虫草素的合成基因簇的鉴定和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因技术领域，更具体地，本发明涉及蛹虫草代谢产物--虫草素的 合成基因簇的鉴定和应用。
【背景技术】
[0002] 虫草素（cordycepin)，又称作蛹虫草菌素、虫草菌素，化学名：T -脱氧腺苷 C -deoxyadenosine)，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。能够产生虫草素的 真菌仅包括蛹虫草、九州虫草等为数不多的虫草属以及构巢曲霉中，虫草素具有良好的抑 菌效果，在氧化应激（oxidative stress)引起的衰老改善、机体免疫功能的增强调节、抑制 脂肪细胞分化预防肥胖发生、炎症抑制、人体外周血单核细胞生产白细胞介素-10的作用、 抗白血病等方面均发挥着重要的作用，是虫草菌质量的重要评价指标之一。虫草素的化学 结构在许多年前就已经被解析如下：
[0003]
[0004]目前获取虫草素一般通过三条途径：从天然蛹虫草中提取、人工合成和通过生物 工程的方法从北虫草培养液中提取。
[0005] 有报道虫草素能够人工化学合成，但过程复杂、投入巨大且产量极低。天然虫草资 源稀缺，价格昂贵，含量甚微，很难成为提取虫草素的主要原料。因此如何提高蛹虫草中虫 草素的含量并实现虫草素的工业化生产，是目前研究的主要方向。
[0006] 目前国内虽然有较多的企业能生产蛹虫草子实体，由于天然子实体中的虫草素含 量低，大规模提取纯化的效率很低，难以为依据虫草素进行的新药开发及实现产业化提供 原料药的保障。
[0007] 因此，通过生物工程的方法，实现虫草素的高效合成具有重要经济及应用价值。但 是，虫草素在真菌中的合成机理一直不清楚，这成为虫草素的生物工程产业化制备的瓶颈。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供蛹虫草代谢产物--虫草素的合成基因簇的鉴定和应用。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种生产虫草素的方法，所述方法包括：
[0010] (1)将虫草素生物合成相关基因转化宿主细胞；其中，所述的虫草素生物合成相 关基因包括蛹虫草的Cml和Cm2基因，或包括构巢曲霉的Anl和An2基因；
[0011] ⑵培养⑴的宿主细胞，使之生产虫草素。
[0012] 在一个优选例中，所述方法的（1)中，所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫 草的Cml、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的Anl、An2基因和An3基因。
[0013] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是包含或能自体生成3' -AMP的宿主细胞。
[0014] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是真菌；较佳地所述的真菌包括（但不限于）： 虫草属真菌（如蛹虫草（Cordyceps militaris))，曲霉属真菌（如构巢曲霉（Aspergillus nidulans))，绿僵菌属真菌（如罗伯茨绿僵菌（Metarhiziumrobertsii))，酵母属真菌（如 酿酒酵母、毕赤酵母）。
[0015] 在本发明的另一方面，提供一种鉴定的虫草素生物合成基因簇，所述的虫草素生 物合成基因簇包括蛹虫草的Cml和Cm2基因，或包括构巢曲霉的Anl和An2基因。
[0016] 在一个优选例中，所述的虫草素生物合成基因簇包括蛹虫草的Cml、Cm2基因和 Cm3基因，或包括构巢曲霉的Anl、An2基因和An3基因。
[0017] 在另一优选例中，所述的虫草素生物合成基因簇不包括由全基因组构成的基因 簇，也不包括包含Cml和Cm2和/或Cm3基因的整条染色体，也不包括包含Anl和An2和/ 或An3基因的整条染色体。
[0018] 在本发明的另一方面，提供重组载体（包括载体组合），所述的重组载体包括虫 草素生物合成相关基因；所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cml和Cm2和/或 Cm3基因，或包括构巢曲霉的Anl和An2和/或An3基因；附加条件是：所述的Cml和Cm2 和/或Cm3基因位于同一重组载体或位于不同的重组载体上；或所述的Anl和An2和/或 An3基因位于同一重组载体或位于不同的重组载体上。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞中包括所述的虫草素 生物合成相关基因；所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cml和Cm2和/或Cm3 基因；或所述的虫草素生物合成相关基因包括构巢曲霉的Anl和An2和/或An3基因；或包 括所述的虫草素生物合成基因簇。
[0020] 在一个优选例中，所述的宿主细胞是包含或能自体生成3' -AMP的宿主细胞；较佳 地，所述的宿主细胞是真菌；更佳地，所述的真菌包括（但不限于）：虫草属真菌（如蛹虫草 (Cordyceps militaris))，绿僵菌属真菌（如罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii))，曲 霉属真菌（如构巢曲霉（Aspergillus nidulans))，酵母属真菌（如酿酒酵母、毕赤酵母）。
[0021] 在本发明的另一方面，提供所述的虫草素生物合成基因簇或所述的表达载体或所 述的宿主细胞的用途，用于生产虫草素。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种用于生产虫草素的试剂盒，所述的试剂盒中包括： 所述的表达载体或所述的宿主细胞。
[0023] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0024] 图1、蛹虫草和构巢曲霉中潜在虫草素生物合成基因的比较。
[0025] (A)虫草素生物合成基因簇在蛹虫草和构巢曲霉基因组上的组织排列对应关系。
[0026] (B)虫草素生物合成基因簇在蛹虫草和构巢曲霉中的共线性分析。
[0027]
[0028] 图2、蛹虫草野生菌株与cpABC敲除突变株（Λ cpABC)产虫草素的比较。
[0029] (A) SDB发酵液中虫草素的HPLC检测比较。
[0030] (B)HPLC比较检测子实体水提样品中的虫草素。红色峰（箭头标示）为虫草素 峰。
[0031] 图3、HPLC检测酿酒酵母及所有knock-in菌株的发酵液中的虫草素。KI表示 knock-in〇
[0032] 图4、HPLC检测异源表达cpABC突变株中虫草素的合成。
[0033] (A)酿酒酵母表达cpABC突变株与对照菌株SC发酵液中虫草素的检测。
[0034] (B)罗伯茨绿僵菌表达cpABC突变株与野生菌株SDB发酵液中虫草素的检测。红 色峰（箭头标示）为虫草素峰。
[0035] 图5、HPLC检测蛹虫草野生株和突变株中的虫草素。
[0036] ㈧对发酵液中虫草素的检测比较。红色峰（箭头标示）为虫草素峰。
[0037] (B)对子实体水提样品中虫草素的检测比较。ko表示knock-out。
[0038] 图6、HPLC检测构巢曲霉野生菌株与突变株发酵液中的虫草素。红色峰为虫草素 峰。
[0039] 图7、蛹虫草中cpC基因的单敲除对虫草素产量的影响。
[0040] 图8、虫草素生物合成代谢途径。
【具体实施方式】
[0041] 本发明人经过深入的研究，首次找到了虫草素生物合成的相关基因，包括Cml和 Cm2和/或Cm3,对应构巢曲霉中的同源基因分别是An 1、Αη2和/或An3。基于上述新发现， 本发明揭示一种能够实现高效的虫草素生物合成的方法。
[0042] 如本文所用，所述的"异源"是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之 间的关系，获知来自不同来源的蛋白（或核酸）与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与 宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对 于其所插入的细胞或生物体来说是"异源的"。
[0043] 如本文所用，所述的"虫草素生物合成相关基因"是指用于在真菌中生物合成虫草 素所需要的基因的组合，包括"虫草素生物合成基因簇"。所述的虫草素生物合成相关基因 包括蛹虫草的Cml和Cm2基因，或包括构巢曲霉的Anl和An2基因；更佳地，所述的虫草素 生物合成相关基因包括蛹虫草的Cml、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的Anl、An2基 因和An3基因。
[0044] 如本文所用，所述的"宿主细胞"包括在转化入本发明的虫草素生物合成相关基因 后，能够生物合成虫草素的细胞的总和；可以包括原核细胞和真核细胞。较佳地，所述的宿 主细胞是真菌细胞、原核细胞或植物细胞。更佳地，所述的宿主细胞是真菌。更佳地，所述的 真菌包括（但不限于）：虫草属真菌（如蛹虫草（Cordyceps militaris)),曲霉属真菌（如 构巢曲霉（Aspergillus nidulans))，绿僵菌属真菌（如绿僵菌），酵母属真菌（如酿酒酵 母、毕赤酵母）。
[0045] 如本文所用，所述的cpA指代Cml或Anl, cpB指代Cm2或An2，cpC指代Cm3或 An3, cpD 指代 Cm4 或 An4。
[0046] 虫草素生物合成相关基因
[0047] 所述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cml和Cm2基因；较 佳地，还包括蛹虫草的Cm3基因。上述的三个基因编码相关的代谢酶类，其 中Cml编码氧化还原酶（oxidordeuctase)、Cm2编码金属离子依赖的磷酸水解 酶（Metaldependent phosphohydrolase)以及Cm3编码ATP依赖的憐酸转移酶 (ATPphosphoribosyltransferase)。Cml和Cm2基因是宿主细胞生成虫草素的关键性基 因，而Cm3基因则能够更为有效地提供虫草素的产量。所述的Cml具有GenBank登录号 CCM_04436所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码具有CCM_04436所编码的蛋白 同样的功能的蛋白的序列、所述的Cm2具有GenBank登录号CCM_04437所示的序列相同的 序列或其简并序列或也能编码具有CCM_04437所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列、所 述的Cm3具有GenBank登录号CCM_04438所示的序列相同的序列或其简并序列或也能编码 具有CCM_04438所编码的蛋白同样的功能的蛋白的序列。
[0048] 所述的虫草素生物合成相关基因包括构巢曲霉的Anl和An2基因；较佳地，还包括 构巢曲霉的An3基因。其中Anl编码氧化还原酶（oxidordeuctase)、An2编码金属离子依 赖的磷酸水解酶（Metal dependent phosphohydrolase)以及An3编码ATP依赖的磷酸转 移酶（ATP phosphoribosyltransferase)。Anl和An2基因是宿主细胞生成虫草素的关