专利名称：一种快速发酵生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种快速发酵生产乙醇的方法。
背景技术：
随着化石能源的不断消耗，出现能源供应危机；同时因化石能源消耗而排放出大量二 氧化碳等有害气体带来的温室效应和大气污染，已影响人类社会的生存与发展。发展燃料 乙醇等生物质液体燃料是人类对应上述危机的主要对策之一。目前，世界范围内，乙醇产 量的60%用作车用燃料。在巴西、美国等国家主要以甘蔗、玉米等作为燃料乙醇生产原料。 我国是一个人口大国，燃料乙醇生产原料的选择应以"不与人争粮、不与粮争地"为原则。 根据我国国情，发展木薯、甘薯、芭蕉芋、甜高粱等非粮作物生产燃料乙醇是最有前途的方向。
甘薯、芭蕉芋等非粮作物成本非常低廉，且易栽种，我国占世界产量的绝大部分。但 是，这些原料季节性强，含水量大，收获时间比较集中，利用的附加值低，保藏很困难。 原料腐烂后黏度大、输送困难，还会产生许多抑制发酵的成分，淀粉损耗更是惊人。因此， 在收获季节，大量利用这些鲜原料发酵生产乙醇，对于降低生产成本有重要价值。
目前，对于快速发酵乙醇的研究尚欠缺。现有的乙醇发酵研究水平，生产11%~15% (体积)的乙醇，发酵时间通常在40~72h之间，发酵效率也不高。若应用于工业生产， 则因发酵周期长而产生的费用很高。甘薯、芭蕉芋等具有中国特色的淀粉质原料，国外的 研究很少，国内已有的乙醇生产技术水平较低。酒精厂以鲜甘薯为原料，发酵得到的乙醇 浓度仅有5%~7%，发酵时间高达50h以上，平均乙醇生产速度仅有1.0gL"h"左右，使 得乙醇生产缺乏竞争力。因此，研究开发更优的发酵工艺，提高发酵液乙醇浓度，縮短发 酵时间，将会极大提高乙醇生产效能，增强乙醇生产的竞争力。
酵母发酵糖类生产乙醇一般可以分为两个阶段酵母生长繁殖、少量产乙醇；酵母发 酵乙醇阶段，大量产乙醇。要实现酿酒酵母快速发酵糖类生产乙醇就必须縮短酵母生长时 间，快速积累菌体达到高峰值，并且使酵母菌代谢活动旺盛，其生产乙醇的一系列关键酶 高效表达从而处于适合生产乙醇的最佳状态并保持较长时间。但是较高浓度的糖(一般认 为大于150g/L)抑制酵母生长和乙醇发酵作用，初始糖浓度越大，这种抑制作用越明显， 甚至酵母菌完全停止生长。同时，随着发酵液中乙醇浓度的增加，乙醇对细胞膜渗透性， 酶活性等影响很大，菌体也很难大量积累。另外，酵母若过度繁殖，则消耗过多糖，会导致发酵效率的降低。因此，通过发酵调控，创造适宜酵母快速生长和快速产乙醇的环境因 子，并控制最佳的生物量，延长酵母保持最佳发酵状态的时间，是酵母实现快速、高效转 化糖类生产乙醇的必要途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有工艺利用甘薯、芭蕉芋等薯类原料在收获季节乙醇发酵技术 水平低，乙醇含量低，发酵时间长，能耗高的不足，开发一种快速发酵生产乙醇的新方法。 该方法基本思路是通过微生物代谢控制技术人为干预碳源等底物在细胞生物量积累和产 物乙醇之间的合理分配，实现生物量的高效快速积累和生物量积累到乙醇发酵的快速转换 从而实现快速高效乙醇发酵。该方法以常规酿酒酵母为菌种，采用添加发酵控制调节剂、
适量供氧和使发酵液中抑制剂CCb有效排出，从而提供了一种縮短发酵时间和提高发酵效
率的乙醇生产方法。
本发明快速发酵生产乙醇的技术包括发酵培养基中添加发酵调节剂；发酵前期供应
适量氧气，使发酵液的溶解氧为50% 100%;搅动体系，使发酵液C02排出。本发明所
涉及的调节剂为VB1、肌醇、泛酸和生物素的混合物，其每升发酵液的添加量为VB1 10 200 mg，肌醇50 200mg，泛酸100 200mg，生物素5 50 pg。 本发明的工艺步骤为
1. 培养基制备
保存培养基为普通麦芽汁斜面培养基或YEPD斜面培养基。
种子培养基成分为(g L"):葡萄糖60 100，酵母粉5 10， (NH4)2S041.5， MgS04'7H20 0.1， CaCl20.05 0.1， pH6.0 6.5。
发酵培养基为(gL"):总糖(碳源)180 280;酵母粉4 10;蛋白胨4 10; (NH4)2S04 1.5~2.5; KH2P04或K2HP04l 2; MgS04.7H20 0.4~1.0; CaCl2l~4;维生素发酵调节剂； pH值6.0 6.5。
碳源可以一次加入也可分数次加入。分次加入，则首次加入150 180gL'1，其余的于 发酵至8 16h时分次补料加入。
本发明的碳源可以是葡萄糖或淀粉质原料(包括木薯、米粉、甘薯、芭蕉芋、玉米粉 等)，但淀粉质原料需经水解等方法处理后得到葡萄糖、果糖等可利用糖。
2. 制备种子液从斜面上挑取一铲酵母菌接种至种子培养基中，25 35°C， 100 300r/min摇床通风培养14 18h。
3. 淀粉质原料的处理淀粉质原料在温度90 95'C下液化lh，液化酶用量为10 30 U/g原料，冷却至55°C，稀硫酸调节pH4.5左右，添加糖化酶，糖化1 h，糖化酶用量200 600U/g原料。可以全渣发酵也可经固液分离，以糖清液用于发酵。
4.发酵:将灭菌后的发酵液接种前或接种后通入适量氧气,使其溶解氧为50% 100%。 种子接种量为8% 12% (种子液与发酵液的体积比)。发酵温度为25 35"C，优选温度为 27 33°C。搅动体系，使发酵液C02排出。经20 40h发酵结束。
发酵结束后，测量发酵液中最终乙醇浓度、残糖、菌体量以及菌体生长状况。发酵液 的乙醇浓度为11% 15% (20°C，体积比浓度)，残糖0.2%~0.5% (g/100mL)。用菌体干 重测量生物量(离心后，105'C烘干至恒重)。镜检菌体生长健壮、整齐、活力高。
本发明的优点如下
(1) 发酵工艺简单，可以一次性投料，简化了工序，节约成本，并降低染菌几率。
(2) 通过微生物代谢调控，控制适当的生物量，既能快速转化乙醇又能减少菌体大量 繁殖对碳源的消耗，从而得到很高的发酵效率(高达91%以上)。
(3) 批次发酵结束后，菌体活力仍然很强，死亡率极低，该工艺适合用于工业连续发酵。
(4) 该工SfOTII原料(甘薯、芭蕉芋等)带渣发酵，因鲜原料含水量大，可以大量 节约用水。
(5) 乙醇生产周期縮短2倍以上，可以收获季节大量利用甘薯、芭蕉芋等原料，减少 保藏费用。同时将大大降低设备运行费用，提高设备利用率，能有效地降低乙醇生产成本， 具有良好的经济效益。
具体实施例方式
以本实验室筛选的酿酒酵母Sflcc/Kww^c^ cem;/;y/ae SY-1为菌种发酵，该菌于2006 年10月23日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCM206111。
实施例l:发酵培养基中总糖为196gL'1， 一次性投料，其余成分为(gU1):酵母 粉5，蛋白胨5， (NH4)2S041.5, KH2P041,5， MgS04.7H20 0.6， CaCl23.0, pH6.0 6.5。 调节剂添加量为(mgl/1) : VB120，肌醇170mg，泛酸llOmg，生物素7.5 pg。 0.08MPa 条件下灭菌15min。通入无菌空气，溶解氧68%。接种，3(TC发酵。发酵20h结束，最终 乙醇浓度11.92% (20°C， P7F，以下同)，发酵效率为93.90%，残糖0.24% (g/100mL)。 菌体干重12.5 g L—1。平均乙醇生产速度为4.7 g U1 h"。
实施例2:发酵培养基中总糖为217gL'1，其余成分同实施例l， 1L发酵，发酵时间 为29h，乙醇浓度13.27%，效率94.42%，残糖0.50%,菌体量11.79 g L"。平均乙醇生产 速度为3.6gU'h"。
实施例3:发酵培养基中总糖为230gU1，其余成分为(gl/1):酵母粉6，蛋白胨5，(NH4)2SO42.0， KH2P041.8， MgS04.7H20 0.8， CaCl22.0， pH6.0 6.5。调节剂添加量为(mg L'1) : VB150，肌醇150mg，泛酸150mg，生物素20吗。0.08MPa条件下灭菌15min。 通入无菌空气，溶解氧79%。接种，3(TC发酵。发酵过程一次性投料，发酵时间为30h， 乙醇浓度为13.80%;残糖降至0.42%。平均乙醇生产速度为3.6 g L" h"。
实施例4:培养基同实施例3，将发酵结束后的发酵液去除清液，留下菌体，再次加 入新鲜培养液，糖浓度为245 g！/1，发酵时间仅为22h。乙醇浓度为14.85%，残糖0.26%， 发酵效率93.59% 。平均乙醇生产速度为5.3 g L" h"。
实施例5:培养基同实施例3，葡萄糖浓度为255gL—1，若一次性投料，发酵时间37h， 乙醇浓度15.32%;若在9h补料一次，则发酵时间为38h，乙醇浓度为15.06%，残糖降至 0.34%。平均乙醇生产速度为3.1 g L" h"。
实施例6:将新鲜甘薯打浆，经双酶液化、糖化后用于发酵。总糖浓度为20.97 g/100g， 其余成分为(gL"):酵母粉4，蛋白胨8， (NH4)2S042.5， KH2PO42.0， MgS04.7H20 0.4， CaCl22.8， pH6.0 6.5。调节剂添加量为(mgl/'): VB1 200，肌醇50 mg，泛酸200 mg， 生物素45吗。发酵时间24h，乙醇浓度9.99g/100g，发酵效率93.23%。平均每1000g发 酵液每小时产乙醇4,2g。
总糖浓度为18.85 g/100g，培养基及调节剂同上；发酵时间23h，乙醇浓度9.07g/100g， 发酵效率94.16%。平均每1000g发酵液每小时产乙醇3.9g。
实施例7:将新鲜芭蕉芋打浆，经双酶液化、糖化后用于发酵。总糖浓度为19.25 g/100g， 其余成分为(gL"):酵母粉8，蛋白胨4， (NH4)2S041.8, KH2PO41.0, MgS04.7H20 0.8， CaCl22.5， pH6.0 6.5。调节剂添加量为(mgL") : VB1 150，肌醇100 mg，泛酸100 mg， 生物素50吗。发酵时间22h,乙醇浓度9.19g/100g，发酵效率93.43%。平均每1000g发 酵液每小时产乙醇4.2g。
权利要求
1.一种快速发酵生产乙醇的方法，包括种子培养、发酵培养，其特征是发酵培养基中添加发酵控制调节剂，其组成和用量为每升发酵液加VB1 10～200mg、肌醇50～200mg、泛酸100～200mg、生物素5～50μg；发酵前期供应氧气，使发酵液的溶解氧为50％～100％；搅动体系，使发酵液CO2排出；经25～35℃发酵，20～40h得到体积比浓度达11％～15％的乙醇。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种快速发酵生产乙醇的方法。本发明通过在发酵培养基中添加由V<sub>B1</sub>、肌醇、泛酸和生物素组成的发酵控制调节剂；发酵前期供应氧气；搅动排出发酵液中的CO<sub>2</sub>等方法，达到快速生产乙醇的目的。本发明具有发酵工艺简单、乙醇转化速度快、生产成本低、适合工业化等特点。
文档编号C12P7/10GK101302541SQ20071004907
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月11日 优先权日2007年5月11日
发明者艳 刘, 吕发康, 戚天胜, 沈昭萍, 海 赵 申请人:中国科学院成都生物研究所