专利名称：一种鉴定外周血dna肝癌相关p53基因249位密码子突变的多重pcr的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及一种一次性扩增多个P53基因片段，从而鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。
背景技术：
原发性肝细胞癌(HCC)是一种严重威胁人类健康的恶性疾病，在我国发病率较高，病人占全球的40％～50％，年死亡率达20.4/10万人。随着分子生物学在医学领域的广泛应用，研究表明，肝癌的发生和进展与抑癌基因的突变及失活/癌基因的异常活化密切相关，是其产生的重要分子生物学基础。P53基因是当前受到广泛重视，已被深入研究了解的一个抑癌基因。P53基因的突变而导致的P53蛋白功能缺失已被证实与多种恶性肿瘤的发生及进展密切相关。在我国及多数发展中国家，肝细胞肝癌(肝癌)的发生与黄曲霉素B1经食物摄入以及乙型肝炎病毒感染密切相关，且这类病人多伴有P53基因249位密码子突变。据统计，我国约40％以上的肝细胞肝癌伴有P53基因249位密码子突变。
传统的肝癌辅助诊断手段主要包括血清学检测和影像学检测两大类。血清学检测主要是利用血清中的甲胎蛋白水平测定对肝癌进行诊断，如中国发明专利申请200610112962.1号公开的一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒，该发明涉及了一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱。该离心柱由上部分离管和下部收集管组成。上部分离管装有偶联小扁豆凝集素(LCA)的亲合介质，上部分离管底部是一个滤布，下部收集管中装有缓冲溶液。小扁豆凝集素(LCA)能与甲胎蛋白异质体糖链相结合。另外，中国发明专利申请200510108154.3号公开的一种凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体AFP-L3定量检测试剂盒，该试剂盒可作为肝癌早期诊断的指标，判断肝癌的发生，为肝癌的预防、诊断、治疗提供直接的支持。但由于在肝癌患者中仍有约56.6％可能出现甲胎蛋白检测阴性，且甲胎蛋白水平无法准确反映患者的疾病进展及预后，因此仍具有一定的应用局限性。
在对肝癌病人外周血DNA突变分析的研究中发现，外周血DNA的P53基因249位密码子突变检测可能作为肝癌的早期诊断指标，与其他检查指标相结合，可以进一步提高肝癌诊断的准确性。此外，前瞻性研究表明，伴有外周血DNA P53基因249位密码子突变的肝脏硬化病人，在两年内发生肝细胞肝癌的机率大大高于无外周血DNA P53基因249位密码子突变的肝硬化病人，因此外周血DNA的P53基因249位密码子突变可能作为发生肝细胞肝癌的诊断和预测指标。
P53基因位于人17号染色体短臂上，全长16-20Kb，共有11个外显子和10个内含子，其中第7外显子的249位密码子是最常见的肝癌相关P53基因突变位置，在我国占肝癌患者p53突变的80％以上。尽管其突变在理论上可能发生在三个碱基中的任意一个或者几个，但大量的研究证实，对于肝癌的P53突变，绝大多数的突变集中于少数几种单碱基突变(SNP)类型上。
传统的P53基因突变研究主要通过PCR-SSCP(聚合酶链反应--单链构相多态性)进行研究，并需通过酶切和测序进行验证，利用这些方法，目前已有大量研究对我国肝细胞肝癌常见的P53基因突变类型进行了详尽的分析和统计。尽管PCR-SSCP已在科研领域应用于P53基因突变的分析，但其步骤繁琐，费时费力，其较高的成本和昂贵的仪器设备也是许多中小型实验室所无法承担的。因此，有必要在上述现有技术的基础上，提供新的用于鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。
发明内容
本发明的目的即是提供一种鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。
本发明方法的基本思路是选取肝癌常见的P53基因249位密码子突变，利用特异性引物扩增方法对P53基因249位密码子上的多个SNP位点进行复合扩增。
此处，所说的特异性引物PCR方法是在SNP的突变位置上，设计两条特异性的正向PCR扩增引物，每一条引物仅能针对一种突变(野生型和突变型)进行扩增，同时，设计一条公共的反向PCR扩增引物。当利用这三条引物进行PCR反应时，不同特异性正向引物分别与反向引物共同作用后的PCR产物大小有差异(我们设计的试剂盒中的大小差异为2bp)，从而可以通过电泳检测时进行分型。
具体来说，本发明的一种鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒由分离包装的引物混合物、PCR反应液和分子量标记物组成，其特征是所述引物混合物是由公共顺向引物、野生型特异性引物、7476/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物共同组成，其中，野生型特异性引物的序列为5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`7476/T突变型引物的序列为5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`746G/T突变型引物的序列为5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`745A/G突变型引物的序列为5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`公共顺向引物的序列为5`-TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`在所述引物混合物中，各引物之间的重量比如下公共顺向引物∶745A/G突变型引物∶746G/T突变型引物∶747G/T突变型引物∶野生型特异性引物＝1∶0.82∶0.93∶1.14∶0.89；所述分子量标记物按以下方式制取通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到所述野生型引物和747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物的四种PCR产物，经过测序验证其片段大小分别为99，97，95，93bp，将以上四种PCR产物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量标记物。
在通过本发明的试剂盒所得到的反应体系中，可以对P53基因249位密码子上的三种SNP同时进行检测，即对P53基因上3种SNP同时进行扩增。根据前述的原理，我们可以得知，对一种SNP扩增需要3条引物，即2条特异性的正向引物，1条反向的公共引物，理论上3种SNP共需要9条引物。但是由于我们本试剂盒所检测的3个P53基因的SNP在相邻的位置上，同时位于249密码子上，它们具有共同的野生型特异性引物和三条不同的特异性的突变型引物，因此本试剂盒共设计有5条引物，即3条特异性突变型引物(745A/G突变型、746G/T突变型、747G/T突变型)、1条野生型特异性引物和1条公共的反向引物。在此情形下，它们中的任何一条特异性的正向引物与公共的反向引物进行PCR反应之后的PCR产物大小均有差异，从而可以通过电泳技术进行分离检测，并通过不同的电泳产物判断不同的基因型。
在本发明中，扩增引物的设计是极为关键的，其设计需要考虑以下三个要素①、特异性引物必须设计在突变点上，同时多条特异性之间必须能够共存，彼此之间不会发生类似引物二聚体反应等。②、选取适当的引物长度，18～24个碱基构成的寡核苷酸链是比较优化的引物长度；③、选取引物中碱基GC的含量和引物的退火温度Tm必须相似。但是，并不是简单地满足上述三个要素的引物对就能够充当本发明中所说的扩增引物对。虽然，从理论上讲，这些引物对可以按一定的原理进行设计并得出，但在实践中可以发现，依据引物设计原理所设计出的引物能够实际应用且能取得较佳效果的并不多。也就是说，真正能够实际应用的“引物对”必须经过大量的、艰苦的试验才能得到，这是一个对引物的优选过程。基于上述三个要素的限制，我们曾经设计出了数十对引物，经过实验优选后再筛出其中5条应用于本发明的试剂盒。
我们之所以强调引物的设计是本发明的技术难点，是因为其难度在于引物设计的局限性较大。本发明中的突变点一侧的引物设计受限，其3’端必须紧邻突变位置，而其长度方面又不能覆盖其他突变点，同时还需要在5’端设计不同长度的错配碱基以显示差异。因此，5’端引物的设计相对更加重要。在完成本发明的过程中，我们曾研究设计出数十对引物，经过软件初步筛选分析后选择了4条公共引物，2类突变点侧的引物(不包含突变点)。经过实践检验后，又选择了效果最好的作为上述试剂盒中的引物，这也正是本发明的主要技术项献。现略举在完成本发明的过程中所淘汰的其余效果不好的引物如下突变侧aaacacttttcgacatagtgatagcgatggtctggccccttaccaccatccactacaact突变下游侧gcccatcctcaccatcatcacactggaag在本发明中，所说的多重PCR即是在一个PCR反应体系中，设计多对引物进行扩增，这样产生不同长度特异性靶区域片段，经凝胶电泳观察各特异扩增片段，用于鉴定不同扩增片段。同时，由于PCR扩增具有引物的3’端依赖性，如果引物的3’端发生碱基错配，PCR反应就无法正常进行，因而就无法得到扩增产物。利用该原理，如果针对不同的P53基因249密码子突变设计不同长度的上游引物，将突变点设计在引物的3’端，不同特异性引物对应相同的下游引物，则不同的特异性上游引物经扩增后只能得到相应产物，且不同的上游引物对应的PCR产物长度不同，利用电泳分离染色后即可鉴定样本是否存在P53基因249位密码子突变，并能了解是否为我们预先设计的特异性上游引物对应的突变类型。
如前所述，在本发明的试剂盒中，特别设置的引物混合物所扩增的基因为P53基因上+747G/T，+746G/T，+745A/G。其中，野生型特异性引物5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`用于扩增正常的基因，所得扩增产物的长度为99bp；747G/T突变型引物5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`用于扩增异常的基因，所得扩增产物的长度为97bp；746G/T突变型引物5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`用于扩增异常的基因，所得扩增产物的长度为95bp；745A/G突变型引物5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`用于扩增异常的基因，所得扩增产物的长度为93bp；公共顺向引物5`-TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`用于与上述四条引物配对。
因此，就本发明而言，通过上述引物的设置，就可以使扩增出的产物长度不一致，从而能够鉴定样本是否存在P53基因249位密码子突变，并能了解是否为我们预先设计的特异性上游引物对应的突变类型。在此基础上，本发明提供了新的用于鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。
在本发明的试剂盒中，我们通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到所述野生型引物和747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物的四种PCR产物，经过测序验证其片段大小分别为99，97，95，93bp，将以上四种PCR产物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量标记物。该分子量标记物在经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后，可准确分辨上述四种大小的目的片段。
需要特别说明的是，就本发明的试剂盒来说，试剂盒中的PCR反应液可以直接由市售的现有产品充当，如ABI公司生产的TaqMan universal master mixPCR反应液等；但也可以是由分离包装的无MgCl2的PCR体系缓冲液、dNTP、MgCl2(氯化镁)、DNA聚合酶(Taq酶)和DDH2O(双蒸水)组成的PCR反应液。并且，所述引物和反应液之间的用量比例的选取是次要的，即该用量比例的选取并不构成本发明技术方案的必要条件。例如，参照前面的叙述可以发现，当试剂盒中的PCR反应液直接采用市售的现有产品(如ABI公司生产的TaqManuniversal master mix PCR反应液)时，PCR反应液与引物之间的用量比例会因市售产品的不同而有所不同。另外，扩增时使用的扩增仪可以直接采用现有市售的产品，如ABI 9600型扩增仪等。
当然，为了让本试剂盒的使用效果更好，本发明推荐采用如下方案让所述PCR反应液由无MgCl2的PCR体系缓冲液、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶和DDH20组成，当试剂盒中各组份的纯度均以100％计时，各组份的体积比为引物混合物1μL、10×无MgCl2的PCR体系缓冲液1mL、dNTP 1mL、MgCl21mL、DNA聚合酶500U、DDH2O 10mL和分子量标记物500μL。如果试剂盒中的各组份直接采用上述用量，则在通常情况下，所制成的试剂盒可用于进行200～250次PCR反应。
此处，所说的“试剂盒中各组份的纯度均以100％计”是一种理论上的计量方法(实践中当然无法做到各组份的纯度均为100％)，但它可以将不同纯度或浓度的组份均折算成纯度为100％，申请人认为，这种计量方法更便于表述各组份之间的用量比。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
具体实施例方式
实施例本实施例中的试剂盒由分离包装的引物混合物、PCR反应液和分子量标记物组成，其特征是所述引物混合物是由公共顺向引物、野生型特异性引物、747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物共同组成，其中，野生型特异性引物的序列为5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`747G/T突变型引物的序列为5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`746G/T突变型引物的序列为5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`745A/G突变型引物的序列为5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`公共顺向引物的序列为5`TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`在所述引物混合物中，各引物之间的重量比如下公共顺向引物∶745A/G突变型引物∶746G/T突变型引物∶747G/T突变型引物∶野生型特异性引物＝1∶0.82∶0.93∶1.14∶0.89；在本实施例中，所述分子量标记物按以下方式制取通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到所述野生型引物和747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物的四种PCR产物，经过测序验证其片段大小分别为99，97，95，93bp，将以上四种PCR产物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量标记物。
本实施例中的试剂盒是针对200次PCR扩增制作的。同时，为了便于用户使用，本实施例中直接让PCR反应液由无MgCl2的PCR体系缓冲液、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶和DDH20组成，当试剂盒中各组份的纯度均以100％计时，各组份的体积比为引物混合物1μL、10×无MgCl2的PCR体系缓冲液1mL、dNTP 1mL、MgCl21mL、DNA聚合酶500U、DDH2010mL和分子量标记物500μL。
为了进一步说明本实施例中所制作试剂盒的使用方法和使用效果，下面继续说明将上述试剂盒用于鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变时的具体过程及使用效果。
实验步骤1.DNA提取按照常规的DNA提取方法进行DNA提取。
2.目的基因的PCR扩增采用上述试剂盒的试剂和提取的DNA模板构成反应体系，反应体系总体积为37.5μL。其中引物2μL，DNA模板用量2～4ng，dNTP(0.25mM)用量4.0μL，10×无MgCl2的PCR体系缓冲液用量3.75μL，MgCl2(2.25mM)用量2.25μL，DNA聚合酶(1U/μL)用量3U，DDH2O用量22.25μL。
对目的基因P53基因249位密码子上的三种SNP同时进行检测，即对P53基因上3种SNP同时进行扩增。扩增使用ABI 9600型扩增仪，热循环条件为94℃预变性5min，94℃变性30sec，59℃退火45sec，72℃延伸45sec，27个循环，72℃保温7min。
3.外周血DNA的P53基因249位密码子突变分析样本在胶联度5％、胶浓度10％的PAGE凝胶中，经过电压800V电泳50分钟，电泳时PCR产物加入2-5μL(由使用者调整)，分子量标记物在一条泳道单独电泳，加入量2-5μL，样本银染显色后，两个碱基的差别能够清晰的在基因分型结果图中被肉眼分辨。
另外，我们利用该方法对45例成都地区经病理学检查证实为肝细胞肝癌患者的术前外周血DNAP53基因249位密码子突变检测发现17例患者为阳性，其阳性率约为38％，在63例不伴肿瘤的乙肝患者7例阳性，其阳性率约为11％(p＝0.002)。15例术前DNAP53基因249位密码子突变阳性肝癌患者经手术切除肿瘤后随访发现11例患者在术后1年内发现肝内复发或远处转移。而28例术前外周血DNA P53基因249位密码子突变阴性肝癌患者仅6例在术后1年内发生肝内复发或远处转移(73％vs 18％p＝0.001)。通过上述检测结果，可以说明本发明在肝癌患者的诊断上具有一定价值，但其更重要的作用在于预测肝癌患者在手术后肝癌复发转移的风险，以便制定更为优化的术后治疗方案。因此，本专利具有较好的使用效果，从而更好地证明了本发明的实用性和创造性。
本发明所涉及的基因组序列表如下<210>1<211>
<212>DNA<213>人类(homo sapiens)<220>
<221>
<222>(920)...(1019)<400>1acttgtcatg gcgactgtcc agctttgtgc caggagcctc gcaggggttg atgggattgg 60ggttttcccc tcccatgtgc tcaagactgg cgctaaaagt tttgagcttc tcaaaagtct120agagccaccg tccagggagc aggtagctgc tgggctccgg ggacactttg cgttcgggct180gggagcgtgc tttccacgac ggtgacacgc ttccctggat tggcagccag actgccttcc240gggtcactgc catggaggag ccgcagtcag atcctagcgt cgagccccct ctgagtcagg300aaacattttc agacctatgg aaactacttc ctgaaaacaa cgttctgtcc cccttgccgt360cccaagcaat ggatgatttg atgctgtccc cggacgatat tgaacaatgg ttcactgaag420acccaggtcc agatgaagct cccagaatgc cagaggctgc tccccgcgtg gcccctgcac480cagcagctcc tacaccggcg gcccctgcac cagccccctc ctggcccctg tcatcttctg540tcccttccca gaaaacctac cagggcagct acggtttccg tctgggcttc ttgcattctg600ggacagccaa gtctgtgact tgcacgtact cccctgccct caacaagatg ttttgccaac660tggccaagac ctgccctgtg cagctgtggg ttgattccac acccccgccc ggcacccgcg720tccgcgccat ggccatctac aagcagtcac agcacatgac ggaggttgtg aggcgctgcc780cccaccatga gcgctgctca gatagcgatg gtctggcccc tcctcagcat cttatccgag840tggaaggaaa tttgcgtgtg gagtatttgg atgacagaaa cacttttcga catagtgtgg900tggtgcccta tgagccgcct gaggttggct ctgactgtac caccatccac tacaactaca960tgtgtaacag ttcctgcatg ggcggcatga accggaggcc catcctcacc atcatcacac1020tggaagactc cagtggtaat ctactgggac ggaacagctt tgaggtgcgt gtttgtgcct1080gtcctgggag agaccggcgc acagaggaag agaatctccg caagaaaggg gagcctcacc1140acgagctgcc cccagggagc actaagcgag cactgcccaa caacaccagc tcctctcccc1200agccaaagaa gaaaccactg gatggagaat atttcaccct tcagatccgt gggcgtgagc1260gcttcgagat gttccgagag ctgaatgagg ccttggaact caaggatgcc caggctggga1320aggagccagg ggggagcagg gctcactcca gccacctgaa gtccaaaaag ggtcagtcta1380cctcccgcca taaaaaactc atgttcaaga cagaagggcc tgactcagac tgacattctc1440cacttcttgt tccccactga cagcctccca cccccatctc tccctcccct gccattttgg1500gttttgggtc tttgaaccct tgcttgcaat aggtgtgcgt cagaagcacc caggacttcc1560atttgctttg tcccggggct ccactgaaca agttggcctg cactggtgtt ttgttgtggg1620gaggaggatg gggagtagga cataccagct tagattttaa ggtttttact gtgagggatg1680
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权利要求
1.一种鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒，由分离包装的引物混合物、PCR反应液和分子量标记物组成，其特征是所述引物混合物是由公共顺向引物、野生型特异性引物、747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物共同组成，其中，野生型特异性引物的序列为5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`747G/T突变型引物的序列为5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`746G/T突变型引物的序列为5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`745A/G突变型引物的序列为5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`公共顺向引物的序列为5`-TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`在所述引物混合物中，各引物之间的重量比如下公共顺向引物∶745A/G突变型引物∶746G/T突变型引物∶747G/T突变型引物∶野生型特异性引物＝1∶0.82∶0.93∶1.14∶0.89；所述分子量标记物按以下方式制备通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到所述野生型引物和747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物的四种PCR产物，经过测序验证其片段大小分别为99，97，95，93bp，将以上四种PCR产物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量标记物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述PCR反应液由无MgCl2的PCR体系缓冲液、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶和DDH2O组成，当试剂盒中各组份的纯度均以100％计时，各组份的体积比为引物混合物1μL、10×无MgCl2的PCR体系缓冲液1mL、dNTP 1mL、MgCl2 1mL、DNA聚合酶500U、DDH2O 10mL和分子量标记物500μL。
全文摘要
一种鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒，由分离包装的引物混合物、PCR反应液和分子量标记物组成，其特征是所述引物混合物是由公共顺向引物、野生型特异性引物、747G/T突变型引物、746G/T突变型引物、745A/G突变型引物共同组成。本发明通过上述引物的设置，可以使扩增出的产物长度不一致，从而能够鉴定样本是否存在P53基因249位密码子突变，并能了解是否为我们预先设计的特异性上游引物对应的突变类型。进而提供了新的用于鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101067153SQ20071004907
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月11日 优先权日2007年5月11日
发明者魏永刚, 李波, 应斌武, 范红, 王兰兰 申请人:四川大学华西医院