专利名称：抗肠道病毒71型衣壳蛋白1 IgM AlphaLISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠道病毒71型的免疫学检测，具体地说，涉及抗肠道病毒71型衣壳蛋白I IgM AlphaLISA检测试剂盒。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)是感染婴幼儿手足口病(HFMD)的主要病原。EV71感染后导致的症状包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎以及脊髓灰质炎样的麻痹。该病的主要特征是短时间内的高死亡率。由于没有有效的针对EV71的抗病毒治疗方法，目前防治手足口病的措施主要是依赖于对该病的快速诊断和及时阻止病毒的流行，试验室诊断EV71主要依靠基于病毒基因组的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以及病毒分离试验，但是，这些方法在大部分基层诊所和医院很难得到完全的应用。IgM抗体在感染EV71的早期以及后期暴露的患者血清中经常反复出现，因此，我们可以通过检测抗EV71的IgM来建立诊断手足口病的诊断方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肠道病毒71型衣壳蛋白I IgMAlphaLISA检测试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种抗肠道病毒71型衣壳蛋白IIgM AlphaLISA 检测试剂盒，其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原；其中，所述供体微珠包被有含25mMHEPES、IOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300, pH7. 2的链霉亲和素溶液，浓度为20μ g/ml，500l·! I ;所述所述受体微珠包被有含O. 05% Proclin-300, ρΗ7·2 的 PBS 溶液，浓度为 5 μ g/ml，500 μ I。所述肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原的氨基酸序列如Seq ID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。前述的试剂盒，包括供体微珠20 μ g/ml、受体微珠5 μ g/ml及生物素化的肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原37. 5ng/孔；使用时，以总体系20 μ I计，每孔添加量为受体微珠 8 μ I、供体微珠10 μ I、生物素化的肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原37. 5ng及血清2 μ I。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果利用本发明的试剂盒进行肠道病毒71型的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗漆，不受溶血影响。
图I为EV71 VPl全长的核酸电泳图；图2为EV71 VPl蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果，第一泳道为预染蛋白分子量标准，从上至下分子量依次为175kD、83kD、62kD、48kD、33kD、25kD、17kD、7kD ;第二泳道为EV71 VPl全长1-297，分子量大小约为34kD，与预期结果一致；
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图3为HiS-标签EV71 VPl全长蛋白的Western blot鉴定结果。第一泳道为EV71 VPl全长1-297，分子量大小约为34kD。第二泳道为Western blot蛋白分子量标准，从上至下分子量依次为50KD、40KD、30KD、20KD。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中使用的肠道病毒毒株EV71/Fuyang. Anhui. CHU/17. 08/1见Zhang 等.病毒学杂志，2010，7 :94)保存于中国疾病预防控制中心病毒病所。实施例一、EV71 VPl重组蛋白原核表达质粒的构建及鉴定I目的片段扩增I. IPCR循环扩增以毒株 EV71/Fuyang. Anhui. CHU/17. 08/1 (GenBank No. EU703812)的基因组为模板，进行反转录，通过常规聚合酶链式反应(PCR)扩增所需目的片段EV71 VPl 1-297 (GenBank Number HM579945. I)，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，编码的氨基酸序列如Seq ID No. I所示。上下游引物分别引入Nde I和Xho I酶切位点，引物设计采用Primer Premier 5(—种引物设计软件)软件,引物由上海生工公司合成，引物序列见表I。表I引物序列
权利要求
1.抗肠道病毒71型衣壳蛋白IIgM AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，包括供体微珠、受体微珠及生物素化的肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原；其中，所述供体微珠包被有含 25mM HEPESUOOmM NaCl 和 O. 05% Proclin-300, pH7. 2 的链霉亲和素溶液；所述受体微珠包被有含O. 05% Proclin-300, pH7. 2的PBS溶液； 所述肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原的氨基酸序列如Seq ID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，包括供体微珠20μ g/ml、受体微珠 5 μ g/ml及生物素化的肠道病毒71型衣壳蛋白I抗原37. 5ng/孔；使用时，以总体系20 μ I 的肠道病毒71型衣壳蛋白I计，每孔添加量为受体微珠抗原37. 5ng及血清2 μ I。·8 μ I、供体微珠10 μ I、生物素化
全文摘要
本发明提供了一种抗肠道病毒71型衣壳蛋白1 IgM AlphaLISA检测试剂盒，其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的肠道病毒71型衣壳蛋白1抗原。本发明通过ELISA法摸索出生物素化后的VP1的最适量为37.5ng，并通过优化供体微珠、受体微珠、血清等试验反应条件，建立了基于抗EV71 VP1的IgM AlphaLISA检测方法。利用本发明的试剂盒进行肠道病毒71型的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗涤，不受溶血影响。
文档编号G01N33/569GK102590505SQ20121003180
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者董小平, 陈操, 韩俊, 高晨 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所