专利名称：一种固相环化合成Laterocidin化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种固相环化合成Laterocidin化合物的方法，特别是涉及到合成起 点的选择、基团的保护策略和肽链的首尾环合方法。
背景技术：
自20世纪40年代人类历史上发现第一个环肽Gramicidin S(GS)以来，人们不断 的从植物、真菌、细菌以及海洋生物中分离得到各种具有生物活性的环肽。生物活性环肽能 形成限制性构象，与相应线性肽相比在生物体内具有更好的抗酶解和抗化学解得能力，在 形成荷尔蒙、抗生素、离子载体系统、抗真菌素、癌制剂以及毒素等方面都具有良好的生物 活性。生物环肽在寻找酶的抑制剂、受体拮抗剂等许多方面也有着广阔的应用前景，随着环 肽组合库研究的不断发展，在寻找受体和药物作用靶点工作中，环肽组合库将可能成为很 好的诊断和治疗研究工具。无论从何种意义上来说，环肽都是最重要的一类多肽化合物。特 别是一些特定结构的环肽，在药物、纳米材料、生物离子通道及超分子自组装等领域都具有 广泛的用途。而且随着各种对常用抗生素具有抵抗作用的致病性细菌和真菌的出现，人类 的健康受到很大的威胁，因此寻找新的抗菌剂成为目前一项重大的任务。近年来，制药业很 少推出非常有效的新抗生素，而且就目前的抗生素其活性也没有任何提高。环肽潜在的抗 菌活性使其在自然免疫方面起着很大的作用。关于用环肽治疗传染病方面的研究一直在进 行。鉴于环肽的诸多优点和其在天然产物中的含量很低，近年来对多肽研究的热点已转移 到环肽的合成上。但环肽复杂的结构使得其合成需要熟练的技巧，即使是中等尺度的环肽， 要使产率达到50%以上也是一件很难的事情。 Laterocidin是具有抗菌活性的 一 种新型环肽化合物。俄罗斯专利 (RU2229520C120040527)中报道了从侧孢芽孢杆菌中提取分离Laterocidin化合物的方 法、化学结构和抗菌活性。但是，天然产物含量低，提取收率低，提取成本高。
发明内容
要解决的技术问题 为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种固相环化合成Laterocidin化合 物的方法，通过合成起点及环合方法的选择，首次化学合成Laterocidin化合物及其类似 物。主要解决Laterocidin化合物及其类似物化学环合困难及从天然产物中提取成本高的 问题。 技术方案 —种固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于步骤如下
步骤1 :将氨基树脂加入反应器中，再加入脱除芴甲氧羰基试剂反应洗涤树脂，称 取相当于树脂摩尔比2 5倍上载量的氨基酸加入反应器中，加入活化剂1-羟基苯并三唑 和縮水剂二异丙基碳二亚胺，其中氨基酸、活化剂、縮水剂三者的摩尔比例为1 :1:1;
所述脱除芴甲氧羰基试剂的制备为吡啶的10 30X的N，N二甲基甲酰胺溶液，摩尔比例过量1 3倍，反应15 30分钟； 步骤2 :按照步骤1依次连接上其它氨基酸，获得保护的直链多肽结构式
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中Aa6为任意氨基酸，x = nh ; 步骤3 :在树脂中加脱除芴甲氧羰基试剂反应，用n，n-二甲基甲酰胺洗涤树脂；加 入2X的肼反应2分钟，重复三次；然后分别用n，n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙醇、二氯甲 烷依次洗涤3次树脂，得到环合前体化合物，结构式为
其中Aa5、Aa6为任意氨基酸，x = nh ; 步骤4 :在树脂上环合时，添加环合剂六氟磷酸苯并三唑-1-基_氧基三吡咯烷基
磷，i-羟基苯并三唑和n，n-二异丙基乙胺；树脂六氟磷酸苯并三唑-i-基-氧基三吡咯 烷基磷i-羟基苯并三唑n， n-二异丙基乙胺的摩尔比例为i :5:5: o. i，并加入
浸没物质的有机溶剂，室温反应12小时以上；然后分别用n，n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙
醇、二氯甲烷依次洗涤3次树脂得到环合化合物；所述有机溶剂为n， n- 二甲基甲酰胺、二氯
甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃中的一种或几种的混合溶剂；所述环合化合物结构式为
<formula>formula see original document page 7</formula> 其中Aa5、Aa6为任意氨基酸，X = NH ; 步骤5 :加入剪切试剂将脂肪酰环酯肽从树脂上剪下，剪切反应时间为2 5小时；滤除树脂珠，用氮气或空气流赶走滤液中的三氟乙酸，然后经冷乙醚沉淀和洗涤干燥得到Laterocidin化合物，结构式为
<formula>formula see original document page 7</formula>
其中Aa5、Aa6为任意氨基酸，X = NH ; 所述剪切试剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯酚和水，重量比例为95 :i:2:2。 采用"王树脂"替代步骤1中的氨基树脂，且不用脱除芴甲氧羰基试剂反应洗涤；步骤2获得保护的直链多肽结构式中X = 0，步骤3得到的环合前体化合物结构式中X =0，步骤4环合化合物结构式中X = 0，步骤5得到Laterocidin化合物结构式中X = 0。
所述脱除芴甲氧羰基试剂的反应为两次，第一次时间为5 15分钟，第二次时间为5 15分钟。 所述步骤1中的氨基酸为Fmoc-Asp-ODmab或者Fmoc-Glu-ODmab。 所述步骤2中的氨基酸为N-芴甲氧羰基_氨基酸，相对于树脂上载量的2 5倍。 所述每连接一个氨基酸都要进过kaiser test,如反应呈现阳性则重复连接氨基
酸；脱除芴甲氧羰基保护后都要进过kaiser test,如反应呈现阴性则重复脱除芴甲氧羰基保护。 所述步骤5处理干燥是指将剪切液用氮气或者空气吹干，加入冰乙醚沉淀析出固体，离心干燥得到Laterocidin粗品并回收乙醚。
有益效果 本发明提出的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，选择了 Fmoc-Asp-ODmab或Fmoc-Glu-ODmab作为合成的第一个氨基酸，通过脱除Dmab保护，为Laterocidin化合物的环合提供了位点。选择了最新的环合条件即六氟磷酸苯并三氮唑a-羟基苯并三唑/N，N-二异丙基乙胺反应48小时，提高了环合产率。该方法可以适应用于分子结构中含有天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺等残基结构的环肽合成，快速高效，简单易行。
图1 :天然产物侧孢芽孢杆菌素Laterocidin化合物的结构 a. Laterocidin的结构 b. Laterocidin类亍以物的结构 其中X = 0或NH ;Aal = Fmoc_Asp_0Dmab或Fmoc_Glu_0Dmab ;Aa2、Aa3、Aa4、Aa5、Aa6、 Aa7、 Aa8、 Aa9、 AalO分别为任意一个a _氨基酸； 图2 :Laterocidin化合物通用合成路线 图3 :本发明固相合成侧孢芽孢杆菌素Laterocidin的路线实例
具体实施例方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述 本发明实施例中一些常用的縮写具有以下含义 B0C :叔丁氧羰基 N2H4 :肼 Dmab :4-{^[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己烯)3-甲基丁基]-氨基_}节基 DCM :二氯甲烷CH2C12 DMF :N， N_ 二甲基甲酰胺 NMP :N-甲基妣咯烷酮 DIC :二异丙基碳二亚胺 DIEA :N， N-二异丙基乙胺 DMF :N， N_ 二甲基甲酰胺 Fmoc:荷甲氧羰基 Fmoc-AA :N_荷甲氧羰基_氨基酸 Fmoc-Asn (Trt) -OH :N-芴甲氧羰基-天冬酰胺(三苯甲基) Fmoc-D-Phe-OH :N_荷甲氧羰基_D_苯丙氨酸 Fmoc-Pro-OH :N_芴甲氧羰基_脯氨酸 Fmoc_Asp_0Dmab或Fmoc_Glu_0Dmab Fmoc-D-Tyr (Boc) -OH :N-芴甲氧羰基-酪氨酸(叔丁氧羰基) Fmoc-Leu-0H :N-芴甲氧羰基-亮氨酸 Fmoc-Orn (Boc) -OH :N-芴甲氧羰基-鸟氨酸(叔丁氧羰基) Fmoc-Val-OH :N_荷甲氧羰基_缬氨酸 Fmoc-Asp-ODmab :N_荷甲氧羰基-天冬氨酸4-{N-[l_(4，4-二甲基_2，6_ 二氧代环己烯)-3-甲基丁基]-氨基_}节基酯 Fmoc-Glu-ODmab :N_荷甲氧羰基_ a _谷氨酸4_ {N_[l_ (4， 4_ 二甲基_2， 6_ 二氧
代环己烯)-3_甲基丁基]-氨基_}节基酯 H0BT : 1-羟基苯并三唑 PyBOP :六氟磷酸苯并三氮唑 Piperidine :妣啶 TFA:三氟乙酸 THF:四氢呋喃
8
Trt :三苯基
具体实施例1 1. 1直链Laterocidin化合物前体的合成 称取Wang树脂(0. 2-0. 3mmol/g) 50mg于Bio-Spin空柱，加入二氯甲烷，充分溶胀树脂0. 5-1. 0小时，抽干，用DMF洗两次。取Fmoc-Asp-ODmab 112mg、 HOBT 24mg于1. 5ml的离心管中，加入lmlDMF置旋转混合仪上旋转溶解，让其预反应10分钟，再将此反应溶液加入树脂中，最后加入27ul DIC反应3小时，用DMF洗涤三次以上，抽干，加入20%的吡啶的DMF溶液lml，反应15分钟，抽干，再加入此溶液反应10分钟，用DMF洗涤三次以上。此时，第一个氨基酸Asp已经连接上树脂。 同样的方法依次连接上Fmoc-Asn (Trt) _0H、 Fmoc-D-Phe—OH、 Fmoc-Phe—0H、Fmoc_Pro_0H、 Fmoc_D_Tyr (Boc) _0H、 Fmoc_Leu_0H、 Fmoc_0rn (Boc) _0H、 Fmoc_Val_0H、Fmoc-Leu-0H，用20%的吡啶的DMF溶液脱除Fmoc保护后，用DMF、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷分别洗涤三次，得到直链Laterocidin前体。
1. 2直链肽在树脂上的环合 称取166. 5mg PyB0P、43. 2mg H0BT加入lmL NMP溶解，预反应10min后，加入Rink树脂中，再加入53 ii L DIEA，反应48h，使之充分环合，抽干液体，然后依次用NMP， DMF， DCM，甲醇洗涤数次，真空干燥。 1.3从树脂上剪切环十肽并分离纯化 Rink树脂中加入lmL剪切溶液(三氟乙酸三异丙基硅烷苯酚水=95 : 1 : 2.2)反应2 3h，滤出液体，并用此液体洗涤树脂3次，合并滤液，用氮气吹干三氟乙酸，加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上静置15min后，离心(12000rpm， 4°C ， 15min)，重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得Laterocidin产品。
实施例2 : 附图3的反应条件a.第一个氨基酸(Fmoc-Asp-0Dmab)/H0BT/DIC/王树脂，3h ;b. 20%哌啶(DMF) ， 15min，2次，Fmoc保护氨基酸(从Aa2到Aa10)/H0BT/DIC， 2h ;重复连接；c. 20 %哌啶(DMF) ， 15min， 2次；d. 2 % N2H4 (DMF) ， 3min， 3次；e. PYB0P/H0BT/DIEA/NMP，48h ;f TFA/TIS/苯酚/H20 (95/1/2/2) ， 3h.
权利要求
一种固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于步骤如下步骤1将氨基树脂加入反应器中，再加入脱除芴甲氧羰基试剂反应洗涤树脂，称取相当于树脂摩尔比2～5倍上载量的氨基酸加入反应器中，加入活化剂1-羟基苯并三唑和缩水剂二异丙基碳二亚胺，其中氨基酸、活化剂、缩水剂三者的摩尔比例为1∶1∶1；所述脱除芴甲氧羰基试剂的制备为吡啶的10～30％的N，N二甲基甲酰胺溶液，摩尔比例过量1～3倍，反应15～30分钟；步骤2按照步骤1依次连接上其它氨基酸，获得保护的直链多肽结构式其中Aa6为任意氨基酸，X＝NH；步骤3在树脂中加脱除芴甲氧羰基试剂反应，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂；加入2％的肼反应2分钟，重复三次；然后分别用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙醇、二氯甲烷依次洗涤3次树脂，得到环合前体化合物，结构式为其中Aa5、Aa6为任意氨基酸，X＝NH；步骤4在树脂上环合时，添加环合剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，1-羟基苯并三唑和N，N-二异丙基乙胺；树脂∶六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷∶1-羟基苯并三唑∶N，N-二异丙基乙胺的摩尔比例为1∶5∶5∶0.1，并加入浸没物质的有机溶剂，室温反应12小时以上；然后分别用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙醇、二氯甲烷依次洗涤3次树脂得到环合化合物；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃中的一种或几种的混合溶剂；所述环合化合物结构式为其中Aa5、Aa6为任意氨基酸，X＝NH；步骤5加入剪切试剂将脂肪酰环酯肽从树脂上剪下，剪切反应时间为2～5小时；滤除树脂珠，用氮气或空气流赶走滤液中的三氟乙酸，然后经冷乙醚沉淀和洗涤干燥得到Laterocidin化合物，结构式为其中Aa5、Aa6为任意氨基酸，X＝NH；所述剪切试剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯酚和水，重量比例为95∶1∶2∶2。FSA00000067041200011.tif,FSA00000067041200012.tif,FSA00000067041200021.tif,FSA00000067041200022.tif
2. 根据权利要求1所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于采 用"王树脂"替代步骤1中的氨基树脂，且不用脱除芴甲氧羰基试剂反应洗涤树脂；步骤2 获得保护的直链多肽结构式中X = 0 ;步骤3得到的环合前体化合物结构式中X = 0 ;步骤 4环合化合物结构式中X = 0 ;步骤5得到Laterocidin化合物结构式中X = 0。
3. 根据权利要求1所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于所 述脱除芴甲氧羰基试剂的反应为两次，第一次时间为5 15分钟，第二次时间为5 15分 钟。
4. 根据权利要求1所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于所 述步骤1中的氨基酸为Fmoc-Asp-ODmab或者Fmoc-Glu-ODmab。
5. 根据权利要求1所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于所 述步骤2中的氨基酸为N-芴甲氧羰基-氨基酸，相对于树脂上载量的2 5倍。
6. 根据权利要求1所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于所 述每连接一个氨基酸都要进过kaiser test,如反应呈现阳性则重复连接氨基酸。
7. 根据权利要求1所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于所 述脱除芴甲氧羰基保护后都要进过kaiser test,如反应呈现阴性则重复脱除芴甲氧羰基 保护。
8. 根据权利要求l所述的固相环化合成Laterocidin化合物的方法，其特征在于所述步骤5处理干燥是指将剪切液用氮气或者空气吹干，加入冰乙醚沉淀析出固体，离心干 燥得到Laterocidin粗品并回收乙醚。
全文摘要
本发明涉及一种固相环化合成Laterocidin化合物的方法，步骤将氨基树脂进行脱除芴甲氧羰基后用N，N二甲基甲酰胺洗涤树脂，然后连接氨基酸获得保护的直链多肽；加入肼得到环合前体化合物；添加环合剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，1-羟基苯并三唑，N，N-二异丙基乙胺，得到环十肽产品。该方法可以适应用于分子结构中含有天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺等残基结构的环肽合成，快速高效，简单易行。
文档编号C07K7/06GK101792487SQ20101013199
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者任锦, 尚晓娅, 张瑞洁, 徐春兰, 李洋, 牛卫宁, 王秋雨, 钦传光 申请人:西北工业大学