专利名称：一种生产高纯度低聚半乳糖的方法
技术领域：
本发明涉及高纯度低聚半乳糖的制备方法，具体而言，它涉及巧妙的利用专用树 脂和模拟移动床技术从低纯度低聚半乳糖的酶转化液中分离制备高纯度低聚半乳糖。
背景技术：
低聚半乳糖(Galacto-Oligosaccharides，G0S)是是一种具有天然属性的功能性 低聚糖，其分子结构一般是在葡萄糖或乳糖分子上连接2飞个半乳糖基，即Glu-(Gal)n, (η = 2 5)。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的G0S，而人母乳中含量较多，婴儿体内的 双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS成分。正因为如此，低聚半乳糖是在众 多功能性低聚糖中令人瞩目的一种。低聚半乳糖具有很多益生功能，如促进机体肠道内双 歧杆菌的增殖、结合吸收外源性病原菌、抑制病原菌和腹泻、防止便秘、保护肝脏、降低血清 胆固醇和降低血压等。商品化的GOS是利用乳糖为原料在生物酶的作用下反应生成，所得 的产品为含有GOS的混合物，一般还含有葡萄糖，半乳糖和乳糖，其中主产品低聚半乳糖的 含量都较低。例如Yakult Honsha公司的01igomate-55产品，FrieslandCampina公司的 VivinalGOS 产品，Nissin Sugar 公司的 Cup-Oligo 产品，Clasado 公司的 GOS BiMuno 产品 等，其产品的低聚半乳糖含量都在60 %以内。由于低纯度的GOS产品中还含有较多的乳糖 会引起部分人群的乳糖不耐症，另外其中含有的葡萄糖也影响了糖尿病人使用，这些都使 得其应用范围受到限制。因此，需要生成高纯度的GOS产品来扩大其使用范围。目前生产高纯度的GOS产品的技术有纳滤膜法，微生物发酵法，酶氧化法，和固定 床色谱分离法等。利用纳滤膜法提纯G0S，通过选择合适孔径的纳滤膜，可以部分的去除单 糖(葡萄糖、半乳糖)和二糖(乳糖)以提高GOS产品的纯度，但是该方法需要极大量的水 消耗造成了成本高，而且GOS纯度很难达到85 %以上，限制了工业化应用。利用微生物法工艺为利用酵母优先代谢葡萄糖的特性来消耗 去除葡萄糖，但是该方法难以去除乳糖成分，仍然无法实现工业化的高纯度GOS生产。利 用酶氧化法是通过葡萄糖氧化酶把葡萄糖氧化为葡萄糖酸再进一步通过离子交换来去除， 但它同样无法去除乳糖成分，而且葡萄糖氧化酶的昂贵价格也阻碍了其工业化应用。固定 色谱分离法是利用硅胶或有机聚合物树脂作为填料装填在一个色谱柱中，先在顶部注入进 料，然后再注入流动相，在流动相的推动下利用不同分子在填料上迁移速度的不同，实现了 低聚半乳糖和其他成分的分离，从色谱柱底部可以分段收集到各个组分。但是固定床色谱 分离法的分离效率低，产品纯度低，流动相消耗大，生产成本高的缺点限制了其工业化应 用。因而，需要寻找更有效更经济的方法来生产高纯度的GOS产品。
发明内容
本发明的目的在于寻求一种生产高纯度低聚半乳糖的方法，采用连续高效色谱分 离技术，得到高纯度的低聚半乳糖产品。本发明的主要技术方案包括了 1以乳糖作为原料，在β半乳糖苷酶的下生成含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的混合物；2合成适合分离低聚半乳糖与葡萄糖、半 乳糖、乳糖等杂糖的特种分离树脂；3将含低聚半乳糖和杂糖的混合液，在装有特种吸附分 离树脂的模拟移动床色谱分离系统中实现分离，制得高纯度的低聚半乳糖溶液，经过浓缩、 喷雾干燥得到低聚半乳糖产品。分离出来的杂糖可以返回β半乳糖苷酶的反应步骤进行 综合利用。本发明中，乳糖溶液在β半乳糖苷酶的作用下生成低聚半乳糖混合物，其反应方 程式如下
<formula>formula see original document page 5</formula>如将含 300g/L的乳糖溶液经过装有β半乳糖苷酶的固定化酶反应柱，反应温 度为35°C 65°C，反应pH为4. 5 6. 5。流出反应液中低聚半乳糖的含量一般可以达到 45%。如将含 400g/L的乳糖溶液经过装有β半乳糖苷酶的固定化酶反应柱，反应温 度为35°C 65°C，反应pH为4. 5 6. 5。流出反应液中低聚半乳糖的含量一般可以达到 55%。本发明中制备的特种吸附分离树脂为钠型或钾型螯合树脂。它以酸性大孔树脂作 为载体，将其螯合上金属离子，利用水溶性大分子金属吸附剂与金属离子之间的亲和力，将 吸附剂吸附在树脂表面，并使用交联剂将其固定在酸性大孔树脂上，我们利用大分子金属 吸附剂与各种糖分之间的亲和力差别，实现低聚半乳糖与葡萄糖、半乳糖、乳糖等其他杂糖 之间的完全分离。大孔树脂可选用酸性聚苯乙烯大孔树脂或聚甲基丙烯酸甲酯类大孔树脂；交联剂
可选用二乙烯苯、三乙烯苯、二丙烯苯等多烯基交联剂。本树脂所采用交联剂在树脂中的含量(W/W)为4% 18% ；最佳为8% 12%。本发明制备的特种吸附分离树脂比一般商业树脂具有更高的物理稳定性，磨后圆 球率>99%，树脂均一系数<1.2，适用于80°C左右的长期生产运行。该特种吸附树脂对于 葡萄糖、半乳糖、乳糖等小分子糖分具有很高的吸附量。吸附时，每克树脂至少吸附1克小 分子糖分，一般可以达到1. 5克的吸附量；解吸时，每克树脂至少解吸0. 8克小分子糖分，一 般可以达到1.1克的解吸量。本发明提出的高收率、无污染的生产高纯度低聚半乳糖的模拟移动床色谱技术， 经过酶转化得到的葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖混合液，可以直接进入模拟移动床系 统进行分离，得到高纯度的低聚半乳糖产品。同时分离出来的杂糖可以返回到上游的酶反 应步骤进行综合利用，提高整体产品收率。本发明的模拟移动床色谱分离系统中采用了本发明的特种吸附树脂为固定相填料，采用水为洗脱剂，分离时工作温度为55°C 75°C，最佳温度为65°C。整个系统是连续进 行进料和出料操作。通过β半乳糖苷酶转化反应得到的含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的混 合物直接进入模拟移动床色谱系统，可以得到两种组分，一种是富含低聚半乳糖(低聚半 乳糖纯度80% 95%，一般> 90% )的组分；另一种为富含小分子杂糖(低聚半乳糖纯度 4% 20%，一般< 15% )的组分。模拟移动床系统由4根或4根以上的色谱柱首位串联起来的一个闭合系统，每个 色谱柱都有进料口、进水口、循环口、提取液出料口和残液出料口 ；整个模拟移动床色谱系 统采用夹套保温，并通过可编程控制器(PLC)进行自动控制来切换进料口、进水口、循环 口、提取液出料口和残液出料口的位置，从而实现进料、进水、提取液和残液同时连续运行 操作。按照进出料口位置，系统中所有的色谱柱可以分为4个区带I区带洗脱水入口到杂糖液出口，成为解析区。II区带杂糖液出口到酶转化液入口，成为提取液富集区。III区带酶转化液入口到低聚半乳糖液出口，成为残液富集区。IV区带低聚半乳糖液出口到洗脱水入口，成为循环区。本发明具有的优点如下1.低聚半乳糖和其他杂糖在此树脂上具有非常好的吸 附分离性能，基本实现低聚半乳糖和其他杂糖之间的完全分离；2.分离出来的杂糖可以返 回酶异构柱作为低聚半乳糖生产的原料，提高了整体收率；3.利用模拟移动床色谱技术进 行连续分离，树脂的利用率极高；4.生产成本低，利用模拟移动床色谱技术提纯处理1立方 低聚半乳糖进料，只需要2、立方水和少量电耗；5.生产过程中部使用任何化学品，没有任 何污染排放，是绿色的环保工艺；6.生产过程完全自动化，劳动强度低，生产占地少。
图1为低聚半乳糖生产工艺流程图。图2为模拟移动床色谱的分区图
具体实施例方式a、酶转化生产低聚半乳糖混合物在乳糖溶液中加入β半乳糖苷酶，经过酶反应 把乳糖转化为低聚半乳糖，同时也产生了部分葡萄糖和半乳糖；其反应方程式如下
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<formula>formula see original document page 6</formula>b、合成树脂以酸性大孔树脂作为载体，将其螯合上金属离子，利用水溶性大分子金属吸附剂与金属离子之间的亲和力，将吸附剂吸附在树脂表面，并使用交联剂将其固定在酸性大孔树脂上，合成适合于分离低聚半乳糖和杂糖的钠型或钾型螯合树脂，交联剂在 酸性大孔树脂中的含量为4% 18% ；C、分离提纯将得到的酶转化液作为进料，通过装填有以上述钠型或钾型螯合 树脂作为固定相吸附剂填料的模拟移动床色谱分离系统中，采用水为洗脱剂，分离温度为 55°C 75°C，利用大分子金属吸附剂与各种糖分之间的亲和力差异，实现低聚半乳糖与杂 糖之间的完全分离，制得高纯度低聚半乳糖溶液，在经过常规的蒸发浓缩、喷雾干燥得到高 纯度低聚半乳糖产品。在进行模拟移动床色谱分离时，连续进行进料、出料操作，同时得到两种出料组 分一类为低聚半乳糖纯度达到80% 95%的富含低聚半乳糖的组分；另一类为低聚半乳 糖纯度< 20%的主要含有杂糖液的组分。在浓度为200 400g/L的乳糖溶液经过装有β半乳糖苷酶的固定化酶反应柱， 反应温度为35°C 65°C，反应ρΗ为4. 5 6. 5。流出反应液中低聚半乳糖的含量为40% 60%之间。大孔树脂为酸性聚苯乙烯大孔树脂或聚甲基丙烯酸甲酯类大孔树脂；交联剂为多 烯基交联剂。模拟移动床色谱分离系统中所采用的模拟移动床装置是由4根或4根以上的色谱 柱首位串联起来的一个闭合系统，每个色谱柱都有进料口、进水口、循环口、提取液出料口 和残液出料口 ；整个模拟移动床色谱系统采用夹套保温，可以调节系统保温温度在设定的 恒定温度之间。模拟移动床色谱分离系统按照进出料口位置，系统中所有的色谱柱可以分为4个 区带I区带洗脱水入口到杂糖液出口，成为解析区。II区带杂糖液出口到酶转化液入口，成为提取液富集区。III区带酶转化液入口到低聚半乳糖液出口，成为残液富集区。IV区带低聚半乳糖液出口到洗脱水入口，成为循环区。下一步结合实施实例来进一步介绍本发明工艺。实施例一进料为浓度为300g/L的乳糖溶液经过装有β半乳糖苷酶的固定化酶反应柱，反 应温度为50°C，反应ρΗ为5.0。流出的酶转化液中低聚半乳糖的含量为45%，乳糖18%， 半乳糖12%，葡萄糖25%。将此酶转化液通过模拟移动床色谱，模拟移动床色谱系统操作 条件如下分离温度60°C，进料流量1升/小时，洗脱水流量1. 7升/小时，系统操作压力 1. 0ΜΡ，进料20小时后达到稳定，得到的出料情况如下1)低聚半乳糖部分干物质浓度约13% (体积为进料的 1. 1倍)；低聚半乳糖 纯度87.2%，乳糖11.0%，半乳糖0.5%，葡萄糖1.0%。2)杂糖部分干物质浓度约17% (体积为进料的 1.1倍)；低聚半乳糖纯度 4.4%,乳糖27.4%,半乳糖23. 1%,葡萄糖48. 0%o实施例二进料为浓度为400g/L的乳糖溶液经过装有β半乳糖苷酶的固定化酶反应柱，反应温度为55°C，反应pH为5. 5。流出的酶转化液中低聚半乳糖的含量为56%，乳糖18%，半乳糖4%，葡萄糖22%。将此酶转化液通过模拟移动床色谱，模拟移动床色谱系统操作 条件如下分离温度65°C，进料流量1升/小时，洗脱水流量2. 9升/小时，系统操作压力 1. 1MP，进料20小时后达到稳定，得到的出料情况如下1)低聚半乳糖部分干物质浓度约14% (体积为进料的 2. 8倍)；低聚半乳糖 纯度92%，乳糖6. 1%，半乳糖0.3%，葡萄糖1.3%。2)杂糖部分干物质浓度约19% (体积为进料的 1.2倍)；低聚半乳糖纯度 6.7%，乳糖34. 3%,半乳糖9.1%，葡萄糖50. 3%0
权利要求
一种生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，a、酶转化生产低聚半乳糖混合物在乳糖溶液中加入β半乳糖苷酶，经过酶反应把乳糖转化为低聚半乳糖，同时也产生了部分葡萄糖和半乳糖；其反应方程式如下b、合成树脂以酸性大孔树脂作为载体，将其螯合上金属离子，利用水溶性大分子金属吸附剂与金属离子之间的亲和力，将吸附剂吸附在树脂表面，并使用交联剂将其固定在酸性大孔树脂上，合成适合于分离低聚半乳糖和杂糖的钠型或钾型螯合树脂，交联剂在酸性大孔树脂中的含量为4％～18％；c、分离提纯将得到的酶转化液作为进料，通过装填有以上述钠型或钾型螯合树脂作为固定相吸附剂填料的模拟移动床色谱分离系统中，采用水为洗脱剂，分离温度为55℃～75℃，利用大分子金属吸附剂与各种糖分之间的亲和力差异，实现低聚半乳糖与杂糖之间的完全分离，制得高纯度低聚半乳糖溶液，在经过常规的蒸发浓缩、喷雾干燥得到高纯度低聚半乳糖产品。FSA00000058478000011.tif
2.根据权利要求1所述生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，在进行模拟移动 床色谱分离时，连续进行进料、出料操作，同时得到两种出料组分一类为低聚半乳糖纯度 达到80%、5%的富含低聚半乳糖的组分；另一类为低聚半乳糖纯度<20%的主要含有杂 糖液的组分。
3.根据权利要求1所述生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，在浓度为200 400g/L的乳糖溶液经过装有0半乳糖苷酶的固定化酶反应柱，反应温度为35°C 65°C，反 应pH为4. 5 6. 5。流出反应液中低聚半乳糖的含量为40% 60%之间。
4.根据权利要求1所述生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，大孔树脂为酸性 聚苯乙烯大孔树脂或聚甲基丙烯酸甲酯类大孔树脂；交联剂为多烯基交联剂。
5.根据权利要求1所述生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，模拟移动床色谱 分离系统中所采用的模拟移动床装置是由4根或4根以上的色谱柱首位串联起来的一个闭 合系统，每个色谱柱都有进料口、进水口、循环口、提取液出料口和残液出料口 ；整个模拟移 动床色谱系统采用夹套保温，可以调节系统保温温度在设定的恒定温度之间。
6.根据权利要求1所述生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，模拟移动床色谱 分离系统按照进出料口位置，系统中所有的色谱柱可以分为4个区带I区带洗脱水入口到杂糖液出口，成为解析区。11区带杂糖液出口到酶转化液入口，成为提取液富集区。III区带酶转化液入口到低聚半乳糖液出口，成为残液富集区。IV区带低聚半乳糖液出口到洗脱水入口，成为循环区。
7.根据权利要求1所述生产高纯度低聚半乳糖的方法，其特征在于，多烯基交联剂为 二乙烯苯、三乙烯苯、二丙烯苯。基乙基)银杏内酯B固体口服制剂。
全文摘要
一种生产高纯度低聚半乳糖的方法，涉及高纯度低聚半乳糖的制备方法。本发明通过合成专用树脂，利用模拟移动床色谱技术，从低聚半乳糖的酶转化液中分离制备高纯度的低聚半乳糖。具体方法是1)以乳糖作为原料，在β半乳糖苷酶的下生产含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的混合物。2)再通过模拟移动床色谱系统，在55℃～75℃的操作温度下，以水作为洗脱剂，使低聚半乳糖和其他成分完全分离，得到富含低聚半乳糖的组分和其他杂糖组分。
文档编号C07H3/06GK101831475SQ20101013082
公开日2010年9月15日 申请日期2010年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者方煜宇, 章云 申请人:方煜宇