s militaris) (CM01菌株）的基因组为模板，分别使用引 物 cpA-ScF/cpA-ScR、cpB-ScF/cpB-ScR、cpC-ScF/cpC-ScR (表 2)经 PCR 扩增出三个 酶基因的cDNA序列，并分别连接构建于表达质粒pYES2-Trp 1的KpnI/EcoRI位点、 pYES2-Leu2 的 Hindlll/Xbal 位点和 pYES2 的 KpnI/Xbal 位点，分别获得 pYES2-Trpl-cpA、 pYES2-Leu2-CpB和pYES2-cpC诱导表达质粒。同时为便于后续的表达验证，本发明人在每 个基因的C端连接了 6 XHis标签。
[0222] 分别或同时转入酵母酵母 INVScl 菌株（Genotype :MATa his3 Δ 1 leu2trpl_289 ura3_52/MAT a his3 Δ 1 leu2 trpl-289 ura3_52 ;Phenotype :His_，Leu-，Trp-，Ura_)(购 自Invitrogen)，经营养缺陷筛选后，本发明人分别得到了同时表达了三个酶的转化子KI cpABC，同时表达了 cpA和cpB的转化子ΚΙ cpAB，同时表达了 cpB和cpC的转化子ΚΙ cpBC 以及分别单独表达cpA，cpB，cpC的转化子KI cpA，KI cpB，KI cpC。
[0223] 将转化子菌株与转入空载质粒的INVScl菌株KI vector在SC液体选择培养基上 诱导表达后，对发酵液进行HPLC检测，结果发现只有同时表达cpA和cpB的转化子菌株（KI cpABC和KI cpAB)相对于仅转入了一个空载质粒的酵母突变株或其他转化子菌株，在标准 虫草素的位置多出了一个峰（图3)。LC-MS结果证实了该峰的分子量大小与虫草素标准样 品的分子量大小一致，该峰即是虫草素的峰。
[0224] 单独表达基因cpA (图3 KI cpA)或cpB (图3 KI cpB)的突变株均不能产生虫草 素，只有两个基因同时诱导表达才能合成虫草素（图3 KI cpAB)。
[0225] 以上结果说明，cpA和cpB对于虫草素的合成是十分必要的两个基因，而且需要协 同作用才能产生虫草素。
[0226] HPLC检测比较发现，表达虫草素基因簇的酿酒酵母转化子（图4A下）与罗伯茨绿 僵菌转化子（图4B下）在标准虫草素的位置分别多出了一个峰。LC-MS结果证实了该峰的 分子量大小与虫草素标准样品的分子量大小一致，该峰即是虫草素的峰，进一步证明了三 个基因负责虫草素的生物合成。
[0227] 实施例4、蛹虫草中针对cpA、cpB和cpC的单敲除或双敲除试验
[0228] 为进一步明确虫草素合成基因簇各基因在虫草素合成中的作用，本发明人在蛹虫 草（CM01菌株）基因组中分别对cpA、 CpB、cpC基因进行了单敲除以及双敲除。为了实现敲 除，涉及的载体构建以及转化方法与实施例2中"在蛹虫草菌株基因组中同时敲除三个酶 基因cpA、cpB和cpC"的方法相同，鉴于需要敲除的区段不同而仅扩增引物不同（表2) :
[0229] 进行cpA基因单敲除上下游同源臂的扩增引物分别为cpA-Uf/cpA-Ur、cpA-Df/ cpA-Dr，以引物cpA-F/cpA-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
[0230] 进行cpB基因单敲除上下游同源臂的扩增引物分别为cpB-Uf/cpB-Ur、cpB-Df/ cpB-Dr，以引物cpB-F/cpB-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
[0231] 进行cpC基因单敲除上下游同源臂的扩增引物分别为cpC-Uf/cpC-Ur、cpC-Df/ cpC-Dr，以引物cpC-F/cpC-R验证敲除阳性株。采用的marker基因同为草胺磷抗性基因。
[0232] 进行cpA、cpB两个基因共敲除的上下游同源臂的扩增引物分别为cpAB-Uf/ cpAB-Ur，cpAB-Df/cpAB-Dr，以引物cpAB-F/cpAB-R验证敲除阳性株。采用的marker基因 同为草胺磷抗性基因。
[0233] 进行cpC、cpB两个基因共敲除的上下游同源臂的扩增引物分别为cpBC-Uf / cpBC-Ur，cpAB-Df/cpAB-Dr，以引物cpBC-F/cpBC-R验证敲除阳性株。采用的marker基因 同为草胺磷抗性基因。
[0234] 针对野生型蛹虫草菌株，利用农杆菌进行转化，获得阳性转化子。
[0235] 对阳性敲除菌株分别进行HPLC检测。结果表明，只要涉及cpA或cpB基因的敲除 突变子均无法产生虫草素（图5)。
[0236] cpC基因虽然不直接参与虫草素的合成，但伴随着cpC基因的缺失，虫草素的产量 有所降低（图7)，提示cpC通过其他途径来影响虫草素的产生。
[0237] 实施例5、构巢曲霉中针对cpA、cpB的双敲除试验
[0238] 本发明人将构巢曲霉中对应cpA和cpB基因的敲除片段（基因Anl和An2)同样 进行了双敲除。
[0239] 1、获得融合敲除片段
[0240] 采用融合PCR的方法，其原理及引物设计参见文献：Szewczyk E等（2006)，Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc.1 (6):3111-3120)〇 (1)扩增同源臂和marker基因：以野生菌株真菌构巢曲霉（A. nidulans)A4(Glasgow野 生型（veA+);购自 Fungal Genetics Stock Center，http://www.fgsc.net/)基因组 DNA(lO-lOOng)为模板，使用引物Anl2-Uf/Anl2-Ur扩增出上游同源臂片段，使用引物 Anl2-Df/Anl2-Dr扩增出下游同源臂片段；以含有pyrG基因的质粒pXDRFP4(l-10ng)为模 板，使用引物Anl2-Gf/Anl2-Gr扩增出marker基因片段（具体引物序列见表2)。（2)上下 游同源臂与中间的marker基因融合：将上一步的PCR产物切胶回收目标片段（没有杂带时 可以直接进行PCR产物纯化回收），用Nanodrop测定回收产物的浓度。取少量回收片段，按 左同源臂：marker :右同源臂摩尔比1:2:1混合作为模板，使用引物Anl2-Wf/Anl2-Wr (具 体引物序列见表2)进行PCR扩增出融合敲除片段。
[0241] 2、敲除转化
[0242] 融合敲除片段用于原生质体转化（见前述2. 3和2. 4)。获得阳性转化子为发生基 因敲除的菌株。
[0243] 经HPLC检测结果表明，敲除Anl和An2的突变子无法产生虫草素（图6)。
[0244] 总结
[0245] 基于上述不同基因的功能解析，本发明人得出虫草素的生物合成途径（图 8)，即腺苷在特异的蛋白激酶作用下被磷酸化生成3' -AMP，当然3' -AMP也可由 2'，3' -cAMP-adenosine代谢通路中的3' -磷酸二酯酶对2'，3' -cAMP作用产生。所得 3' -AMP在cpB的作用下去磷酸化，得到一个不稳定的烯醇化合物，该化合物自发异构形成 羰基，在cpA还原酶的作用下负责将羰基还原成羟基，生成虫草素。
[0246] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种生产虫草素的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 将虫草素生物合成相关基因转化宿主细胞；其中，所述的虫草素生物合成相关基 因包括蛹虫草的Cml和Cm2基因，或包括构巢曲霉的Anl和An2基因； (2) 培养（1)的宿主细胞，使之生产虫草素。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，（1)中，所述的虫草素生物合成相关基因包 括蛹虫草的Cml、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的Anl、An2基因和An3基因。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是包含3'-AMP或能自体生 成3' -AMP的宿主细胞。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是真菌；较佳地所述的真菌 包括：虫草属真菌，曲霉属真菌，绿僵菌属真菌，酵母属真菌。5. -种分离的虫草素生物合成基因簇，其特征在于，所述的虫草素生物合成基因簇包 括蛹虫草的Cml和Cm2基因，或包括构巢曲霉的Anl和An2基因。6. 如权利要求5所述的分离的虫草素生物合成基因簇，其特征在于，所述的虫草素生 物合成基因簇包括蛹虫草的Cml、Cm2基因和Cm3基因，或包括构巢曲霉的Anl、An2基因和 An3基因。7. 重组载体，其特征在于，所述的重组载体包括虫草素生物合成相关基因；所述的虫 草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cml和Cm2和/或Cm3基因；或所述的虫草素生物合 成相关基因包括构巢曲霉的Anl和An2和/或An3基因。8. -种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包括虫草素生物合成相关基因；所 述的虫草素生物合成相关基因包括蛹虫草的Cml和Cm2和/或Cm3基因，或包括构巢曲霉 的Anl和An2和/或An3基因。9. 如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是包含3'-AMP或能自 体生成3' -AMP的宿主细胞；较佳地，所述的宿主细胞是真菌；更佳地，所述的真菌包括：虫 草属真菌，绿僵菌属真菌，曲霉属真菌，酵母属真菌。10. 权利要求5或6所述的虫草素生物合成基因簇或权利要求7所述的表达载体或权 利要求8-9任一所述的宿主细胞的用途，用于生产虫草素。11. 一种用于生产虫草素的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括： 权利要求7所述的表达载体或权利要求8-9任一所述的宿主细胞。
【专利摘要】本发明涉及蛹虫草代谢产物——虫草素的合成基因簇的鉴定和应用。首次找到了虫草素生物合成的基因簇，该基因簇包括Cm1和Cm2和/或Cm3，对应构巢曲霉中的同源基因分别是An1、An2和/或An3。基于上述新发现，本发明揭示一种能够实现高效的虫草素生物合成的方法。
【IPC分类】C12N15/31, C12N15/63, C12P19/40
【公开号】CN105441517
【申请号】CN201410425608
【发明人】王成树, 夏永亮, 商艳芳
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月26日
【公告号】WO2016029802A1