一种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法。本发明在诱导产生包涵体后，通过优化的裂解方法破碎菌体，初步去除了一部分杂质，接着通过对包涵体进行一系列处理，使得包涵体形成可溶性目标蛋白，避免了使用尿素、盐酸胍等变性剂对包涵体的变性溶解和复性。而镍柱亲和层析使得可以纯化获得的蛋白量比较大，具有纯度高，操作简单等优点。本发明从不溶性包涵体中分离纯化出来可溶性的目的蛋白，避免了反复变性复性的繁琐步骤以及复性过程中的蛋白沉淀的危险，并且所获得的蛋白纯度可以达到电泳纯。
【专利说明】-种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒II型（Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰 竭综合征（PMWS)的主要病原。自1991年首次在加拿大发生PMWS以来，现在全世界大多数 养猪国家均有该病的报道，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。PCV 2基因组11个 开放阅读框（open reading frames, ORFs)中0RF 2是主要的开放阅读框。在PCV2中， 0RF2起始密码子起始于第1033或1034位核苷酸，共有702个碱基，编码234个氨基酸(基 因序列反义链上0RF2终止子由TAA变为AAG，而造成0RF2阅读框加长，全长705bp，其终止 子为TGA)，编码分子量约为30kDa的主要功能蛋白一Cap蛋白。Cap蛋白作为病毒的主要 结构蛋白，构成PCV2的核衣壳，而且也是PCV2的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产 生特异性免疫应答，是研制PCV2亚单位疫苗的理想靶抗原。目前市场上销售的猪圆环病毒 疫苗有全毒株疫苗即灭活疫苗和减毒活疫苗，以及通过昆虫细胞培养以及腺病毒表达系统 进行生产的衣壳蛋白亚单位疫苗。但是全毒株病毒有毒力恢复的潜在危险，而通过昆虫细 胞培养获和腺病毒表达系统获得的亚单位疫苗价格昂贵。
[0003] 大肠杆菌是一种廉价且技术成熟的表达系统，其遗传背景清楚、繁殖能力强、培养 周期短、目标基因表达水平高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5 %? 30 %，且下游工艺简单、易于控制，抗污染能力强，代谢途径和基因表达调控机制比较清楚， 已有大量可供选择利用的表达载体。被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，运用非 常广泛。另外，目前报道研究猪圆环病毒衣壳蛋白作为亚单位疫苗的研究很多，但是用于工 业化生产的研究并不是很透彻。
[0004] 高超[猪圆环病毒2型0RF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立及应 用[J] ·中国兽医学报，2008,28⑶：888-891.]利用PCV2 0RF2内含的Eco/PI酶切位点， 及载体上含有的ΧΑοΙ酶切位点，从已构建的克隆质粒PMD-0RF2上切除含5'端核定位信号 区域，将截短的0RF2基因片段克隆到pGEX-6p-l表达载体上，并将重组表达质粒转化入大 肠杆菌感受态BL21中，通过IPTG诱导表达重组菌，重组蛋白表达产物以包涵体形式存在于 菌体中，进行超声波裂解菌体，包涵体洗涤、溶解及尿素梯度透析复性，最后电洗脱法纯化 重组蛋白。本发明在诱导产生包涵体后，通过优化的裂解方法破碎菌体，初步去除了一部分 杂质，接着通过对包涵体进行一系列处理，使得包涵体形成可溶性目标蛋白，避免了使用尿 素、盐酸胍等变性剂对包涵体的变性溶解和复性。而镍柱亲和层析使得可以纯化获得的蛋 白量比较大，具有纯度高，操作简单等优点，为开发商业化的猪圆环病毒基因工程亚单位疫 苗以及相关研究提供了工业化的理论基础及为重组疫苗进行商业化提供了理论依据。
【发明内容】
[0005] 鉴于此，本发明提供了一种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法。
[0006] 本发明采取的技术方案如下： 一种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，包括重组菌的诱导表达、菌体 破碎和裂解、镍柱亲和层析纯化、透析。
[0007] 所述重组菌的制备：猪圆环病毒II型病毒的开放阅读框0RF2基因的576bp整合到 载体pET28a上，导入到宿主大肠杆菌BL-21 (DE3)中，得到重组菌。
[0008] 所述菌体破碎和裂解的步骤包括：用PBS缓冲液洗涤菌体，溶菌酶处理30min，离 心后去除部分杂蛋白，经过两次的TritonX-100的裂解洗涤，获得含目的蛋白的沉淀，用含 有0. 5% (v/v)脱氧胆酸钠的PBS缓冲液溶解沉淀，获得可溶性目的蛋白。
[0009] 具体步骤如下： ⑴：洗涤菌体，按每克湿重菌体用15ml PBS缓冲液重复洗涤，高速离心，弃上清，离心 条件为 8000rpm，4°C，5 min ; ⑵：溶菌酶破坏细胞壁，使用浓度为1?l〇mg/ml的溶菌酶裂解大肠杆菌，37°C，震荡 30min，高速离心，弃上清，收集沉淀； ⑶加入去污剂TritonX-ΙΟΟ,使终浓度为0. 5% (v/v)，充分混匀，此时溶液变得粘稠， 说明细菌细胞内的核酸释放出来，细菌裂解，加入DNase I，终浓度lug/ml，充分混匀，待溶 液不再粘稠，说明核酸被降解，高速离心，弃上清，收集沉淀；为了使菌体充分裂解，再次用 PBS缓冲液重悬沉淀，加入TritonX-ΙΟΟ,使终浓度为0. 5%(v/v)，充分混匀，高速离心，收集 沉淀； ⑷：获得含包涵体沉淀，使用含有0. 5% v/v脱氧胆酸钠的PBS缓冲液溶解沉淀，静置 30min，离心，上清含有较多目的蛋白，而且该目的蛋白为可溶性，即为所获得的上清液。 [0010] 所述PBS缓冲液为pH=7. 4、50mM PBS缓冲液。
[0011] 所述镍柱亲和层析纯化的步骤包括：上样即步骤四所获得的上清液，后用 bufferA平衡镍柱，bufferB洗漆杂蛋白，bufferC洗脱并收集目的蛋白。
[0012] 具体步骤如下： ① 镍柱的平衡 (1) 5倍柱体积的bufferA洗漆镍柱； (2) 1M NaOH洗涤柱子，确保NaOH与镍柱至少结合30min ; (3) 去离子水冲洗镍柱，使得镍柱pH小于9 ; (4) 5倍柱体积的bufferA平衡镍柱； ② 上样：样品需要经过高速离心去除颗粒较大的杂质，或者用〇. 45um孔径的滤膜过 滤； ③ 缓冲液平衡柱料：上完样品后用10倍柱体积的bufferA再平衡镍柱； ④ bufferB洗漆杂蛋白； ⑤ bufferC洗脱并收集目的蛋白。
[0013] 所用 bufferA 为 pH=7. 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl ; bufferB 为 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，lOOmM 咪唑； bufferC 为 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
[0014] 本发明的技术路线如图1所示。
[0015] 本发明从不溶性包涵体中分离纯化出来可溶性的目的蛋白，避免了反复变性复性 的繁琐步骤以及复性过程中的蛋白沉淀的危险，并且所获得的蛋白纯度可以达到电泳纯。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的技术路线图。
[0017] 图2为目的蛋白的SDS-PAGE以及western blot检测结果，其中1-3上样，穿流峰， 100mM咪唑洗脱峰，4-6 250mM咪唑洗脱峰。
[0018] 图3纯化的目的蛋白的SDS-PAGE。
【具体实施方式】
[0019] 1重组细菌的诱导表达 本实验室所用病毒毒株来自福州大北农生物科技有限公司，通过扩增获得该 猪圆环病毒II型病毒的开放阅读框0RF2基因的576bp，其中整合到该基因上Nco I和 Xho I两个酶切位点，双酶切该基因，并且用相同的酶切体系消化pET28a载体，酶连0RF2基 因和pET28a载体，转化到克隆菌种T0P10中，测序验证，然后将该质粒导入到宿主大肠杆菌 BL-21(DE3)中，IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE以及Western blot技术分析，检测到有目的 蛋白的表达，并且该目的蛋白以包涵体形式存在。
[0020] 2工程菌的发酵 将保存的工程菌种在含有的kana抗性的LB培养基平板上画线，37°C活化过夜，挑取表 面光滑，颗粒较大的菌落，37°C扩大培养10h，培养条件为37°C，200rpm。将菌液按1:100转 接到含有kana抗性的LB液体培养基中。待菌体生长到对数期时加入诱导物IPTG，终浓度 为lmg/ml，继续培养10h，培养条件为37°C，200rpm。
[0021] 所用kana抗生素浓度为50ug/ml。
[0022] 所用LB培养基配方如下： Yeast extract (0. 5% w/w) NaCl (1% w/w) Tryptone (1% w/w)〇
[0023] 3细菌的优化破碎方法 高速离心收获菌体，其中每l〇〇ml培养液约含菌体0. 5~0. 7g，破碎菌体。其中破碎菌体 方法较多，高压均质裂解法、超生裂解法、化学裂解液裂解法、酶解法、反复冻融法等等各种 方法。
[0024] 本实验通过一种新的方法来从包涵体中获取可溶性目的蛋白。
[0025] 步骤详细如下： ⑴：洗涤菌体，按每克湿重菌体用15ml PBS重选洗涤。高速离心，弃上清。离心条件为 8000rpm,4°C ,5 min〇
[0026] ⑵：溶菌酶破坏细胞壁。使用浓度为1?10mg/ml的溶菌酶裂解大肠杆菌，37°C， 震荡30min。高速离心，弃上清，收集沉淀。由于大肠杆菌是革兰氏阴性菌，单独使用溶菌酶 效果不理想。
[0027] ⑶去污剂裂解大肠杆菌PBS重悬沉淀，加入去污剂TritonX-100,终浓度为0. 5%， 充分混匀，此时溶液变得粘稠，说明细菌细胞内的核酸释放出来，细菌裂解，加入DNase I， 终浓度lug/ml，充分混匀，此时可以使用功率较小的超声波清洗器来加速溶液的混匀，但必 须加入冰，确保温度不至于升高太快。待溶液不再粘稠，说明核酸被降解，高速离心，弃上 清。收集沉淀。为了使菌体充分裂解，再次用PBS重悬沉淀，加入TritonX-ΙΟΟ,充分混匀， 高速离心，收集沉淀。
[0028] (4):经过前几步的裂解菌体以及去污剂的使用，可以获得含包涵体沉淀，使用含有 0. 5%的脱氧胆酸钠的PBS溶解沉淀，静置30min，离心，上清含有较多目的蛋白，而且该目的 蛋白为可溶性。该方法的优点是破碎菌体时虽然使用了溶菌酶，但是离心后将该杂蛋白去 除，并且经过两次的TritonX-100的裂解洗涤，去除了较多的杂蛋白，为以后的纯化带来了 方便。
[0029] 其中PBS缓冲液为50mM的磷酸盐缓冲液，ρΗ=7· 4。
[0030] 4镍柱亲和层析 详细步骤如下： ①镍柱的平衡 (1) 5倍柱体积的bufferΑ洗漆镍柱； (2) 1M NaOH洗涤柱子，确保NaOH与镍柱至少结合30min ; (3) 去离子水冲洗镍柱，使得镍柱pH小于9 ; (4) 5倍柱体积的bufferA平衡镍柱。
[0031] ②上样，样品需要经过高速离心去除颗粒较大的杂质，或者用0. 45um孔径的滤 膜过滤。对于每毫升柱料流速不超过〇. 2ml/min。
[0032] ③缓冲液平衡柱料，上完样品后用10倍柱体积的buff erA再平衡镍柱。
[0033] ④bufferB洗漆杂蛋白。经过大量实验的摸索，发现100mM的咪唑可以洗脱下绝 大多数杂蛋白。
[0034] ⑤bufferC洗脱并收集目的蛋白。
[0035] SDS-PAGE以及western blot检测结果如图2所示。标有箭头的为纯化的目的蛋 白，以及western blot检测结果。
[0036] 所用 bufferA 为 pH=7. 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl ; bufferB 为 ρΗ=7· 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl; lOOmM 咪唑； bufferC 为 ρΗ=7· 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl; 250mM 咪唑； ⑥纯化的目的蛋白的透析和浓缩 将纯化的目的蛋白放入到透析袋中，在PBS缓冲液透析4h，然后重新换缓冲液透析过 夜。随后将透析袋取出，并用聚乙二醇20000进行浓缩，获得的蛋白浓度较高，达到0. 3mg/ ml，如图3。
[0037] 5总结展望 目前对不溶性蛋白，尤其是包涵体的纯化依然是个难题，本实验通过优化破碎菌体，减 少了纯化时的杂蛋白的污染，其次，使用较温和的表面活性剂溶解包涵体。通过该步骤可以 使50%的包涵体溶解。并且通过镍柱亲和层析获得非常纯的重组蛋白，为工业化纯化包涵 体提供了新的思路。
【权利要求】
1. 一种重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，其特征在于：包括重组 菌的诱导表达、菌体破碎和裂解、镍柱亲和层析纯化、透析；所述菌体破碎和裂解的步骤 包括：用PBS缓冲液洗涤菌体，溶菌酶处理30min，离心后去除部分杂蛋白，经过两次的 TritonX-ΙΟΟ的裂解洗涤，获得含目的蛋白的沉淀，用含有0. 5%v/v脱氧胆酸钠的PBS缓冲 液溶解沉淀，获得可溶性目的蛋白。
2. 根据权利要求1所述的重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，其特征在 于：所述菌体破碎和裂解的步骤，具体步骤如下： ⑴：洗涤菌体，菌体用PBS缓冲液重复洗涤，高速离心，弃上清，离心条件为8000rpm， 4°C , 5 min ； ⑵：溶菌酶破坏细胞壁，使用浓度为1?l〇mg/ml的溶菌酶裂解大肠杆菌，37°C，震荡 30min，高速离心，弃上清，收集沉淀； ⑶加入去污剂TritonX-ΙΟΟ,使终浓度为0. 5%v/v，充分混匀，此时溶液变得粘稠，说明 细菌细胞内的核酸释放出来，细菌裂解，加入DNase I，终浓度lug/ml，充分混匀，待溶液不 再粘稠，说明核酸被降解，高速离心，弃上清，收集沉淀；为了使菌体充分裂解，再次用PBS 缓冲液重悬沉淀，加入TritonX-ΙΟΟ,使终浓度为0. 5%(v/v)，充分混匀，高速离心，收集沉 淀； ⑷：获得含包涵体沉淀，使用含有0. 5% v/v脱氧胆酸钠的PBS缓冲液溶解沉淀，静置 30min，离心，取上清，得到可溶性目的蛋白。
3. 根据权利要求1或2所述的重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，其特 征在于：所述PBS缓冲液为pH=7. 4、50mM PBS缓冲液。
4. 根据权利要求1所述的重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，其特征在 于：所述镍柱亲和层析纯化的步骤包括：上样后用bufferA平衡镍柱，bufferB洗漆杂蛋白， bufferC洗脱并收集目的蛋白。
5. 根据权利要求4所述的重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，其特征在 于：所用 bufferA 为 pH=7. 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl ; bufferB 为 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，lOOmM 咪唑； bufferC 为 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
6. 根据权利要求4所述的重组猪圆环病毒衣壳蛋白包涵体的分离纯化方法，其特征在 于：所述镍柱亲和层析纯化，具体步骤如下： ① 镍柱的平衡 (1) 5倍柱体积的bufferA洗漆镍柱； (2) 1M NaOH洗涤柱子，确保NaOH与镍柱至少结合30min ; (3) 去离子水冲洗镍柱，使得镍柱pH小于9 ; (4) 5倍柱体积的bufferA平衡镍柱； ② 上样：样品需要经过高速离心去除颗粒较大的杂质，或者用〇. 45um孔径的滤膜过 滤； ③ 缓冲液平衡柱料：上完样品后用10倍柱体积的bufferA再平衡镍柱； ④ bufferB洗漆杂蛋白； ⑤ bufferC洗脱并收集目的蛋白。
【文档编号】C12R1/19GK104109704SQ201410324737
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】吕暾, 王立波, 乔春晓, 王伟东, 庄星来, 洪晶, 林拱阳, 陈晟生 申请人:福州大学, 福州大北农生物技术有限公司