. 0)中室温处理过夜。3.蛋白的烷化烷化剂甲基硫代磺酸-2-氨基乙酯氢溴酸盐(MethylAminoethan ethiolsulfonate Hydrobromide, AEMTS)按文献[Bruice Tff and Kenyon GL. Novelalkyl a lkanethiol sulfonate sulfhydryl reagents. Modification of derivatives of L-cysteine. J ProteinChem. 1982 ； 1,47-58]方法合成。蛋白处理完成后，AEMTS加入反应缓冲液，室温反应lOmin，加入醋酸，立即检测或-20保存。4.质谱分析取5uL蛋白样品与质谱基质CHCA 1 1混合点样。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F MS) (MALDI-T0F/T0F Analyzer 4800plus, AppliedBiosystem)对样品蛋白进行定性和定量分析。5.蛋白的脉冲还原含二硫键的蛋白待测样品中加入还原型DTT至终浓度5mM作用5min ；加入烷化剂烷化后质谱检测。低浓度还原剂的短时作用，只能还原不被稳定立体结构保护的二硫键，即含有错配二硫键的不稳定中间体，而不对天然或近天然结构的稳定中间体产生影响。[Narayan M, Welker E, Zhai H, Han X，Xu G, McLafferty Fff, Scheraga HA. Detectingnaive folds in mixtures of proteins that contain disulfide bonds. Nat Biotechnol. 2008 ；26 (4) :427-9.]结果1. AEMTS烷化是含游离巯基蛋白空间结构和复性状态测定的有效技术蛋白分子中游离巯基的烷化反应性，可反映游离巯基在蛋白分子空间结构的包埋状态，是蛋白空间结构及其变化的客观指标[Apuy几，Park ZY, Swartz PD, Dangott LJ, Russell DH, Baldwin TO.Pulsed-alkylation mass spectrometry for the study of protein folding and dynamics !development and application to the study of a folding/unfolding intermediate of bacterial luciferase. Biochemistry. 2001 ；40 15153-63.]。AEMTS是比常用的烷化剂活性更高的巯基特异性烷化剂，能够与蛋白分子中的游离巯基迅速反应。蛋白分子被AEMTS烷化后，其分子量会增加；每标记一个巯基，分子量增加76;因此，由蛋白分子量增加数目，可以准确计算出被标记的巯基数目。这是研究蛋白氧化折叠的最常用方法之一 [Iwaoka M, Juminaga D, Scheraga HA. Regeneration of three-disulfide mutantsof bovine pancreatic ribonuclease A missing the 65-72disulfide bond characterization of a minorfolding pathway of ribonuclease A and kinetic roles of Cys65and Cys72. Biochemistry. 1998 ；37 :4490-501]。RNase A用8M尿素和5mM DTT充分还原变性后，在尿素中直接用100倍(巯基) 过量的AEMTS烷化，质谱分析发现，烷化产物除有含8个巯基标记产物外，还存在含7个巯基标记和6个巯基标记的产物。说明，即使在还原变性的条件下，RNase A仍然存在一定的空间结构，使个别游离巯基在蛋白分子空间结构中处于包埋状态，不易被烷化标记，与文献[Wedemeyer WJ, Welker E，Narayan M，Scheraga HA. Disulfide Bonds and ProteinFolding. Biochemistry, 2000 ；39，4207-4216]结论一致。而 RNaseA 标记产物的差异应该不是由于变性还原不充分，或质谱检测中AEMTS从蛋白分子上脱落所致。该结果也提示， AEMTS烷化方法可能象其它常用的烷化剂一样，用于测定含游离巯基蛋白的空间结构。由图 1可以看出，还原变性RNase A的空气氧化折叠过程与氧化型谷胱甘肽GSSG促进的氧化折叠过程有明显的区别。随着时间延长，未被AEMTS充分标记的蛋白分子逐渐增多，最终形成的AEMTS标记的蛋白分子成为主要成分，说明二硫键形成逐渐增多，蛋白结构也逐渐稳定。 无空气氧化伴随的结构形成比较缓慢。2.脱水对RNaseA折叠的影响4mg/mLRNaseA经8M尿素和40mM DTT (20mM pH 6. 5磷酸缓冲液)中还原变性过夜，与经pH 6. 5的8M尿素平衡的S^hadex-SP离子交换色谱基质结合。20mM pH 6. 5磷酸缓冲液洗去尿素及未结合蛋白，用含NaCl IOOmM 20mM pH 7.0磷酸)洗脱蛋白。PB缓冲液平衡的kphadex G-IO基质0. 5ml加入离心柱内离心脱水。如在PB溶液中的还原变性 RNaseA加入脱水基质，瞬间离心收取样品，用AEMTS进行烷化lOmin，质谱分析发现，脱水处理的还原型RNase A完全不被AEMTS烷化(图2)。该结果说明，还原变性的RNase A经脱水基质的作用，形成了稳定的空间结构和/或二硫键，不易被烷化标记，证明脱水基质可以辅助还原变性的RNase A快速形成稳定的空间结构和/或二硫键。3.基质脱水对AEMTS标记蛋白的影响还原型RNase A用AEMTS烷化后，加入脱水基质，瞬间离心收取样品，质谱分析发现，烷化的RNase A所标记的AEMTS基团完全消失(图3)。不同体积的烷化样品均得到类似结果。进一步用额外的洗脱溶液清洗脱水基质，得到的样品同样为未标记分子(图3)。4.基质脱水操作影响因素的排除为排除脱水基质对差异标记产物的吸附力不同造成的选择性洗脱，使用了不同的溶液成分进行脱水处理。图4显示高盐条件下，还原型RNase A的AEMTS烷化产物，经脱水基质的作用，仍能完全去除已有的烷化标记，初步说明该作用与脱水基质对蛋白差异标记产物的残留无关。图5显示脱水基质处理RNase A烷化产物后，再次用400mMNaCl+lM尿素清洗洗脱，获得的成为仍为完全去除烷化标记的RNase A，进一步说明脱水基质的促进蛋白复性作用，不是蛋白选择性残留造成的假相。5. RNaseA变性状态对脱水复性的影响和尿素对复性结构的影响在pH8. 0还原变性的RNase A，既经8M尿素和40mM DTT (20mM pH 8. 0磷酸缓冲液)中还原变性过夜，经kphadex-SP离子交换色谱基质结合清洗，用含NaCl IOOmM的 20mMpH 7.0磷酸缓冲液洗脱蛋白，不经AEMTS (A)或经AEMTS(B)烷化的样品，经过脱水基质复性的程度明显降低(图6，7)。蛋白的变性状态是多种不同类型变性分子结构的组合 {φ [ffedemeyer WJ, Welker Ε, Narayan Μ, Scheraga HA. Disulfide Bonds and Protein Folding. Biochemistry, 2000 ；39，4207-4216]。由于碱性条件下 DTT 的还原能力更强， RNase A在pH8. 0还原变性的程度应比在pH6. 5时更为充分，可以把在pH8. 0还原变性的 RNase A视作更早期的复性起始物。该结果提示，对于RNase A，脱水辅助的复性作用对极早折叠起始结构的影响较小，可能主要影响分子折叠起始后的时期。图7中可以看出，不经 AEMTS烷化的脱水复性样品比烷化后的脱水复性样品含有较多的低标记数的质谱峰群(代表形成二硫键和保护结构的趋于复性的分子群体)，说明尽管烷化后的样品可以通过脱水
9去除标记达到复性，但复性效率下降；随着变性剂尿素浓度的提高，不经AEMTS烷化或经烷化的脱水复性样品，高标记数的质谱峰群含量逐渐提高，低标记数的质谱峰群逐渐降低和消失，提示复性早期趋于复性的分子群体，应含有尿素敏感的保护结构，导致部分游离巯基未被烷化。6.离子交换基质介导脱水辅助的蛋白复性经8M尿素和40mM DTT (20mM pH 8. 0磷酸缓冲液)中还原变性过夜的RNaseA，经 S印hadex-SP离子交换色谱基质结合清洗，用含NaCl IOOmM的20mM pH 7. 0磷酸缓冲液) 洗脱蛋白，加入20mM pH7. OPB预先平衡的离心脱水或不脱水S^hadex-SP基质，离心洗脱。 图8中(b)可以看出，经过脱水基质的RNase A有一定程度但不完全的复性，而经过未脱水基质的RNase A无明显的复性。用含有IOOmM NaCl的2OmM ρΗ7. 0ΡΒ，继续洗脱两次，脱水或不脱水Sephadex-SP基质的后续洗脱蛋白均无明显的复性。7.高浓度精氨酸对脱水复性的影响pH6. 5还原变性的RNase A经kphadex SP基质结合清洗，用含IM精氨酸和 IOOmMNaCl的PB洗脱，经离心脱水的kphadex G-IO吸附，瞬间离心收取样品，用AEMTS进行烷化，质谱分析发现，脱水处理的还原型RNase A也完全不被AEMTS烷化(图9)。证明高浓度精氨酸对脱水复性无明显影响。
权利要求
1.一个生产活性蛋白的方法，特征在于将溶液中的变性蛋白和/或其折叠中间体，通过快速和短暂的脱水过程，促进蛋白分子折叠和正确结构的形成，获得活性产物。
2.权利要求1所述的活性蛋白，是活性状态下，含有1个或以上的分子内二硫键。
3.权利要求1所述的脱水过程，是通过吸水性固态介质来介导的。
4.权利要求3所述的脱水过程，是将水化的吸水性固态介质预先进行脱水处理，然后将变性蛋白、或/和其结构中间体蛋白的溶液快速与该介质混合或接触，然后洗脱复性蛋
全文摘要
本发明涉及一种脱水辅助蛋白复性，公开了一种将蛋白由变性状态迅速转化为活性状态，从而获得生物活性蛋白产品的方法。既经过快速脱水处理，使变性蛋白、或/和其结构中间体迅速形成天然结构的蛋白分子。特别对于活性状态下含二硫键的蛋白的还原变性制品，在开始氧化折叠反应后，无需添加氧化还原剂，经过快速脱水处理，也能快速形成正确二硫键达到完全或部分复性。该方法复性快速，可获得高浓度复性产物，有广泛的复性条件，通常不需要特别的添加物，而且简单易控的操作能降低生产成本。
文档编号C07K1/00GK102250199SQ20101017432
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者吕春婉, 王楠, 芦娜 申请人:威志兰斯医学科技(北京)有限公司