专利名称：蛋白质氧化复性新方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及变性蛋白的复性技术，主要是氧化复性技术。
背景技术：
重组DNA技术使在细菌或其它宿主细胞中大量表达多肽和蛋白分子成为可能。重组表达的蛋白类产品已获得了许多成功。然而，异源宿主表达技术经常遇到蛋白产物在宿主细胞内沉淀的情况。沉淀的蛋白以包涵体形式存在，它们不具有天然的三维结构，处于变性状态，通常没有生物活性。变性蛋白需要在体外进行处理，使其获得具有生物活性的空间结构。该过程称为复性或蛋白折叠(重折叠)。体外复性常常是多肽和蛋白类产品生产过程成功的关键因素。Anfinsen理论认为，多肽分子的一级结构，即其序列是蛋白高级结构以及活性的决定因素[Anfinsen CB, Haber E, Sela M, et al. The kinetics of formation ofnative ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain. Proc NatlAcad Sci USA，1961,47 :1309-1314]。该理论是现代蛋白质化学的重要理论基础。然而，近来更多的实验证据表明，一级结构本身并不足以确定蛋白产物精确的三级结构。已经知道， 细胞合成蛋白分子的同时，有多种其他蛋白和酶参与和辅助了该蛋白分子的正确折叠，这些蛋白和酶包括伴侣分子、蛋白氧化还原酶以及一些蛋白异构酶等[Ruddon Rff, Bedows E.Assisted protein folding. J BiolChem. 1997；272 :3125-3128]。在蛋白复性和折叠过程中，会形成具有一定结构的部分折叠的分子形态，称为中间体。早期中间体可能与折叠过程中的蛋白聚集现象有关。部分折叠的中间体含有相邻的大片表面疏水区，使得这些中间体有很强的聚集倾向。中间体分子的特定疏水表面结构元素与相邻分子的配合疏水表面结构元素相互作用，导致其分子间聚集。最初的聚集物可能是二聚体或四聚体，为可溶性；当聚集体尺寸超过溶解性极限时，就形成沉淀[Fink AL. Protein aggregation :foldingaggregates，inclusion bodies and amyloid. Fold Design, 1998, 3 :R9-R23]0 一旦不溶性的聚集物形成，自然状态下，这一过程是不可逆的。多种蛋白分子，特别是由细胞分泌的具有重要功能活性的蛋白分子，内部通常含有天然二硫键；二硫键对于这些蛋白分子的结构稳定性和活性，有重要作用[Betz SF. Disulfide bonds and the stability of globular proteins.Protein Sci. 1993 ；2 1551-8]。在真核细胞中，蛋白分子合成后，借助二硫键氧化酶和二硫键异构酶的作用，数分钟甚至数秒内即可形成正确完整的二硫键连接。但在体外折叠复性时，二硫键的形成过程非常缓慢，并需要有合适的氧化性小分子和还原性小分子的适当配合，使错误配对的二硫键连接转换成正确二硫键，以促进复性。这些氧化性小分子和还原性小分子的配合，称为氧化还原对(redox)，如还原型/氧化型谷胱苷肽(GSH/GSSG)、还原型/氧化型二硫苏糖醇 (DlTed/DTT°x)、半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/cysteamine)等。该复性过程称为氧化复性或氧化折叠。在蛋白变性、复性过程的折叠机制研究中，牛胰核糖核酸酶RNase A是最常使用的一个典型的模式蛋白，它全长1 个氨基酸残基中含有8个半胱氨酸，天然状态下形成4对二硫键(Cys^-Cys84，Cys58-Cysll0，Cys40-Cys95，Cys65-Cys72)。大量研究已经确定了其折叠中间体的存在禾口结构[Narayan M, Welker E, Wedemeyer WJ, Scheraga HA. Oxidative Folding of Proteins. Acc ChemRes. 2000 ；33 :805-12]。在经典的复性研究中，完全还原变性的RNase A在偏碱性溶液和适当氧化还原对存在下复性，形成含有不同二硫键数目的结构性或非结构性中间体(按二硫键数目分别称为IS, 2S，3S，4S)，3S是主要的稳定中间体； 在1S，2S中间体甚至完全还原(R)的分子中，蛋白骨架的拓扑构象已趋近于天然蛋白，导致二硫键的形成更趋向于正确的连接，而错误连接的二硫键也通过改组(reshuffle)转换为正确类型。最终形成的3S中间体具有基本正确的二硫键连接和极近天然的高级结构，并具明 的 Blfi舌个生[ffedemeyer WJ, Welker E, Narayan Μ, Scheraga HA. Disulfide Bonds and Protein Folding. Biochemistry, 2000 ；39,4207-4216] 不同的含二硫键的蛋白类型，其氧化折叠机制有很大差别，需要用不同的折叠模型描述[Arolas JL，Aviles FX，Chang JY，Ventura S. Folding of smalldisulfide-rich proteins :clarifying the puzzle. Trends Biochem Sci 2006，31 :292-301]。一些蛋白的氧化折叠，起始于随机配对的二硫键的形成，并由此导致蛋白分子的疏水塌缩，这种杂乱 (scrambled)种类分子随后形成二级结构，并在二硫键还原和改组(reshuffle)过程中，恢复正确的高级结构和正确二硫键连接。一些蛋白的氧化折叠，起始于近天然空间结构的出现，由此导致正确二硫键的形成，同时促进错配二硫键的改组、巯基序贯氧化，最终形成天然结构和天然二硫键连接。无论在何种模型下，二硫键改组(reshuffle)都是折叠复性的必须环节。不同的复性条件如pH、离子强度、氧化还原对等，可能影响复性的效率和动力学。 对于许多天然状态下含有二硫键的蛋白，在偏碱性溶液和加入适当氧化还原对，是促进其氧化复性的必要条件。英特网“折叠数据库”(http://clims. med. monash. edu. au/) [Chow MK, Amin AA, Fulton KF, et al. TheREFOLD database :a tool for the optimization of protein expression and refolding. Nucleic Acids Res. 2006 ;34 :D207_12.]储存有数千种已知的蛋白复性条件和方法，其中包括一些氧化折叠的方法。一些添加剂如精氨酸、去污剂、变性剂、伴侣分子、蛋白氧化还原酶以及蛋白异构酶等，可能辅助氧化折叠过程，并减少该过程中由于蛋白聚集引起的收率降低问题。体外复性时，即使加入二硫键异构酶，仍然需要有合适比例的氧化还原对，才能使其发挥催化的作用。[LylesMM，Gilbert HF. Catalysis of the oxidative folding of ribonuclease A by proteindisulfide isomerase :dependence of the rate on the composition of the redox buffer. Biochemistry. 1991 ；30 :613-9.]Creighton早期曾在pH 8. 7溶液中单独用氧化型谷胱苷肽GSSG观察还原变性 Rnase A 的复性[Creighton TE. A three-disulphide intermediate in refolding ofreduced ribonuclease A with a folded conformation. FEBS Lett. 1980 ；118 283-8. ]ο Scheraga 等[Rothwarf DM，Scheraga HA. Regeneration and reduction of nativebovine pancreatic ribonuclease A with oxidized and reduced dithiothreitol. J AmChem Soc. 1991 ；113，6293-6294.]首次单独使用氧化型 DTT (DTT°X)， 证实用DTTed/DTT°x作为氧化还原对的可行性。尽管他们在pH 8. 0溶液中单独用DTT°X获得了还原变性Rnase A的复性，但作者在该文及其后的文献[Iwaoka M, Juminaga D5Scheraga HA. Regeneration of three-disulfide mutants of bovinepancreatic ribonuclease A missing the 65-72 disulfide bond characterization of aminor folding pathway of ribonuclease A and kinetic roles of Cys65 and Cys72Biochemistry. 1998 ；37 (13) 4490-501.]中强调，在该pH条件下，加入的高浓度氧化剂与其在复性反应中还原生成的还原型产物，形成了氧化还原对，因而促进了 toase A的复性。而该实验室的氧化复性研究工作主要都是以DTTraVDTT 二者共同加入复性溶液，观察复性过程[Rottwarf DM, Scheraga HA. Regenerationof bovine pancreatic ribonuclease Α. 2. Kinetics of regeneration. Biochemistry. 1993 ；32 :2680-9.Rothwarf DM, Li YJ, Scheraga HA.Regeneration of bovinepancreatic ribonuclease A :detailed kinetic analysis of two independent foldingpathways. Biochemistry. 1998 ；37 :3767-76.]。还原型小分子，被认为是消除错配二硫键，促进二硫键改组的关键因素。只有在偏碱性溶液中，氧化还原对才能促进氧化复性。研究者很早就观察到， 在PH低于7. 5时，即使含有合适比例的氧化还原对，还原变性foiase A的复性产物与在 PH 高于 8 时相比，仅有极低的活性[Ahmed AK, Schaffer Sff, Wetlaufer DB. Nonenzymic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonucleaseby air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers. J Biol Chem. 1975 ;250 :8477-82.]。只有在偏碱性溶液中，还原型小分子才具有充分的离子化形态和还原能力，从而促进错配二硫键的断裂和二硫键改组。除采用经典的稀释法和透析法对变性蛋白进行复性外，近年来色谱复性在实验研究和工业生产上的可行性也得到更多的重视[Li M，Su ZG, Janson JC. Invitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Expression andPurification 2004;33:1-10]。色谱复性，或称基质辅助复性，可以在多种色谱基质上实现。但各种色谱基质是否有直接的促进蛋白复性作用，还没有相关的直接证据[Jimgbauer A，Kaar W, Schlegl R. Folding and refolding of proteins inchromatographic beds. Curr Opin Biotechnol. 2004 ；15 :487-94.]。研究显示，在凝胶过滤色谱辅助的变性蛋白复性中，变性剂与蛋白的分离过程，以及加入的复性添加剂才是其复性的主要因素，而凝胶基质本身对 SS^^i/fftMft^Wfiniii] [Lanckriet H,Middelberg ΑΡ. Continuous chromatographic protein refolding. JChromatogr A. 2004 ；1022 :103-13.]。在模式蛋白 RNase A 复性研究 [黄亚渝，童卫，郭立安.RNase等10种标准蛋白质在高效疏水作用色谱上的复性.第四军医大学学报2005，26 :682-4 ；黄亚渝，童卫，郭立安，耿信笃.还原变性核糖核酸酶的高效液相色谱复性.第四军医大学学报2005，26 =1423-6]中，色谱复性对变性和还原变性的RNase A具有极高的复性效率，而复性前于变性液中加入氧化还原对的比例，对其色谱复性效率影响很大。
发明内容
本发明提供了将活性状态下含二硫键的蛋白，由变性状态转化为活性状态，从而获得生物活性蛋白产品的方法。该方法中，含有变性蛋白、或/和其结构中间体的蛋白样品溶液，在适当的条件下流经过或吸附于色谱基质上，使溶液中的变性剂和其它杂质与蛋白分子分离。在基质的辅助下，变性蛋白、或/和其结构中间体可以迅速形成近天然结构的稳定中间体形态。该稳定中间体只需要单独采用氧化剂处理，在广泛的反应条件下，促进蛋白分子内正确二硫键的形成。本发明中，“变性状态”或“变性蛋白”，是指目标蛋白处于无生物活性的状态，通常是来源于重组表达的蛋白产物，经溶解包涵体等步骤获得。该蛋白特指活性状态下含二硫键的蛋白，其二硫键数目为1个或以上。这种变性蛋白通常经过还原剂处理，以解除蛋白分子内或分子间的非正常二硫键连接；蛋白分子内正确的二硫键通常也被完全破坏。“中间体状态”或“中间体”，是指目标蛋白经由变性状态，达到具有完全生物活性的天然状态的过程中，形成的一些中间结构状态，它们可能没有生物活性或只具有部分生物活性，容易聚集形成沉淀形式。从重组表达的蛋白产物或其它来源的目的蛋白，溶解制备成还原变性的蛋白样品，是一个本领域专业人员所公知的技术。尽管蛋白还原变性过程通常需要高浓度变性剂和还原剂，其它可获得还原变性而能促进复性的温和变性方法[Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion bodyproteins. J Biosci Bioeng. 2005 ；99 :303-10]也可以采用。其它裂解二硫键的方法(如氧化裂解法)处理的样品，经过适当转化，也可以应用于本发明中。将变性蛋白、或/和其结构中间体蛋白样品，流经过或吸附于色谱基质的方法很多，并常规应用于蛋白色谱纯化中，也是本领域专业人员所公知的技术。本发明不限定所采用的基质类型，如凝胶过滤色谱基质，离子交换基质，其它吸附性色谱基质或亲和色谱基质等。该过程可以通过传统的色谱柱上样方式实现，也可以通过色谱基质的批次操作来实现， 或通过其它可能的方式实现。变性剂和其它杂质与目的蛋白分子分离的过程，依据采用的色谱基质类型不同， 可以经由普通缓冲液驱动的基质内自然分离实现，或缓冲液的反复清洗实现。该缓冲液的成分和条件没有具体限定，仅需不影响色谱基质对目的蛋白的吸附和分离为指标，这可根据蛋白本身的特征和基质所属类型的特征而定。流经过或吸附于色谱基质上的目的蛋白，在去除变性剂和其它杂质后，在普通缓冲液中迅速转化成具有接近天然结构的稳定中间体形态。通常可以在完全去除变性剂和其它杂质后进行氧化折叠反应；如果残留的部分变性剂和其它杂质对变性蛋白向稳定中间体的转化影响不大，也可在残留有部分变性剂和其它杂质的情况下进行氧化折叠反应。氧化折叠反应通常是在目的蛋白吸附于色谱基质上时，加入含有小分子氧化剂的折叠缓冲液来实现的。该缓冲液可以是前述的普通缓冲液，或是含有其它额外成分的普通缓冲液。 所述的小分子氧化剂，包括但不限于氧化型谷胱苷肽GSSG、氧化型DTT(DTTm)和胱氨酸 cysteamine.这些小分子氧化剂的浓度，主要依赖于氧化剂本身的特性而定，如对于氧化型谷胱苷肽，浓度可选为(不限于)0. 01 10mM，或优选为0. 1 3mM，或再优选为0. 5 ImM ；对于氧化型DTT，浓度可选为(不限于)1 200mM，或优选为10 IOOmM,或再优选为 20 50mM。这些小分子氧化剂的浓度，也与目的蛋白的浓度、所含游离巯基含量等有关，可进一步优化。在折叠缓冲液中加入的其它额外成分，可以是阻止聚集的化学成分如精氨酸、 低浓度变性剂、聚乙二醇等，或是促进折叠的伴侣分子、蛋白氧化还原酶以及一些蛋白异构酶等。折叠缓冲液中加入还原剂，如果不明显影响小分子氧化剂的氧化折叠效果，也涵盖在本发明所包含的范围内。折叠缓冲液的PH，可以是中性或偏酸性，而不仅是偏碱性。氧化折叠反应进行的时间，依赖于不同蛋白使用不同小分子氧化剂获得复性的程度，可以是数分钟、数小数甚至数天。氧化折叠反应结束后可按标准的色谱层析方法洗脱活性蛋白，进行后续处理。氧化折叠反应除可按上述色谱基质吸附状态进行外，也可在从基质上洗脱下来的溶液中进行。变性蛋白在基质辅助下形成的稳定中间体，经洗脱后，在溶液中更不稳定，但仍能维持近天然的空间结构，有时更易被小分子氧化剂氧化生成正确的分子内二硫键连接。溶液中进行氧化折叠反应的条件与上述色谱基质吸附状态进行反应相似，即仅需要小分子氧化剂，在折叠缓冲液的PH是中性或偏酸性，而不仅是偏碱性的条件下完成。对于一些氧化折叠难度较大的蛋白，也可以采用色谱基质吸附下氧化折叠，和洗脱后溶液中氧化折叠联合的方法，促进活性蛋白的生成。数轮的色谱基质吸附下氧化折叠和洗脱后溶液中氧化折叠过程，也是促进蛋白复性的一个选项。对一些氧化折叠后可能产生分子内二硫键错配的不稳定蛋白，可以在氧化剂处理后，继以低浓度还原剂短时还原的处理，选择性地断裂错配二硫键；再进入下一轮氧化折叠。总的来说，本发明提供的方法有以下一些优点能够使目的蛋白在高浓度状态下获得复性；获得目的蛋白复性的同时可能获得蛋白的纯化；在更广泛的复性条件如PH下复性，便于生产操作；复性添加物成分简单，仅需小分子氧化剂作用即可产生明显的复性效果，可显著降低生产成本。本发明提供的方法，可以在小规模实验室操作，也可以在大规模工业生产上应用。 目的蛋白的处理能力可以从数毫克直到公斤级水平。
图l.RNase A (a)与R3R5 (b)的质谱测定(1)及其与还原变性蛋白经AEMTS烷化后质谱测定O)的比较。还原变性RNase A烷化产物除有含8个巯基标记产物外，还存在含7个巯基标记和6个巯基标记的产物。还原变性R3R5烷化产物仅有含6个标记巯基的
唯一产物。图2.还原变性RNase A吸附于S^hadex-SP基质，去除变性还原剂，在基质上 (1)，及在洗脱液中(2)经AEMTS烷化，与天然RNase A质谱图(3)的比较。基质上RNase A的游离巯基不能烷化，而洗脱液中RNase A的游离巯基能充分烷化。图3.还原变性R3R5 吸附于S^hadex-SP基质，去除变性还原剂，在基质上(1)，及在洗脱液中(2)经AEMTS烷化，与未烷化R3R5质谱图C3)的比较。基质上和洗脱液中R3R5的游离巯基均能充分烷化。图4.还原变性RNase A吸附于kphadex-SP基质，去除变性还原剂，在基质上 (左)，及在洗脱液中(右)经空气氧化(a)、氧化型GSSG (b)或氧化型DTT(C)氧化，于不同时间(小时)洗脱后烷化，质谱测定分子内二硫键形成时程的变化。在PH 7.0时，ImM氧化型GSSG可使二硫键快速形成，洗脱溶液中RNase A的氧化速度快于基质吸附RNase A ；50mM 氧化型DTT可使二硫键快速形成，基质吸附RNase A的氧化速度快于洗脱溶液中RNase A。图5.还原变性RNase A经图4所示的氧化处理，复性样品在各时间点的活性测定。在pH 7.0情况下，50mM氧化型DTT可使基质吸附RNase A氧化产物的活性快速恢复， ImM氧化型GSSG也使基质吸附RNase A氧化产物的活性较快恢复。
图6.去除变性还原剂的还原变性RNase A在基质上(a，b)，及在洗脱液中(c， d)经氧化型DTT完全(a，c)或部分(b，d)氧化，蛋白在洗脱液中经5mM还原型DTT作用 5min(l)，或不经还原型DTT作用O)，再用AEMTS烷化。质谱测定二硫键的还原状态。基质上及在洗脱液中的氧化复性蛋白经脉冲还原未生成更多的还原产物。图7.去除变性还原剂的还原变性RNase A在基质上经氧化型DTT处理(a)或氧化型DTT合并AEMTS处理(b)，在不同时间将蛋白在洗脱液中用AEMTS烷化，质谱测定分子内二硫键形成时程的变化。在AEMTS并存时，氧化型DTT促进二硫键形成的作用进一步加强。图8.去除变性还原剂的还原变性RNase A在基质上经氧化型DTT合并AEMTS处理后，蛋白在洗脱液中经5mM还原型DTT作用5min(l)，或不经还原型DTT作用(2)，再用 AEMTS烷化。质谱测定二硫键的还原状态。基质上由氧化型DTT合并AEMTS处理的氧化复性蛋白经脉冲还原未生成更多的还原产物。
具体实施例方式下述实施例的陈述是为更好地理解本发明的原理和应用，而不限定本发明的使用范围。材料与方法1.蛋白样品牛胰RNase A购自北京沁源惠帜生物技术有限公司；电泳和质谱分析符合其理论分子量(13689. 33)。编码人胰RNase I的cDNA通过PCR反应，从人胰腺癌细胞PANC-I的总RNA反转录产物中扩增获得。该基因编码1 个氨基酸残基的成熟人胰 RNase I蛋白。以该基因为模板，设计引物分别扩增编码S肽(1_15氨基酸序列)和S蛋白 (21-1 氨基酸序列)的基因片断。通过酶切连接生成编码S蛋白C-末端融合S肽的变异基因。将该基因克隆入原核表达载体pQE80L(Qiagen公司产品)中，经化学诱导表达，可生成带有组氨酸标签的S蛋白C-末端融合S肽、具有重排结构(circular permutation)的人RNase I。该重组蛋白，命名为R3R5，以包涵体形式存在，电泳和质谱分析符合其理论分子量(172 . 3 。重排结构的核糖核酸酶的活性极低[Plainkum P, FuchsSM, Wiyakrutta S, Raines RT. Creation of a zymogen. Nat Struct Biol. 2003 ；10 (2) :115-9.];结构重排也常常导致蛋白的稳定性下降甚至高级结构的破坏[Beernink PT, Yang YR, Graf R, King DS, Shah SS, Schachman HK. Randomcircular permutation leading to chain disruption within and near alpha helices in thecatalytic chains of aspartate transcarbamoylase :effects on assembly,stability,andfunction. Protein Sci.2001 ； 10(3) :528-37.]2.蛋白的还原变性RNase A或R3R5，在含有8M尿素和40mM DTT的磷酸缓冲液 (20mM, pH 6. 5)中室温处理过夜。3.蛋白的烷化烷化剂甲基硫代磺酸-2-氨基乙酯氢溴酸盐(MethylAminoet hanethiolsulfonate Hydrobromide, AEMTS)按文献[Bruice Tff and KenyonGL. Novel alkyl alkanethiolsulfonate sulfhydryl reagents. Modification of derivativesof L-cysteine. J Protein Chem. 1982 ； 1,47-58]方法合成。蛋白处理完成后，AEMTS加入反应缓冲液，室温反应lOmin，加入醋酸使反应液pH小于5以终止反应。
4.质谱分析取5uL蛋白样品经过kphadex G_10离心柱脱盐，得到的样品与质谱基质CHCA 1 1混合点样。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) (MALDI-T0F/T0F Analyzer 4800 plus, Applied Biosystem)对样品蛋白进行定性和定量分析。5.蛋白的脉冲还原含二硫键的蛋白待测样品中加入还原型DTT至终浓度5mM作用5min ；加入烷化剂烷化后质谱检测。低浓度还原剂的短时作用，只能还原不被稳定立体结构保护的二硫键，即含有错配二硫键的不稳定中间体，而不对天然或近天然结构的稳定中间体产生影响。[Narayan M, Welker E, Zhai H, Han X，Xu G, McLafferty Fff, Scheraga HA. Detecting native folds in mixtures ofproteins that contain disulfide bonds. Nat Biotechnol. 2008 ；26 (4) :427-9.]6.核糖核酸酶活性测定核糖核酸酶的活性测定参考文献[Umansky SR, Piker EG, Adler W. Ribonuclease activity of rat thymus chromatin proteins. Experientia. 1974 Jul 15 ；30 (7) :734-6.]的 TCA沉淀法，以 25mM Tris-HCl (pH 8. 0), ImM EDTA，0. 01% BSA为缓冲液，适量的核糖核酸酶以及8 μ g酵母rRNA，37°C室温反应15min， 放置冰上，加入等体积预冷的10% TCA，冰上放置15min。4°C 12000rpm离心lOmin，取上清，0D280检测光密度值。结果1. AEMTS烷化是含游离巯基蛋白空间结构测定的有效技术蛋白分子中游离巯基的烷化反应性，可反映游离巯基在蛋白分子空间结构的包埋状态，是蛋白空间结构及其变化的客观指标[Apuy几，Park ZY, Swartz PD, Dangott LJ, Russell DH, Baldwin TO. Pulsed-alkylation mass spectrometry for thestudy of protein folding and dynamics !development and application to the study of afolding/unfolding intermediate of bacterial luciferase. Biochemistry. 2001 ；40 15153-63.]。AEMTS是比常用的烷化剂活性更高的巯基特异性烷化剂，能够与蛋白分子中的游离巯基迅速反应。蛋白分子被AEMTS烷化后，其分子量会增加；每标记一个巯基，分子量增加76;因此，由蛋白分子量增加数目，可以准确计算出被标记的巯基数目。这是研究蛋白氧化折叠的最常用方法之一 [Iwaoka M, JuminagaD, Scheraga HA. Regeneration of three-disulfide mutants of bovine pancreaticribonuclease A missing the 65-72 disulfide bondcharacterization of a minor foldingpathway of ribonuclease A and kinetic roles of Cys65 and Cys72. Biochemistry. 1998 ；37 :4490-501.]。RNase A用8M尿素和5mM DTT充分还原变性后，在尿素中直接用100倍(巯基)过量的AEMTS烷化，质谱分析发现，烷化产物除有含8个巯基标记产物外，还存在含 7个巯基标记和6个巯基标记的产物。而R3R5还原变性后，在尿素中用过量的AEMTS烷化，仅有含6个标记巯基的唯一产物(图1)。改变还原变性条件和烷化条件，产物的质谱分析结果没有改变。该结果说明，即使在还原变性的条件下，RNase A和R3R5仍然存在一定的空间结构，使个别游离巯基在蛋白分子空间结构中处于包埋状态，不易被烷化标记，与文献[ffedemeyer WJ, Welker E, Narayan Μ, Scheraga HA. Disulfide Bonds and ProteinFolding. Biochemistry, 2000 ；39,4207-4216]结论一致。而 RNase A 标记产物的差异应该不是由于变性还原不充分，或质谱检测中AEMTS从蛋白分子上脱落所致。该结果也提示，AEMTS烷化方法可能象其它常用的烷化剂一样，用于测定含游离巯基蛋白的空间结构。结果也说明，具有重排结构的R3R5，尽管其含有二硫键连接结构的S蛋白序列与RNaseA 高度一致，但还原变性后的空间结构有巨大差异。2.基质吸附促进蛋白中间体的稳定性4mg/mL RNase A经8M尿素和40mM DTT (20mM pH 6.5磷酸缓冲液)中还原变性过夜，与经pH 6. 5的8M尿素平衡的S^hadex-SP离子交换色谱基质结合。20mM pH 6. 5磷酸缓冲液洗去尿素及未结合蛋白，重悬基质于20mMpH 7.0磷酸缓冲液中或用加入NaCl至 IOOmM洗脱蛋白。基质溶液或洗脱溶液中加入AEMTS至终浓度40mM进行烷化lOmin。终止反应后，质谱分析发现，吸附于基质的还原型RNase A完全不被AEMTS烷化，而洗脱溶液中的RNase A可被AEMTS烷化(图2)。R3R5按相同方法处理和烷化，质谱分析显示，吸附于基质的还原型R3R5与洗脱溶液中的R3R5均可被AEMTS同等烷化(图幻。该结果说明，还原变性的RNase A吸附于色谱基质上，在普通缓冲液中形成的空间结构，使全部游离巯基在蛋白分子空间结构中处于包埋状态，不易被烷化标记；而具有该结构的蛋白分子脱离色谱基质后，其空间结构稳定性明显下降，游离巯基易于暴露而被烷化标记；实验结果也表明， 这种基质辅助的蛋白结构稳定性是由蛋白分子自身的特性决定的。3.蛋白中间体直接氧化生成正确二硫键和蛋白复性吸附于基质的还原型RNase A和洗脱溶液中的RNase A，可经空气自然氧化，随时间延长逐渐形成二硫键。通常吸附于基质的还原型RNase A在空气中的氧化速度较洗脱溶液中的RNase A快(图4)。基质吸附RNase A在空气中的氧化产物的活性恢复也稍快(图 5)，但活性的恢复速度低于完全二硫键形成的速度。基质溶液或洗脱溶液中单纯加入氧化型DTT，在pH 7. O情况下，50mM氧化型DTT可使二硫键快速形成(图4)，氧化产物的活性也较快恢复，而基质吸附RNase A的活性恢复明显快于洗脱溶液中RNase A (图5)。如单纯加入氧化型GSSG，在pH 7. O情况下，ImM氧化型GSSG可使二硫键快速形成，洗脱溶液中RNase A的完全氧化速度快于基质吸附RNase A (图4)；但基质吸附RNase A的活性恢复明显快于洗脱溶液中RNase A(图幻。形成完全二硫键的复性产物经DTT脉冲还原，无明显还原产物的增加(图6)，说明该产物是含有正确二硫键连接的天然或近天然结构的蛋白分子。4.基质吸附蛋白中间体的氧化复性不依赖于还原剂的存在还原型RNase A吸附于基质的溶液中，同时加入氧化型DTT和烷化剂AEMTS。AEMTS 可迅速与蛋白氧化时生成的还原型DTT反应，从而抑制所生成的还原型DTT对蛋白氧化复性过程的影响。在PH 7.0和50mM氧化型DTT的作用下，二硫键形成速度比只加入氧化型 DTT而不加入烷化剂AEMTS的复性蛋白更快(图7)。该复性产物经DTT脉冲还原，无明显还原产物的增加(图8)。说明该产物是含有正确二硫键连接的天然结构或近天然结构的蛋白分子；而基质辅助氧化复性时，由氧化型小分子生成的还原型小分子，对分子内二硫键的正确形成至少没有促进作用。
权利要求
1.一个生产活性蛋白的工艺流程，包括将变性蛋白与色谱基质接触和/或吸附，完全或部分去除变性剂和/或其它杂质，使变性蛋白迅速形成近天然结构的稳定中间体形态， 采用氧化剂处理，促进蛋白分子内正确二硫键的形成，获得活性产物。
2.权利要求1所述的活性蛋白，特征在于该蛋白在活性状态下，含有1个或以上的分子内二硫键。
3.权利要求1所述的变性蛋白，特征在于该蛋白可先经还原处理，基本去除了分子内二硫键的错误连接。
4.权利要求1所述的色谱基质，特征在于在合适的条件下，该基质能够与变性蛋白接触和/或吸附；并在合适的条件下，能够使目的蛋白与变性溶液中的变性剂和/或其它杂质分离或部分分离；且在合适的条件下，能够使复性的目的蛋白脱离该基质。
5.权利要求1所述的氧化剂，特征在于能够氧化蛋白分子的游离巯基，并促进二硫键的形成。
6.权利要求5所述的氧化剂，是氧化型DTT(DTTox)。
7.权利要求5所述的氧化剂，是氧化型谷胱苷肽GSSG。
8.权利要求5所述的氧化剂，是胱氨酸cysteamine。
9.权利要求1所述的氧化剂处理，是在形成的稳定中间体与基质接触和/或吸附状态下进行。
10.权利要求1所述的氧化剂处理，是在形成的稳定中间体脱离基质后的溶液内进行。
11.权利要求1所述的氧化剂处理，是在偏酸性、中性或偏碱性环境中进行。
全文摘要
本发明公开了将活性状态下含二硫键的蛋白，由还原变性状态转化为活性状态，从而获得生物活性蛋白产品的方法。该方法通过色谱基质与变性蛋白的接触和/或吸附，在变性剂和其它杂质与蛋白分子分离后，使变性蛋白、或/和其结构中间体迅速形成近天然结构的稳定中间体形态；该稳定中间体只需要单独采用氧化剂处理，在广泛的反应条件下，促进蛋白分子内正确二硫键的形成，获得活性产物。
文档编号C07K1/00GK102199187SQ20101013207
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者吕春婉, 王楠, 芦娜 申请人:威志兰斯医学科技(北京)有限公司