根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法

专利名称：根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法
根癌农杆菌介导ZS0">2抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法 技术领域根癌农杆菌介导抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母，将外源基因 整合到宿主染色体上，属于基因工程中转化技术领域。
技术背景转化是酵母基因操作技术中的重要步骤之一。由于酵母细胞不像大肠杆菌和枯草芽胞杆菌等原核微生物那样具有可以将外源DNA摄入细胞内的特殊生理 状态(感受态)'，因此酵母转化曾是酵母基因工程研究的一大限制因素。目前广 泛采用的酵母转化方法主要有原生质体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法等。 这些方法在酿酒酵母的遗传转化研究上已取得了巨大的成功。由于工业应用酵母菌株和实验室用的酵母菌株在细胞壁结构、生理生化特 性、遗传背景及生长环境等方面存在巨大的差异，在转化工业应用酵母时需要 建立相对应的转化体系。但是，上面所述的转化方法在转化一些工业酵母菌株 时往往存在转化率低、转化子稳定性差、难以重复等困难，有些菌株甚至无法 转化。针对这一问题，研究人员提出了不同的改进方法以及新的转化方法。其 中，根癌农杆菌(JgraZwcten'MW ^me/"c/era)介导的遗传转化法是有效的方法 之一。1995年Bundock等首次成功进行了根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化。进 一步研究发现根癌农杆菌介导的遗传转化法具有转化低拷贝、高频率转移、成 本低、稳定性好、操作方便和重复性好、能转化大片段DNA (大到50Kb的外 源DNA)、能明显提高转化率获得稳定的转化子等优点，在应用领域中具有很大 的潜能。产甘油假丝酵母是目前我国用于工业化发酵生产甘油的优良菌株之一，它 具有甘油产率高、耐高渗压、发酵条件粗放、菌体生长速度及发酵速度快、转 化率高、发酵原料简单等优点。除了甘油，产甘油假丝酵母还能产生多种其他 多元醇，如赤藓醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一株具有很高的潜在应用 价值的酵母。采用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能 的途径，实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法，在此基础上才有可 能对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造，以达到提高甘油产量和改善 工艺的目的。成功建立其遗传转化体系能改进甘油生产，还可以为通过代谢工 程进一步构建高产其他多元醇的重组菌创造条件，所采用的转化方法和载体构 建方法也能为其他耐高渗酵母的基因工程改造提供借鉴。因此，建立产甘油假 丝酵母的遗传转化体系具有重要意义。本发明采用根癌农杆菌转化系统来转化产甘油假丝酵母，实现了产甘油假 丝酵母的遗传转化体系的成功建立。发明内容本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导MOC/"抗性基因转化工业化产甘 油假丝酵母的方法，构建双元载体成功地实现了根癌农杆菌介导产甘油假丝酵 母的转化。并针对产甘油假丝酵母生长快的特点对转化条件进行了适当的优化。 为进一步研究产甘油假丝酵母打下了良好的基础。本发明的技术方案根癌农杆菌介导抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，是以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得2eocf"抗性基因， 再与线性化质粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300- zeoc// ;质粒 pCAM 3300—zeo"'"转化根癌农杆菌LBA4404，再和产甘油假丝酵母共培养， 根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300—zeoc/w质粒转化工业化产甘油假丝酵母；(1) 基因的克隆 根据M0"'T7基因的特异性设计引物弓i物R: 5'醒GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3'; 弓1物F: 5，- ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3 ，；PCR扩增zeo"Vz基因得到300bp的特异条带；PCR方法如下取质粒pPICZB模板1 jiL， 10 xPCR缓冲液2 (iL，引物R、 F各lpL， dNTPs2(iL， Taq DNA聚合酶0.5 pL，总反应体积为20 |_iL;循环参 数94 。C预变性5 min， 94 。C 45 s， 56°C 90 s， 72 °C卯s， 35个循环，72 °C 延伸10min;通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片 断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easy vector连接保存；再用相应五coi I酶切，胶回收zeoc^目标基因，￡caR I酶切 线性化质粒pCAM 3300;在T4连接酶的作用下连接得到pCAM 3300-zeoc&;(2) 质粒pCAM3300—zeoc&转化根癌农杆菌LBA4404将重组质粒pCAM 3300—zeocZ"通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404， 在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌 LBA4404/pCAM 3300—，c〖Vz;(3) 根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'"质粒转化工业化产甘油假丝酵母将重组菌LBA4404/pCAM3300—zeoc/"于LB培养基(卡那霉素50 pg/mL，
利富霉素50吗/mL，链霉素30|Lig/mL)中，30°C， 200 r/min摇床培养36 h，离 心收集菌体；用等体积的IM培养基重悬，培养6h;接种产甘油假丝酵母 WL2002-5于YPD培养基中，30°C、 200 r/min摇床培养过夜；产甘油假丝酵母 的YPD培养液按1:5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6h;分别离心收集根癌 农杆菌菌体和产甘油假丝酵母，用生理盐水清洗一次，用IM培养基重悬菌体， 产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个 /mL，各取50fiL加入20mLIM培养基(乙酰丁香酮200 pmol/L，卡那霉素50 1Lig/mL，利富霉素50|iig/mL)中30。C、 200 r/min共培养过夜；取200 |iL培养 液涂布铺有玻璃纸的IM+AS固体培养基平板置于25T:培养24h;将玻璃纸转接 到SM培养基(头孢噻月亏200|amol/L， zoec/w 150 mg/L)上培养两天，筛选阳 性酵母转化子。重组根癌农杆菌LBA4404/pCAM3300—zeoc/"介导转化产甘油假丝酵母 WL2002-5的优化转化条件(1) IM固体培养基诱导时间优化优化的共培养时间为24h;(2) 共培养根癌农杆菌菌体浓度优化产甘油假丝酵母比根癌农杆菌菌体细胞比例为1:500-1000时，最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞。zeoc&是一种属于争光霉素家族的糖蛋白抗生素，在体内能作用于大多数 细菌(包括:￡."//)和真菌(如酵母菌)。为了高效挑选阳性转化子，从质粒pPICZB 上获得zeo"'w抗性基因插入质粒pCAM 3300，获得重组质粒pCAM 3300- zeo"'n。通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404。在卡那霉素抗性平板上挑取抗性 转化子，提取质粒酶切验证。本发明的有益效果根癌农杆菌转化酵母系统具有操作简单(不需要制备 原生质体)、转化效率高、易于得到转化子、转化子遗传稳定等优良的特点。耐 高渗产甘油假丝酵母(C朋^^g&cm^gewM) WL2002-5是江南大学工业微生 物研究中心的科技工作者经过三十年的潜心研究得到的优良菌株微生物学报 Vol.39 No. 1 1999.2。产甘油假丝酵母具有甘油产率高、耐高渗、生长快、发 酵原料简单等优点。除了甘油，耐高渗酵母还能产生多种其他多元醇，如赤藓 醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一类具有很高的潜在应用价值的酵母。采 用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能的重要途径，实 现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法，在此基础上才有可能对产甘油 假丝酵母代谢途径进行有目的的改造，以达到提高甘油产量和改善工艺的目的。 成功建立其遗传转化体系除可以改进甘油生产外还可以为通过代谢工程进一步 研究产甘油假丝酵母，以及构建高产其他多元醇的重组菌创造条件。因此，建 立产甘油假丝酵母的遗传转化体系具有重要意义。


图1重组质粒pCAM 3300-zeocz'"的构建图2质粒pCAM 3300-zeocz'"酶切验证Lane 1 T-zeoc/"/五coR I ; Lane 2 DNA Marker: DL20002; Lane 3 zeo"'"/ ￡coR I ; Lane 4 pCAM 3300/￡coR I ; Lane 5 pCAM 3300-磨"感coR I ; Lane 6. pCAM 3300-zeo"惑awh I ; Lane 7 DNA Marker: XDNA/历"dIII。图3阳性转化子PCR验证 Lane 1 zoecz'"基因的特异扩增；Lane2 DNA Marker DL2000; Lane 3、 4、 5、 6阳性转化子zoec/"基因特异扩增；Lane 7产 甘油假丝酵母加ec^基因特异扩增；Lane 8产甘油假丝酵母18S rDNA扩增。图4不同诱导时间转化子生长情况 1.诱导培养0h;2.诱导培养12h; 3.诱导培养18h; 4.诱导培养24h; 5.诱导培养30h; 6.诱导培养36h。
具体实施方式
实施例1 构建重组质粒pCAM 3300-以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得z "'"抗性基因，再与线性化质 粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300- zeoc/",zeoc/w基因的克隆根据Zeo"Vz基因的特异性设计引物引物R: 5'-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG -3，； 弓1物F: 5,- ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3 ，；PCR扩增zeo"'"基因得到300bp的特异条带；PCR方法如下取质粒pPICZB模板1 |iL， 10xPCR缓冲液2jiL，引物R、 F各lpL， dNTPs2^iL， Taq DNA聚合酶0.5 pL，总反应体积为20 (iL;循环参 数94。C预变性5min， 94 。C 45 s， 56°C 90 s， 72 °C 90 s， 35个循环，72 °C 延伸10 min。通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片 断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easy vector连接保存；再用相应五co/H酶切，胶回收zeoc^目标基因，五coiM酶切 线性化质粒pCAM 3300;在T4连接酶的作用下连接得到pCAM 3300-zeo"'"。实施例2质粒pCAM 3300—zeoc/"转化根癌农杆菌LBA4404将重组质粒pCAM 3300—zeoc/"通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404， 在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌LBA4404/pCAM 3300—z固,"。实施例3 根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300—zeo"'w质粒转化工业化产甘 油假丝酵母 接种含有质粒pCAM 3300-2eoc/"的根癌农杆菌LBA4404于LB培养基(卡 那霉素50吗/mL，利福霉素50吗/mL，链霉素30昭/mL)中，3(TC， 200 r/min 摇床培养36h，离心收集菌体，用等体积的IM培养基重悬，培养6h;接种产 甘油假丝酵母于YPD培养基中，30°C、 200 r/min摇床培养过夜；产甘油假丝 酵母的YPD培养液按1:5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6 h。分别离心收 集酿酒酵母和根癌农杆菌菌体，用生理盐水清洗一次，用IM培养基重悬菌体， 酿酒酵母细胞终浓度达到109个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL， 各取50 pL加入20 mL IM培养基(乙酰丁香酮200 (imol/L，卡那霉素50 吗/mL，利富霉素50吗/mL)中3(TC， 200 r/min共培养过夜。取200 fiL培养 液涂布铺有玻璃纸的IM+AS固体培养基平板置于25'C培养24 h;将玻璃纸转 接到SM培养基(头孢噻躬200 jimol/L，150 mg/L)上培养两天，筛选 阳性酵母转化子。将初步确认的产甘油假丝酵母阳性转化子接中于YPD液体培养基中3(TC ， 200r/min培养18h,提取染色体进行PCR鉴定，同时作阴性对照，由于产甘油假 丝酵母内不含有zeodn基因，根据zeod"基因和产甘油假丝酵母染色体的差异 设计的引物，产甘油假丝酵母染色体无法扩增出z "力基因，而阳性转化子可 以扩增得到2 "Vz基因，这说明转化子中已含有了zeoci"基因。PCR鉴定的结 果初步表明了通过根癌农杆菌介导转化的方法已实现了^oc/"基因对产甘油假丝酵母转化。实施例4 重组根癌农杆菌LBA4404/pCAM3300—^ocz'"介导转化产甘油假 丝酵母WL2002-5的优化转化条件(1) IM固体培养基诱导时间优化取培养过夜的IM培养液，适当稀释涂布IM固体培养基，共培养0、 12、 18、 24、 30、 36、 40 h将玻璃纸平行转移到SM固体培养基进行筛选培养，观 察SM平板上转化子的生长情况。同时对IM培养液进行酵母菌落计数，计算 转化率，优化的共培养时间为24h。(2) 共培养根癌农杆菌菌体浓度优化取109个/mL的酵母细胞10 pL，和1011个/mL的根癌农杆菌细胞1、 10、 50、 100、 200、 500 pL混匀共培养，筛选阳性转化子并计算转化率。以50 100 pL混匀共培养转化率最佳，折算为产甘油假丝酵母比根癌农杆菌菌体细胞比例 为1:500-1000时，最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞。
权利要求
1、根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，其特征是以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得zeocin抗性基因，再与线性化质粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300-zeocin；质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404，再和产甘油假丝酵母共培养，根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母；(1)zeocin基因的克隆根据zeocin基因的特异性设计引物引物R5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；引物F5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；PCR扩增zeocin基因得到300 bp的特异条带；PCR方法如下取质粒pPICZB模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL；循环参数94℃预变性5min，94℃45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35个循环，72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easyvector连接保存；再用相应EcoR I酶切，胶回收zeocin目标基因，EcoR I酶切线性化质粒pCAM 3300；在T4连接酶的作用下连接得到pCAM 3300-zeocin；(2)质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404将重组质粒pCAM 3300-zeocin通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin ；(3)根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母将重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin于LB培养基中，30℃，200 r/min摇床培养36 h，离心收集菌体；用等体积的IM培养基重悬，培养6h；接种产甘油假丝酵母WL2002-5于YPD培养基中，30℃、200r/min摇床培养过夜；产甘油假丝酵母的YPD培养液按1∶5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6h；分别离心收集根癌农杆菌菌体和产甘油假丝酵母，用生理盐水清洗一次，用IM培养基重悬菌体，产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL，各取50μL加入20mL IM培养基中30℃200r/min共培养过夜；取200μL培养液涂布铺有玻璃纸的IM+AS固体培养基平板置于25℃培养24h；将玻璃纸转接到SM培养基上培养两天，筛选阳性酵母转化子。
2、根据权利要求l所述的方法，其特征是重组根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'n介导转化产甘油假丝酵母WL2002-5的优化转化条件(1) IM固体培养基诱导时间优化优化的共培养时间为24h;(2) 共培养根癌农杆菌菌体浓度优化产甘油假丝酵母比根癌农杆菌菌体细胞比例为1:500-1000时，最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞。
全文摘要
根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母，将外源基因整合到宿主染色体上，属于基因工程中转化技术领域。本发明通过构建质粒pCAM 3300-zeocin，将其电击转化根癌农杆菌。通过将含有目的质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌和产甘油假丝酵母共培养，利用zeocin抗性基因为筛选标记，实现了pCAM 3300-zeocin对产甘油假丝酵母的转化。根据根癌农杆菌的生长特性，对转化条件进行了优化，在共培养时间为24h，细胞比例为1∶500-1000时最高转化率达到2个转化子/10⁴个酵母细胞。初步建立了根癌农杆菌介导转化工业化产甘油假丝酵母的转化方法，为进一步研究产甘油假丝酵母打下基础。
文档编号C12N15/31GK101130781SQ20071002414
公开日2008年2月27日 申请日期2007年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者张君胜, 徐美娟, 方慧英, 微 沈, 诸葛健, 饶志明 申请人:江南大学