专利名称：生产超纯低聚半乳糖的方法
技术领域：
本发明涉及从具有低的低聚半乳糖(G0Q含量的乳糖衍生糖浆开始制备高纯度 (^95%)低聚半乳糖的领域。技术现状低聚半乳糖(G0Q包括至少二糖、三糖、四糖、五糖和六糖的混合物，其中葡萄糖是游离还原端的糖，且链中的其他糖是以不同方式连接到彼此和连接到葡萄糖的半乳糖， 不同方式取决于用于从乳糖开始的转糖基反应的酶。当前，对GOS的兴趣稳步增长，因为最近研究已证实这些低聚糖作为益生元的功效在这种意义上，它们是非龋齿性的不可消化的低卡路里低聚糖的混合物，其刺激胃肠微生物区系的发展。GOS的另外的益处是它们的抗粘活性这些低聚糖可直接抑制由肠的病原体例如大肠杆菌引起的感染，充当通常攻击胃肠上皮细胞的病原体的结合部位的模拟物 (mimics)。可商购的GOS通过利用从各种天然微生物(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、 扩展青霉(Penicillium expansum)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulan))或改性微生物分离的半乳糖苷酶(乳糖酶)的转糖基酶活性从乳糖合成。GOS结构根据酶源变化。 用天然酶生产的GOS的收率通常为20-45%，且可通过采用重组体或改性酶来增大。最广泛商购的GOS形式包含按重量计约50-60%浓度的G0S，且还包含相当量的葡萄糖(G0S形成反应的副产物)和未反应的乳糖(起始材料)。这使得它们不能被患有糖尿病或乳糖不耐症的人使用。在文献中已知用于获得高纯度GOS (即不存在所有可消化糖(乳糖、葡萄糖、半乳糖)的GOQ的方法。这些方法包括通过色谱法、酶促氧化或微生物发酵来除去GOS中的葡萄糖和乳糖。然而，上述方法缺乏大规模适用性(在色谱法的情况下)或存在缺点。在Shoaf, K.等人 hfect. Immun. 74 (12) 6920-6928，2006 中，在实验室中通过制备型TLC(因此以几毫克的量)制备了含有无单糖和二糖的GOS的混合物。Splechtna, B.等人Enzyme and Microbial Technology 29 (6) 434-440，2001 描述了通过用真菌纤维二糖脱氢酶将乳糖选择性地氧化成乳糖酸来除去剩余的乳糖。这种酶不易于得到且通过将乳糖氧化与以催化浓度存在的2，6_ 二氯-靛酚的还原结合来工作。通过将分子氧真菌漆酶催化还原成水来连续地再生被氧化的氧化还原介质。离子交换色谱法用于除去乳糖酸。Cheng, C. -C.等人 Biotechnol. Lett. 28793-797，2006 描述了通过用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)发酵来除去剩余的乳糖该方法具有良好的收率且产生无葡萄糖、半乳糖、乳糖的高纯度产物，但和乳糖一样，在用马克斯克鲁维酵母处理之前存在于GOS混合物中的所有其他二糖也被微生物消耗。Li，Z.等人 Process Biochemistry 2008，43 (8)，896-899 描述了通过用固定在藻酸钙上的酿酒酵母或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)发酵来除去可消化糖。当使用乳酸克鲁维酵母时，结果是良好的，但当使用酿酒酵母时，结果是不令人满意的。使用马克斯克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母的缺点是虽然两者都可由公众公开得至IJ，但它们通常不能用于食品工业中，且因此不能以即可使用的形式以低成本商购。明显需要一种用于生产高纯度GOS的可选择的方法，该可选择的方法还可以工业规模应用且所有的可消化糖(乳糖、葡萄糖、半乳糖)不存在或以小量存在并且使用易于得到且可广泛得到的微生物。定义和缩写GOS=低聚半乳糖发明概述本发明通过用于从较低纯度的GOS混合物开始制备纯度> 95%的GOS的方法克服了上述问题，在所述纯度>95%的GOS中，可消化糖，乳糖、葡萄糖、半乳糖的总百分比 < 5%，所述方法包括采用嗜热链球菌的发酵步骤和至少一个采用酿酒酵母的发酵步骤，其中通过能够区别和量化GOS和所述可消化糖的任何分析方法来计算所述纯度。该方法通过微生物净化能够选择性地除去所述可消化糖。有利地，所述方法能够获得具有低含量的可消化糖(乳糖、葡萄糖和半乳糖)的 GOS混合物，其中转糖基作用中形成的所有二糖并不都通过微生物除去。有利地，发现采用嗜热链球菌的发酵步骤能够选择性地除去乳糖，而保留具有与乳糖的HPLC保留时间非常接近的HPLC保留时间的其他二糖。对于通过HPLC可区别的具有紧接在乳糖的峰后面的峰的低聚糖的这种独特保留使得通过本方法获得的产物不同于本领域已知的其他产物。上述方法使用广泛用于食品工业的低成本的可商购的微生物；它们可直接以冻干形式(购买它们时的形式)使用，而不必通过制备预发酵混合物来活化它们。上述方法可易于以工业规模，即以多公斤规模应用。附图简述
图1示出实施例1的通过由环状芽孢杆菌乳糖酶催化的转糖基作用从乳糖获得的 40%纯度的起始GOS样品的HPLC结果(HPLC trace)；图2示出实施例1的根据本发明用酿酒酵母去葡萄糖基化(deglucosation)后的 GOS样品的HPLC结果；图3示出实施例1的根据本发明用嗜热链球菌去乳糖基化(delactosation)后的 GOS样品的HPLC结果；图4示出实施例1的根据本发明用酿酒酵母对与图3相对应的样品去半乳糖基化 (degalactosation)后的GOS样品的HPLC结果A 在发酵至少20小时后，B 在发酵至少 40小时后；图5示出实施例1的根据本发明的方法在结束时获得的具有> 95%的纯度的GOS 样品的HPLC结果；图 6 示出实施例 2 的起始 GOS 样品，即从 GTC Nutrition, Golden, Colorado, USA 购买的 I^urimune^^GO-PgO)的 HPLC 结果；图7示出实施例2的根据本发明的方法在结束时获得的具有> 95%的纯度的GOS 样品的HPLC结果；
图8示出实施例4的在用马克斯克鲁维酵母发酵后获得的GOS样品的HPLC结果。发明详述在本发明的方法中，具有< 95%的纯度的任何GOS混合物可用作起始材料，最便利地使用其中杂质基本上由可消化糖(乳糖、葡萄糖和半乳糖)组成的具有>40%的纯度的GOS混合物。为了本发明的目的，为了计算GOS混合物的纯度，优选使用能够区别和量化G0S、 乳糖、半乳糖和葡萄糖的任何HPLC方法。术语“纯度”指依据HPLC与所述GOS和可消化糖的峰相对应的面积百分比。40-60%纯度(或更高)的GOS混合物可商购(例如，Oligomate 55,Vivinal G0S、 PurimuneXup oligo P)或可通过由已知用于所述目的的合适的乳糖酶诸如从环状芽孢杆菌分离的乳糖酶催化的转糖基作用从乳糖制备。特别地，当从40-60% GOS混合物开始时， 本发明的方法是便利的。优选地，本发明的方法是所述采用嗜热链球菌的发酵步骤后面是采用酿酒酵母的发酵步骤的方法。嗜热链球菌水解乳糖，然后消耗产生的葡萄糖并且积累半乳糖，半乳糖然后被酿酒酵母消除。通过采用嗜热链球菌的发酵步骤，乳糖含量可被降至期望的水平，优选地按HPLC面积百分比计< 5 %，且更优选地< 3 %。在起始GOS混合物具有按HPLC面积百分比计<5%的葡萄糖含量的情况下，则所述方法包括采用嗜热链球菌的发酵步骤，该发酵步骤后面是采用酿酒酵母的发酵步骤。嗜热链球菌水解乳糖，然后在半乳糖积累期间消耗初始存在的少量葡萄糖和其产生的葡萄糖，然后半乳糖随后被酿酒酵母消除。因此，例如(见实施例2)，通过从其中葡萄糖以按HPLC面积百分比计2%的量存在的约近似80%纯度的可商购GOS混合物开始，可通过采用嗜热链球菌的直接发酵将乳糖含量降至期望的水平，即相对于GOS的面积百分比的总和按面积百分比计< 5%。在GOS起始混合物具有按HPLC面积百分比计> 5%的葡萄糖含量的情况下，采用嗜热链球菌的发酵步骤之前是采用酿酒酵母的发酵步骤；因此，在这种情况下，本方法包括以下3个步骤(a)采用酿酒酵母的发酵；(b)采用嗜热链球菌的发酵；(c)采用酿酒酵母的发酵。因此，例如(见实施例1)，当从通过采用环状芽孢杆菌的转糖基作用获得的具有约40%的纯度的GOS混合物(见图1)开始时，采用酿酒酵母的发酵(a)能够几乎完全除去存在于起始GOS混合物中的葡萄糖(见图2)。发酵(b)使乳糖降低至小于3%的HPLC面积百分比(见图3)。可看出，当用其中葡萄糖以约20 %纯度存在的40-60 %纯度的GOS混合物开始时， 如果采用嗜热链球菌的发酵(b)之前是诸如发酵(a)的去葡萄糖基化步骤，则乳糖可被降低至3面积％以下，然而如果在不首先实施采用酿酒酵母的去葡萄糖基化步骤(a)下进行， 则采用嗜热链球菌的直接发酵即使延长多于40小时，也不能使乳糖降低至期望的水平。采用酿酒酵母的发酵(C)使得在采用嗜热链球菌的发酵后形成的剩余半乳糖几乎完全被除去(见图4)。在本方法结束时，获得的GOS混合物具有>95%的纯度，其中葡萄糖和半乳糖(如果不是不存在的话)以可忽略的量存在，然而，所述的葡萄糖和半乳糖连同乳糖一起总计 ^ 5% (见图 5)。采用酿酒酵母的发酵优选地按以下进行在pH 6. 5 士 0.5下，在35 士 5°C的温度下，持续至少12小时，每千克干重起始GOS使用40-15克脱水酿酒酵母。步骤(c)可甚至进行超过40小时的时间段，且在这种情况下，实际上实现在采用嗜热链球菌的发酵(b)后形成的乳酸的大量除去(见图4B)。采用嗜热链球菌的发酵优选地按以下进行在40士5°C的温度下，通过添加碱维持pH在6. 0-6. 5下，持续至少15小时，并且每千克干重起始GOS使用1-0. 4克脱水嗜热链球菌。根据本发明的方法，在发酵步骤后，优选地使混合物通过陶瓷超滤、纳滤、用碳脱色和离子交换树脂去离子作用而经历进一步的处理。根据本发明的方法，发酵步骤(b)和(C)之前是巴氏灭菌，巴氏灭菌优选地在 75 士 5 °C下进行至少5分钟。实际上，在上述方法结束时获得的产物表现独特的GOS曲线；在采用嗜热链球菌的发酵步骤期间，乳糖大体上被除去，这通过HPLC结果是明显的(比较图2与图3，以及图 6与图7)，且还可注意到，在二糖区域中，仍存在具有紧接在乳糖保留时间(约12. 9分钟) 之后的约13. 6分钟的保留时间的组分(在实施例中以G0S6表示)。伴随乳糖的去除，可注意到在紧接乳糖保留时间之前的具有约12. 4分钟的保留时间的组分(在实施例中以G0S5 表示)的消失。GOS曲线的这种保留是独特的，且不同于本领域已知的其他GOS混合物，例如通过色谱分离或在采用克鲁维酵母属微生物净化后获得的GOS混合物(见实施例4和比较图1与图8)，这些方法不加选择地除去存在于GOS混合物中的所有二糖。因此，本发明还涉及通过本方法获得的GOS混合物，即具有> 95%的纯度的GOS混合物，其中除乳糖外的半乳二糖以的量存在，且可消化糖(乳糖、葡萄糖和半乳糖)的总百分比彡5%0通过本方法获得的上述产物可用于已知的用途，包括药物组合物、婴儿配方奶粉和食品组合物的制备，这些是本发明的另外的方面。根据下面工作实施例可更好地理解本发明。实验部分HPLC 方法这是使用与外标比较的HPLC方法。HPLC仪器与等梯度泵、自动进样器、用于柱温控制的珀尔帖烘箱、折光检测器和装备有类似前置柱的产品编码ICE-99-9850的 Transgenomic柱ICE-SEP ICE-ION 300 一起使用。在下面的工作条件下进行分析柱温40°C注射20 μ 1流动相H2SO4O. 015Ν流速0. 4ml/ 分钟分析时间36分钟积分仪Perkin Elmer Totalchrom 工作站在上述条件下，每种产物的保留时间为乳糖约12. 5分钟，葡萄糖15. 0分钟、半乳糖16. 2分钟、乳酸21. 3分钟和甘油22. 2分钟(相对于外标)。在样品溶液中，区分6个GOS产物峰并且标识为GOS 1 在约9. 3分钟处的峰GOS 2 在约9. 7分钟处的峰GOS 3 在约10. 3分钟处的峰GOS 4 在约11. 3分钟处的峰GOS 5 在约12. 4分钟处的峰GOS 6 在约13. 6分钟处的峰。在HPLC制表中，术语G0S1-6仅指归属于GOS的峰，与其中存在的糖单元的数目无关。积分系统通过以下公式自动计算含量%= AsX Cstd XVX 100/Astd X Ws其中Ac =样品溶液中的峰的面积Cstd =标准溶液中的糖的百分浓度Ws=以克表示的样品重量Astd =标准溶液中的糖峰的面积在方法监测期间，GOS峰的含量不是相对于它们自己的标准品来计算，而是通过使用乳糖的响应因子或通过评估以面积/总面积表示的其纯度来计算。使用刚描述的分析方法，由于与其他低聚半乳糖的可能重叠而使乳糖的确定无效。重要的是注意到，使用上述分析方法对商用样品中乳糖的确定和证书上提供的值之间存在巨大的差异。例如，由Friesland Foods Domo 提供的批号拟97770 的样品 VIVINAL G0S60
具有基于干物质的17. 5%的认证的乳糖含量，而通过在我们的分析实验室中进行的HPLC， 乳糖含量为33.2%。评估乳糖的相似评估见于批号20081217的Purimime 样品中，其中GOS的认证的总纯度为90.4%，然而，通过在我们的分析实验室中进行的HPLC(附上)，所述纯度为 83.0%，具有按面积百分比计13. 6%的乳糖纯度。因此，通过我们的分析方法确定的乳糖被过高评估，导致过度评估存在于最终产物中的乳糖浓度。为了不在本说明书中产生歧义，在下文呈现的实施例中和在附图部分中，仅给出通过上述HPLC方法获得的纯度值，对于商用产品的值也一样。实施例1-从乳糖开始制备的实施例将80kg —水乳糖(0. 22kmol)悬浮在1201水中，并且在温和搅拌下加热到70°C，
直至乳糖完全溶解。将溶液温度控制在50°C，并且用27ml 75%磷酸将pH从5. 5调节到5. 0。添加来自环状芽孢杆菌的乳糖酶(1500U/g)。通过HPLC监测反应，并且在22小时后，检测到GOS的形成以及葡萄糖和半乳糖的出现，且随之发生乳糖面积百分比纯度降低至小于40%。获得200kg 40%的粗GOS溶液，粗GOS溶液的HPLC结果在图1中示出，并且在下面以表格形式呈现
权利要求
1.一种用于从较低纯度的GOS混合物开始制备具有> 95%的纯度的GOS混合物的方法，在所述具有>95%的纯度的GOS混合物中，可消化糖，乳糖、葡萄糖和半乳糖的总百分比< 5%，所述方法包括一个采用嗜热链球菌(Str印tococcus thermophilus)的发酵步骤和至少一个采用酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)的发酵步骤，其中通过能够区别和量化GOS和所述可消化糖的任何分析方法来计算所述纯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述采用嗜热链球菌的发酵步骤后面是采用酿酒酵母的发酵步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，当起始GOS混合物具有HPLC面积百分比<5%的葡萄糖含量时，所述方法包括采用嗜热链球菌的发酵步骤，其后面是采用酿酒酵母的发酵步骤。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，当所述起始GOS混合物具有HPLC面积百分比> 5%的葡萄糖含量时，所述采用嗜热链球菌的发酵步骤之前是采用酿酒酵母的发酵步骤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述采用酿酒酵母的发酵按以下进行在pH 6. 5士0. 5下，在35士。C的温度下，持续至少12小时，每千克干重起始GOS使用 40-15克脱水酿酒酵母。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述采用嗜热链球菌的发酵优选地按以下进行在40士5°C的温度下，通过添加碱维持pH在6. 0-6. 5，持续至少15小时，并且每千克干重起始GOS使用1-0. 4克脱水嗜热链球菌。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在发酵步骤后，使混合物通过陶瓷超滤、纳滤、用碳脱色和离子交换树脂去离子作用而经历进一步的处理。
8.具有>95 %的纯度的GOS混合物，其中除乳糖外的半乳二糖以> 1 %的量存在，且可消化糖，乳糖、葡萄糖和半乳糖的总百分比彡5%。
9.药物组合物或食品组合物，包含根据权利要求8所述的GOS混合物。
全文摘要
本发明描述了一种通过使用涉及酿酒酵母和嗜热链球菌的连续微生物净化从较低纯度的低聚半乳糖(GOS)开始制备超纯(≥95％)低聚半乳糖的方法。
文档编号C12P19/04GK102471792SQ201080035013
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月6日 优先权日2009年8月7日
发明者卢瓦纳·瓦尼奥利, 西尔维亚·柏尔吉奥里尼, 西尔维亚·贾科梅利, 贾瓦尼·斯波纳蒂, 雅格布·奇尼, 马可·马罗尼 申请人:意纳科有限公司