一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法，该方法为：通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定；通过采用杜氏管发酵法、采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35℃下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定；通过酵母菌4-4A总DNA的提取、rDNA-ITS区域PCR扩增、PCR产物回收纯化、产物连接转化、阳性克隆检测、ITS片段测序及分析，实现ITS序列的分析；制备方法为：酵母4-4A的富集培养；酵母4-4A液体剂型的制备；酵母制剂中活菌数的测定。本发明的采用发病率和严重度分别下降64%～67%和89%～90%，将生防酵母与低剂量的农药配合使用，提高防治效果。
【专利说明】一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于芒果炭疽病防治【技术领域】，尤其涉及一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，炭疽病在采前和采后危害芒果，造成很大的产量和品质损失，是芒果生产上的重要病害之一，其病原菌主要为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides (Penz)Penz.&Sacc.)。长期以来，该病害的田间防治主要依赖化学杀菌剂，随着苯并咪唑类化学药剂的长期大量使用，胶孢炭疽菌已经对该类杀菌剂产生了抗药性，使得防效下降。病原菌的潜伏侵染会造成芒果在采后流通过程中的大量损失，采后炭疽病的防治也需要化学药剂，随着人们对环境保护和食品安全越来越重视，研发更加安全、环保的芒果炭疽病采前采后防治新技术，如生物防治，显得更加迫切。
【发明内容】
[0003]本发明实施例的目的在于提供一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法，旨在解决现有的芒果炭疽病防治使用化学杀菌剂提高了病菌的抗药性，不利于环境的保护和食品安全性的问题。
[0004]本发明实施例是这样实现的，本发明实施例的酵母菌分离、筛选的方法，该酵母菌分离、筛选的方法包括以下步骤:
[0005]步骤一、通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定；
[0006]步骤二、通过采用杜氏管发酵法、碳源同化采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35°C下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定；
[0007]步骤三、通过酵母菌4-4A总DNA的提取、rDNA-1TS区域PCR扩增、PCR产物回收纯化、产物连接转化、阳性克隆检测、ITS片段测序及分析，实现ITS序列的分析。
[0008]进一步，步骤一的具体方法如下:
[0009]第一步，酵母宏观培养特征
[0010]先将酵母菌接在NYDA斜面上，25°C培养2天~3天活化，然后取菌体I环接入含40mlNYDB液体培养基的100ml三角瓶中，25°C恒温静置培养3天；
[0011]第二步，酵母菌落形态观察 [0012]将菌株活化培养2天~3天后，取一环接于NYDB培养基中，28°C振荡培养24小时，稀释后涂平板于NYDA固体培养基，28°C培养3天；
[0013]第三步，假菌丝的形成
[0014]将倒好的PDA平板倒置1天~2天使其表面干燥，用活化好的酵母划线接种2条~3条，盖上灭菌的盖玻片，28°C下培养5天后取盖玻片观察划线两旁假菌丝形成情况及形态；
[0015]第四步，酵母菌子囊孢子的观察
[0016]将已活化的酵母菌株接种至Gorodkowa琼脂培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、PDA培养基，25°C培养3天，镜检子囊孢子形成情况，凡未见孢子的时间延长至4周~6周，每周检查子囊孢子出现情况；
[0017]第五步，掷孢子镜检
[0018]将倒好的PDA平板放置2天，然后将酵母菌株沿垂直直径方向划线接种，倒置放于另一个PDA平板上，放置一个无菌载玻片，将紧扣的两个培养皿置于25°C培养三周，取出载玻片观察载玻片上的孢子。 [0019]进一步，在步骤二中，生理生化指标测定具体方法如下:
[0020]第一步，糖发酵
[0021]将需要测试的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8种糖用蒸馏水配成质量分数20%的母液，细菌过滤器过滤后放在4°C冰箱内备用；
[0022]采用杜氏管发酵法，取口径12mm的试管，每管加入7.2ml黄豆芽汁，将杜氏管倒置于大试管中包扎后121°C灭菌20min备用；分别于每支试管内注入20%的糖母液0.8ml，并使小管内外的糖扩散均匀，再将酵母分别接种于含糖试管中，28°C静置培养7天后观察；凡不产气的试管可延长培养至10天再观察，杜氏管内有气泡计为阳性，无气泡计为阴性；
[0023]第二步，碳源同化
[0024]采用液体培养法，在含0.5%碳源的基础培养基中，接入酵母种子液，浓度达到IO4个/ml，以加入葡萄糖的基础培养液为对照，28°C振荡培养，观察生长情况；
[0025]第三步，氮源同化
[0026]挑取底部较平整的灭菌培养皿，取20ml无氮源固体基础培养基熔化，冷却到50°C后注入酵母菌悬液Iml摇匀；待培养基凝固后，28°C倒置5小时；然后添加氮源并在培养皿底部标记氮源名称，28°C培养2天，观察酵母菌的生长情况，接种前，酵母菌需在无氮源基础培养基中进行饥饿培养；
[0027]第四步，35°C下生长情况
[0028]将活化的酵母菌株划线接种于NYDA斜面，35°C下培养3天~4天后观察生长情况；
[0029]第五步，致死温度
[0030]将NYDB液体培养基装入口径12_的试管中，每管4ml ;再加入酵母菌液1ml，水浴加热，温度上升到预定值时计时IOmin ;28°C过夜后涂板确定酵母是否全部死亡；从30°〇开始，5°C为梯度递增，直到酵母全部死亡的温度，然后从上一个温度以1°C递增即可；
[0031]第六步，耐乙醇能力
[0032]向试管中加入NYDB液体培养基和无水乙醇，先加NYDB灭菌后再加无水乙醇；将酵母菌株的培养物稀释后取Iml加入上述培养基中，28°C培养3天~5天，在600nm下测定OD值；
[0033]第七步，生长曲线测定
[0034]采用NYDB液体培养基，将酵母菌株活化，取两环接种于50ml种子培养基中，28°C培养24小时，取Iml种子液接入发酵培养基中，接入的体积比为50ml/250ml，28°C，200r/min摇床培养，每2小时取样稀释20倍后在600nm吸光度下测定其OD值，根据时间和菌液浓度绘制酵母的生长曲线图。
[0035]进一步，在步骤三中，ITS序列分析的具体方法如下:
[0036]第一步，酵母菌4-4A总DNA的提取
[0037]使用TaKaRa的酵母基因组DNA提取试剂盒提取，取新鲜培养的含有I~2X IO8酵母菌的培养液至1.5ml离心管中，12000r/min离心Imin,除去上清，向沉淀中加入500 μ I的GenTLEYesatSolrtionA ;振荡充分悬浮沉淀，于37°C温浴I小时，期间振荡，后加入 100 μ I 的 GenTLEYesatSolrtionB,振荡后于 70°C 温浴 IOmin ;加入 200 μ I 的GenTLEYesatSolrtionC ;振荡后冰上冷却5min, 12000r/min, 4°C离心5min,将上清移入新的离心管中，加入上清液1/2体积的异丙醇，混匀；12000r/min，4°C离心5min ;向沉淀中加Λ 500 μ I预冷的70%的乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，12000r/min，4°C离心5min ;用移液器尽量除净上清液，室温下自然干燥，后加入40 μ ITEbuffer溶解基因组DNA ；
[0038]以DL2000为DNAMaker，上样量4 μ 1，用1%琼脂糖凝胶电泳40minl00V后检测DNA ；
[0039]第二步，rDNA-1TS区域 PCR 扩增
[0040]PCR 扩 ±曾引物 ITSl: 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '；ITS4:5/ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';反应体系如下:
[0041]PCR 反应程序为:95°C预变性 3min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，反应共30个循环；72°C延伸10min，4°C保温；
[0042]反应完成后，以DL2000为DNAMaker，上样量5 μ I，用1%琼脂糖凝胶电泳40minl00V 后检测 DNA ；
[0043]第三步，PCR产物回收纯化，利用DNA回收试剂盒进行PCR产物纯化，方法如下:
[0044]I)切取含有目的片段的琼脂糖凝胶后放入1.5mlEppendorf管；
[0045]2)加入400 μ IBufferGM,室温15°C~25°C融化胶块，振荡混合，使胶彻底融化；
[0046]3)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，将(2)中的溶液移至SpinColumn 中，12000r/min 离心 Imin ；
[0047]4)将收集管中的液体重新上柱，12000r/min室温离心Imin ；
[0048]5)将 700 μ I 的 BufferffB 加入 SpinColumn 中，室温 12000r/min 离心 30s,弃滤液；
[0049]6)重复 5);
[0050]7)将 SpinColumn 安置于 CollectionTube 上，室温 12000r/min 离心 Imin ；
[0051]8)将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn的膜中央加入30 μ I的灭菌水,室温静置Imin ；
[0052]9) 12000r/min室温离心Imin后收集离心管中的液体，即为回收的DNA片段，立即使用或保存于_20°C冰箱备用；
[0053]第四步，产物连接转化，在0.5ml离心管中按以下连接体系加入各物质，混匀后在低温水浴锅中16 °C过夜连接；
[0054]取大肠杆菌感受态细胞100 μ I及连接产物5 μ I加入1.5ml离心管中，混匀后冰上放置3分钟；42°C热激90秒，置于冰上3分钟~5分钟；加入ImlLB液体培养基，于37°C下180r/min培养2小时；取100 μ I大肠杆菌涂皿，LB培养基中加入100 μ 120mg/ml的氨苄青霉素；37°C下培养16小时~24小时后观察菌落，白色菌落为重组子；
[0055]第五步，阳性克隆检测
[0056]随机挑取上述白色菌落5个~10个，接种于加有ImlLB液体培养基的Eppendorf管中，于37°C下180r/min培养12小时；取I μ I菌液作模板用同一引物在相同反应条件下进行PCR扩增，将产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测；
[0057]第六步，ITS片段测序及分析，将回收纯化后的产物测序，测序结果与GenBank中的核酸数据库进行同源性比对。
[0058]本发明实施例的另一目的在于提供一种酵母菌生防菌剂的制备方法，该酵母菌生防菌剂的制备方法步骤如下:
[0059]步骤一、酵母4-4Α的富集培养；
[0060]步骤二、酵母4-4Α液体剂型的制备；
[0061]步骤三、酵母制剂中活菌数的测定。
[0062]进一步，酵母4-4Α的富集培养的方法如下:[0063]先采用NYDB液体培养基，将酵母菌株4-4Α活化后，取两环接种于50ml种子培养基中，28°C培养24小时，取100 μ I种子液接入发酵培养基中，28°C下，200r/min摇床培养48小时；
[0064]发酵培养基按下述比例配制:牛肉膏8g/L，酵母浸膏5g/L，海藻糖10g/L，121°C,灭菌20分钟。
[0065]进一步，酵母4-4A液体剂型的制备的方法如下:
[0066]将培养好的酵母发酵液装入50ml离心管中，4000r/min离心15分钟，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得的沉淀加入0.05mol/L的磷酸缓冲液制成菌悬液，使酵母的浓度为 lX109CFU/ml，备用；
[0067]选用蔗糖，半乳糖，海藻糖作为保护剂，用磷酸缓冲液配制溶液，溶液中Vc的浓度为 0.01% ；
[0068]取上述溶液各21.6ml，加入109CFU/ml的酵母母液2.4ml，混匀，分装到1.5ml的离心管中，每管Iml，将每种保护剂所分装的24管分为四组保存到_20°C，4°C，10°C，25°C中。
[0069]进一步，酵母制剂中活菌数的测定的方法如下:
[0070]制剂中初始的活菌数通过系列稀释涂板确定，25°C保存的制剂每10天取一管测定活菌数，一 20°C，4°C，10°C每月取样测定活菌数，统计制剂中酵母的存活率。
[0071]本发明提供的酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法，通过酵母菌分离、筛选，酵母4-4A的富集培养，酵母4-4A液体剂型的制备，酵母制剂中活菌数的测定制备的酵母菌液体生防菌剂，从开花期开始每月喷施一次可以有效减少芒果采后炭疽病的发生率，在初花期至采收期施用4次~6次防治芒果炭疽病，发病率和严重度分别下降了 64%~67%和89%~90%，另外，可以将生防酵母与低剂量的农药配合使用，提高对病害的防治效果O
【专利附图】
【附图说明】
[0072]图1是本发明实施例提供的酵母菌分离、筛选的方法的流程图；[0073]图2是本发明实施例提供的酵母菌生防菌剂的制备方法流程图；
[0074]图3是本发明实施例提供的海藻糖作为保护剂液体剂型中酵母的存活率示意图；
[0075]图4是本发明实施例提供的半乳糖作保护剂液体剂型中酵母的存活率示意图；
[0076]图5是本发明实施例提供的酵母在缓冲液和水中的存活率示意图。
【具体实施方式】
[0077]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0078]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0079]如图1所示，本发明实施例的酵母菌分离、筛选的方法包括以下步骤:
[0080]SlOl:通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定；
[0081]S102:通过采用杜氏管发酵法、碳源同化采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35°C下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定;
[0082] S103:通过酵母菌4-4A总DNA的提取、rDNA-1TS区域PCR扩增、PCR产物回收纯化、产物连接转化、阳性克隆检测、ITS片段测序及分析，实现ITS序列的分析。
[0083]本发明的具体步骤为:
[0084]步骤一、通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定；
[0085]第一步，酵母宏观培养特征
[0086]先将酵母菌接在NYDA斜面上，25°C培养2天~3天活化，然后取菌体I环接入含40ml NYDB液体培养基的100ml三角瓶中，25°C恒温静置培养3天；
[0087]第二步，酵母菌落形态观察
[0088]将菌株活化培养2天~3天后，取一环接于NYDB培养基中，28°C振荡培养24小时，稀释后涂平板于NYDA固体培养基，28°C培养3天；
[0089]第三步，假菌丝的形成
[0090]将倒好的PDA平板倒置I天~2天使其表面干燥，用活化好的酵母划线接种2条~3条，盖上灭菌的盖玻片，28°C下培养5天后取盖玻片观察划线两旁假菌丝形成情况及形态；
[0091]第四步，酵母菌子囊孢子的观察
[0092]将已活化的酵母菌株接种至Goro&owa琼脂培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、PDA培养基，25°C培养3天，镜检子囊孢子形成情况，凡未见孢子的时间延长至4周~6周，每周检查子囊孢子出现情况；
[0093]第五步，掷孢子镜检
[0094]将倒好的PDA平板放置2天，然后将酵母菌株沿垂直直径方向划线接种，倒置放于另一个PDA平板上，放置一个无菌载玻片，将紧扣的两个培养皿置于25°C培养三周，取出载玻片观察载玻片上的孢子。[0095]步骤二、通过采用杜氏管发酵法、碳源同化采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35°C下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定；
[0096]第一步，糖发酵
[0097]将需要测试的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8种糖用蒸馏水配成质量分数20%的母液，细菌过滤器过滤后放在4°C冰箱内备用；
[0098]采用杜氏管发酵法，取口径12mm的试管，每管加入7.2ml黄豆芽汁，将杜氏管倒置于大试管中包扎后121°C灭菌20min备用；分别于每支试管内注入20%的糖母液0.8ml，并使小管内外的糖扩散均匀，再将酵母分别接种于含糖试管中，28°C静置培养7天后观察；凡不产气的试管可延长培养至10天再观察，杜氏管内有气泡计为阳性，无气泡计为阴性；
[0099]第二步，碳源同化
[0100]采用液体培养法，在含0.5%碳源的基础培养基中，接入酵母种子液，浓度达到IO4个/ml，以加入葡萄糖的基础培养液为对照，28°C振荡培养，观察生长情况；
[0101]第三步，氮源同化
[0102]挑取底部较平整的灭菌培养皿，取20ml无氮源固体基础培养基熔化，冷却到50°C后注入酵母菌悬液Iml摇匀；待培养基凝固后，28°C倒置5小时；然后添加氮源并在培养皿底部标记氮源名称，28°C培养2天，观察酵母菌的生长情况，接种前，酵母菌需在无氮源基础培养基中进行饥饿培养；
[0103]第四步，35°C下生长情况
[0104]将活化的酵母菌株 划线接种于NYDA斜面，35°C下培养3天~4天后观察生长情况；
[0105]第五步，致死温度
[0106]将NYDB液体培养基装入口径12mm的试管中，每管4ml ;再加入酵母菌液1ml，水浴加热，温度上升到预定值时计时IOmin ;28°C过夜后涂板确定酵母是否全部死亡；从30°〇开始，5°C为梯度递增，直到酵母全部死亡的温度，然后从上一个温度以1°C递增即可；
[0107]第六步，耐乙醇能力
[0108]按照表1向试管中加入NYDB液体培养基和无水乙醇，先加NYDB灭菌后再加无水乙醇；将酵母菌株的培养物稀释后取Iml加入上述培养基中，28°C培养3-5d，在600nm下测定其OD值；
[0109]表1耐乙醇浓度测试
【权利要求】
1.一种酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，该酵母菌分离、筛选的方法包括以下步骤: 步骤一、通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定； 步骤二、通过采用杜氏管发酵法、碳源同化采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35°C下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定；步骤三、通过酵母菌4-4A总DNA的提取、rDNA-1TS区域PCR扩增、PCR产物回收纯化、产物连接转化、阳性克隆检测、ITS片段测序及分析，实现ITS序列的分析。
2.如权利要求1所述的酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，步骤一的具体方法如下: 第一步，酵母宏观培养特征 先将酵母菌接在NYDA斜面上，25 °C培养2天~3天活化，然后取菌体I环接入含40mlNYDB液体培养基的100ml三角瓶中，25°C恒温静置培养3天； 第二步，酵母菌落形态观察 将菌株活化培养2天~3天后，取一环接于NYDB培养基中，28°C振荡培养24小时，稀释后涂平板于NYDA固体培养基，28°C培养3天； 第三步，假菌丝的形成 将倒好的PDA平板倒置I天~2天使其表面干燥，用活化好的酵母划线接种2条~3条，盖上灭菌的盖玻片，28°C下培养5天后取盖玻片观察划线两旁假菌丝形成情况及形态；第四步，酵母菌子囊孢子的观察 将已活化的酵母菌株接种至Gorodkowa琼脂培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、PDA培养基，25°C培养3天，镜检子囊孢子形成情况，凡未见孢子的时间延长至4周~6周，每周检查子囊孢子出现情况； 第五步，掷孢子镜检 将倒好的PDA平板放置2天，然后将酵母菌株沿垂直直径方向划线接种，倒置放于另一个PDA平板上，放置一个无菌载玻片，将紧扣的两个培养皿置于25°C培养三周，取出载玻片观察载玻片上的孢子。
3.如权利要求1所述的酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，在步骤二中，生理生化指标测定具体方法如下: 第一步，糖发酵 将需要测试的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8种糖用蒸馏水配成质量分数20%的母液，细菌过滤器过滤后放在4°C冰箱内备用； 采用杜氏管发酵法，取口径12_的试管，每管加入7.2ml黄豆芽汁，将杜氏管倒置于大试管中包扎后121°C灭菌20min备用；分别于每支试管内注入20%的糖母液0.8ml，并使小管内外的糖扩散均匀，再将酵母分别接种于含糖试管中，28°C静置培养7天后观察；凡不产气的试管可延长培养至10天再观察，杜氏管内有气泡计为阳性，无气泡计为阴性； 第二步，碳源同化 采用液体培养法，在含0.5%碳源的基础培养基中，接入酵母种子液，浓度达到IO4个/ml,以加入葡萄糖的基础培养液为对照，28°C振荡培养，观察生长情况；第三步，氮源同化 挑取底部较平整的灭菌培养皿，取20ml无氮源固体基础培养基熔化，冷却到50°C后注入酵母菌悬液Iml摇匀；待培养基凝固后，28°C倒置5小时；然后添加氮源并在培养皿底部标记氮源名称，28°C培养2天，观察酵母菌的生长情况，接种前，酵母菌需在无氮源基础培养基中进行饥饿培养； 第四步，35°C下生长情况 将活化的酵母菌株划线接种于NYDA斜面，35°C下培养3天~4天后观察生长情况； 第五步，致死温度 将NYDB液体培养基装入口径12mm的试管中，每管4ml ;再加入酵母菌液1ml，水浴加热，温度上升到预定值时计时IOmin ;28°C过夜后涂板确定酵母是否全部死亡；从30°〇开始，5°C为梯度递增，直到酵母全部死亡的温度，然后从上一个温度以1°C递增即可； 第六步，耐乙醇能力 向试管中加入NYDB液体 培养基和无水乙醇，先加NYDB灭菌后再加无水乙醇；将酵母菌株的培养物稀释后取Iml加入上述培养基中，28°C培养3天~5天，在600nm下测定OD值；第七步，生长曲线测定 采用NYDB液体培养基，将酵母菌株活化，取两环接种于50ml种子培养基中，28°C培养24小时，取Iml种子液接入发酵培养基中，接入的体积比为50ml/250ml，28°C，200r/min摇床培养，每2小时取样稀释20倍后在600nm吸光度下测定其OD值，根据时间和菌液浓度绘制酵母的生长曲线图。
4.如权利要求1所述的酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，在步骤三中，ITS序列分析的具体方法如下: 第一步，酵母菌4-4A总DNA的提取 使用TaKaRa的酵母基因组DNA提取试剂盒提取，取新鲜培养的含有I~2X108酵母菌的培养液至1.5ml离心管中，12000r/min离心Imin,除去上清，向沉淀中加入500 μ I的GenTLEYesatSolrtionA ;振荡充分悬浮沉淀，于37°C温浴I小时，期间振荡，后加入 100 μ I 的 GenTLEYesatSolrtionB,振荡后于 70°C 温浴 IOmin ;加入 200 μ I 的GenTLEYesatSolrtionC ;振荡后冰上冷却5min, 12000r/min, 4°C离心5min,将上清移入新的离心管中，加入上清液1/2体积的异丙醇，混匀；12000r/min，4°C离心5min ;向沉淀中加Λ 500 μ I预冷的70%的乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，12000r/min，4°C离心5min ;用移液器尽量除净上清液，室温下自然干燥，后加入40 μ ITEbuffer溶解基因组DNA ； 以DL2000为DNAMaker，上样量4 μ 1，用1%琼脂糖凝胶电泳40minl00V后检测DNA ； 第二步，rDNA-1TS区域PCR扩增 PCR 扩 ±曾引 物 ITS 1: 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '；ITS4:5/ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';反应体系如下: PCR反应程序为:95°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，反应共30个循环；72°C延伸10min，4°C保温； 反应完成后，以DL2000为DNAMaker，上样量5 μ 1，用1%琼脂糖凝胶电泳40minl00V后检测DNA ； 第三步，PCR产物回收纯化，利用DNA回收试剂盒进行PCR产物纯化，方法如下:1)切取含有目的片段的琼脂糖凝胶后放入1.5mlEppendorf管； 2)加入400iUBufferGM，室温15°C~25°C融化胶块，振荡混合，使胶彻底融化； 3)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，将(2)中的溶液移至SpinColumn 中，12000r/min 离心 Imin ； 4)将收集管中的液体重新上柱,12000r/min室温离心Imin； 5)将700 u I 的 BufferffB 加入 SpinColumn 中，室温 12000r/min 离心 30s,弃滤液； 6)重复5)； 7)将SpinColumn 安置于 CollectionTube 上，室温 12000r/min 离心 Imin ； 8)将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn的膜中央加入30 y I的灭菌水，室温静置Imin ； 9)12000r/min室温离心Imin后收集离心管中的液体，即为回收的DNA片段，立即使用或保存于_20°C冰箱备用； 第四步，产物连接转化，在0.5ml离心管中按以下连接体系加入各物质，混匀后在低温水浴锅中16 °C过夜连接； 取大肠杆菌感受态细胞100 u I及连接产物5 ill加入1.5ml离心管中，混匀后冰上放置3分钟；42°C热激90秒，置于冰上3分钟~5分钟；加入ImlLB液体培养基，于37°C下180r/min培养2小时；取100 U I大肠杆菌涂皿，LB培养基中加入100 u 120mg/ml的氨苄青霉素；37°C下培养16小时~24小时后观察菌落，白色菌落为重组子； 第五步，阳性克隆检测 随机挑取上述白色菌落5个~10个，接种于加有ImlLB液体培养基的Eppendorf管中，于37°C下180r/min培养12小时；取I yl菌液作模板用同一引物在相同反应条件下进行PCR扩增，将产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测； 第六步，ITS片段测序及分析，将回收纯化后的产物测序，测序结果与GenBank中的核酸数据库进行同源性比对。
5.一种酵母菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，该酵母菌生防菌剂的制备方法步骤如下: 步骤一、酵母4-4A的富集培养； 步骤二、酵母4-4A液体剂型的制备； 步骤三、酵母制剂中活菌数的测定。
6.如权利要求5所述的酵母菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，酵母4-4A的富集培养的方法如下: 先采用NYDB液体培养基，将酵母菌株4-4A活化后，取两环接种于50ml种子培养基中，28°C培养24小时，取100 ill种子液接入发酵培养基中，28°C下，200r/min摇床培养48小时； 发酵培养基按比例配制:牛肉膏8g/L，酵母浸膏5g/L，海藻糖10g/L，121°C，灭菌20分钟。
7.如权利要求5所述的酵母菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，酵母4-4A液体剂型的制备的方法如下: 将培养好的酵母发酵液装入50ml离心管中，4000r/min离心15分钟，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得的沉淀加入0.05mol/L的磷酸缓冲液制成菌悬液，使酵母的浓度为.lX109CFU/ml，备用； 选用蔗糖，半乳糖，海藻糖作为保护剂，用磷酸缓冲液配制溶液，溶液中Vc的浓度为.0.01% ； 取上述溶液各21.6ml，加入109CFU/ml的酵母母液2.4ml，混匀，分装到1.5ml的离心管中，每管Iml，将每种保护剂所分装的24管分为四组保存到_20°C，4°C，10°C，25°C中。
8.如权利要求5所述的酵母菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，酵母制剂中活菌数的测定的方法如下: 制剂中初始的活菌数通过系列稀释涂板确定，25°C保存的制剂每10天取一管测定活菌数，一 20°C，4°C，10 °C每月取样测定活菌数，统计制剂中酵母的存活率。
【文档编号】A01N63/04GK103740807SQ201310547291
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】蒲金基, 张贺, 陈照, 刘晓妹, 漆艳香, 张欣, 喻群芳, 陆英, 谢艺贤 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所