专利名称：一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法及其应用的制作方法
技术领域：
一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法及其应用，涉及一种高密度培养耐热性酪酸菌的方法及其应用，本发明属于微生物制剂技术领域。
背景技术：
酪酸梭状芽孢杆菌又名酪酸菌、丁酸梭菌，iflostridium，以下简称酪酸菌，是存在于人和畜禽肠道中一种厌氧有益菌，在日本等国广泛作为调理人体胃肠功能的整肠药使用。酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢能耐热、耐酸、耐胆汁，是作为饲用益生菌的理想菌株。酪酸菌能产生丁酸、乳酸等，促进双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌的增殖，抑制葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、产气夹膜梭菌等致病菌和腐败菌的生长，能促进肠道微生态平衡，降低胺类、吲哚、硫化氢等有害物质的产生。酪酸菌产生的丁酸是肠上皮细胞修复和再生的主要营养物质，能促进畜禽肠道的发育，强化其各种功能；酪酸菌还能在肠道内产生B族维生素、淀粉酶等代谢产物。通过以上几种方式，酪酸菌及其代谢产物能够促进消化，提高饲料利用率和改善畜禽肉质，促进畜禽健康，增强畜禽免疫力和抗病力。目前，酪酸菌活菌制剂用于饲用微生物添加剂时，存在菌粉活菌含量低，活性保持能力弱，耐热性差不利于饲料加工等问题。微胶囊化技术是将微生物细胞、酶类、抗体及蛋白质包埋在某些天然或有机合成材料内做成的颗粒，内部微生物细胞能在颗粒内部进行增殖和催化反应。人们利用某些聚合物包埋细菌制成微生物接种剂，应用在农业领域，为开发微生物菌剂的新载体探索出了一条新途径。微胶囊化技术的关键是选择适宜的包埋剂与包埋条件。包埋剂要具备以下条件来源丰富、造价低，具有良好的坚实性和韧性，无毒无害， 能使反应的底物和产物易于出入载体，而细胞又不易通过，微生物在载体中增殖快，生长稳定，寿命长。本发明材料采用的包埋剂获取便利，成本低，包埋后的酪酸菌不仅活菌增殖能力强，活菌数高，而且，耐热性、耐胃肠道环境能力好，利于颗粒饲料加工及以活菌状态到达动物肠道，发挥肠道益生菌的功效，促进养殖动物生长。本发明涉及微胶囊化技术包埋酪酸菌及其高密度培养酪酸菌的方法，目前尚无酪酸菌此方面的专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法及其应用。本发明的技术方案一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法，出发菌株为酪酸梭状芽孢杆菌{Clostridium butyricum) JSIM-MCB20040312,保藏号CGMCC No. 1647 ； 由酪酸菌种子活化、酪酸菌微胶囊化包埋、微胶囊颗粒增殖、活菌计数、和酪酸菌菌粉制备工序制得；
酪酸菌种子活化培养基由下述原料及重量配比组成
酵母膏0. 3% 0. 5%，牛肉膏0. 5% 2. 0%，蛋白胨0. 5% 2. 0%,葡萄糖0. 5% 1. 0%, 可溶性淀粉0. 1% 0. 2%，氯化钠0. 5%，乙酸钠0. 3% 0. 5%，盐酸半胱氨酸0. 05% 0. 1%， CaCO3O. 3%，用去离子水配制，pH 6. 0 7. 5 ；酪酸菌发酵培养基由下述原料及重量配比组成
葡萄糖0. 1% 1. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,酵母膏0. 1% 1. 0%, NaCl 0. 5%,乙酸钠
0.3% 0. 5%, CaCO3 0. 1% 0. 7%,自来水配制，pH6. 0 7. 5 ；
(1)菌种活化
无菌开启冻干保藏菌种CGMCC No. 1647，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养，30 37°C培养18 Mh，然后以体积比1% 10%的接种量转接于新鲜活化培养基， 30 37°C培养20 Mh，镜检，超过90%菌体形成芽孢时，即成熟，反复活化2 3次，种子菌悬液以体积比1% 10%接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为体积比 80% 90%，30 37 °C恒温培养箱中静置培养20 Mh ；
(2)酪酸菌微胶囊化包埋
a.包埋剂的制备
制备含有重量百分比浓度为2. 0% 5. 0%的海藻酸钠，0.洲 0. 5%的乳酸钠，0 3. 0% 的明胶，再含有0. 1% 1. 0%的可溶性淀粉或0. 1% 1. 0%纤维素或0. 1% 1. 0%膨润土三者之一，所使用的溶剂为去离子水，混合制得包埋剂微胶囊壁材；
b.交联剂的制备
配制重量百分比浓度为2. 0% 3. 0%的氯化钙去离子水溶液，灭菌待用；
c.微胶囊颗粒的制备
按体积比为菌液包埋剂=1:3 5配制成壁材与菌液的混合胶液，充分搅勻后，将混合胶液喷雾至磁力搅拌的已灭菌的浓度为2. 0% 3. 0%的氯化钙去离子水溶液中，形成 2 3mm的微胶囊，静置固化12 Mh，即得酪酸菌微胶囊颗粒；每ml菌液可制得200-300 粒2 3mm的微胶囊；
(3)微胶囊颗粒增殖将酪酸菌微胶囊颗粒按其制备所需的混合胶液与酪酸菌发酵培养基体积比0. 5%-5%接入酪酸菌发酵培养基中进行培养，在不通空气的条件下，搅拌转速 0 80r/min，30 37°C增殖培养18 24h ；
(4)增殖培养后的微胶囊颗粒内活菌数测定0.2mol/L柠檬酸钠溶液振荡溶解微胶囊颗粒后，采用MPN法进行活菌计数；
(5)耐高温酪酸菌菌粉的制备
将步骤C3)所得增殖培养液高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2 10 进行混合，在30 50°C下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0. 9mm筛，获得的菌粉浓度不低于
1.OXlO11 个 / 克。用所述方法制备的酪酸菌菌粉的应用，用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1. 0 1. 5mg -kg"1的酪酸菌菌粉制剂。本发明的有益效果
酪酸菌经微胶囊化包埋后，活菌增殖能力增强，无需采用氮气或二氧化碳等惰性气体或石蜡液封来营造严格的厌氧环境，在常规的发酵罐中在不通入空气进行培养即能获得高浓度的菌体，生产成本低，能满足饲用微生物添加剂对活菌数的要求。酪酸菌经微胶囊化包埋后，进行高密度培养，获得的菌体对高温的耐受性显著增强，作为微生物饲料添加剂使用时，有利于在经过饲料造粒加工过程中的高温后保持菌体的活性。此外，还具有良好的耐酸性、耐胆盐性以及对人工肠液具有良好的溶出性，适宜用作动物肠道益生菌，有效预防畜禽渔等养殖动物的肠道疾病，促进养殖动物生长。与国内外相关专利的比较
CN 101032527A涉及酪酸菌活菌制剂制备方法，酪酸菌经四级培养，高速离心收集菌体，以1 2 10的比例加入脱脂奶液，真空冷冻干燥，获得的冷冻干燥粉剂活菌数 1.0X109 1. OX 101°个/克，根据其技术方案推算，其发酵培养16-24h后菌体浓度低于 1.0X IO9个/mL。专利CN 1995330A涉及一种丁酸梭菌活菌制剂的生产方法，发酵培养时加入液体石蜡厚度为l_2cm，以营造厌氧环境，发酵培养45-70h，菌液浓度为15-25亿个/ mL,即1. 5X IO9 2. 5X IO9个/mL。综上所述，发酵培养活菌数均显著低于本发明，且专利CN 1995330A发酵培养周期长，需外加液体石蜡厚度为l-2cm，以营造厌氧环境。本发明通过微胶囊化技术包埋酪酸菌，增殖能力显著增加且对厌氧条件不严格，在发酵培养过程中只需不通空气，菌体即增殖生长，18h 24h发酵培养活菌浓度能够达到1. OX 101° 2.0X1010CFU/mL,且耐高温性能显著增强。采用淀粉直接吸附菌体，30°C 50°C干燥，获得的酪酸菌菌粉浓度不低于1. OX IO11个/mL。生物材料样品保藏酪酸梭状芽孢杆菌(C/osirii/i butyricum) JSIM-MCB 20040312，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No. 1647，保藏日期2006年3月10日。
图1酪酸菌微胶囊颗粒在人工肠胃液中的透光率变化。
具体实施例方式实施例1 酪酸菌微胶囊颗粒的制备方法(一)
(1)菌种活化及扩大培养无菌开启冻干保藏菌种CGMCC No. 1647，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养，37°C培养18h，然后以体积比m的接种量转接于新鲜活化培养基，37°C培养Mh。镜检，超过90%菌体形成芽孢时，即成熟，反复活化2 3次。种子菌悬液以1%-10% (V/V)接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为90% (V/V), 37 °C恒温培养箱中静置培养22 Mh。酪酸菌种子活化培养基由下述原料及重量配比组成
酵母膏0. 3% 0. 5%,牛肉膏0. 5% 2. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,葡萄糖0. 5% 1. 0%, 可溶性淀粉0. 1% 0. 2%，氯化钠0. 5%，乙酸钠0. 3% 0. 5%，盐酸半胱氨酸0. 05% 0. 1%， CaCO3O. 3%，用去离子水配制，pH 6. 0 7. 5 ；
酪酸菌发酵培养基由下述原料及重量配比组成
葡萄糖0. 1% 1. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,酵母膏0. 1% 1. 0%, NaCl 0. 5%,乙酸钠 0. 3% 0. 5%, CaCO3 0. 1% 0. 7%,自来水配制，pH6. 0 7. 5 ；
(2)微胶囊化包埋制备重量百分比浓度为4. 0%的海藻酸钠，0. 2%的乳酸钠，2. 0%的明胶，0. 2%的纤维素，混合制得微胶囊壁材，所使用的溶剂均为去离子水。配制重量百分比浓度为2. 0%的氯化钙去离子水溶液，灭菌待用。按体积比为菌液壁材=1:4配制成壁材与菌液的混合胶液，充分搅勻后，利用高压静电成囊装置，将混合液喷雾至磁力搅拌的已灭菌的浓度为2. 0%的氯化钙去离子水溶液中，静置固化22 Mh，每mL菌液可制得250粒2 3mm的微胶囊。(3)微胶囊颗粒内活菌数测定将上述ImL菌液制得的微胶囊颗粒加入到9mL 0. 2mol/L柠檬酸钠溶液振荡溶解微胶囊颗粒，采用MPN法进行活菌计数。按上述方法制得的酪酸菌微胶囊颗粒的活菌数> 5X108CFU/mL。实施例2 酪酸菌微胶囊颗粒的制备方法(二) (1)菌种活化及扩大培养，同实施例1。(2)微胶囊化包埋制备重量百分比浓度为4. 0%的海藻酸钠，0. 3%的乳酸钠，0% 的明胶，0. 5%的可溶性淀粉，混合制得微胶囊壁材，所使用的溶剂均为去离子水。配制重量百分比浓度为3. 0%的氯化钙去离子水溶液，灭菌待用。按体积比为菌液壁材=1:3. 5配制成壁材与菌液的混合胶液，充分搅勻后，利用高压静电成囊装置，将混合液喷雾至磁力搅拌的已灭菌的浓度为3. 0%的氯化钙去离子水溶液中，静置固化22 Mh，每ml菌液可制得200粒2 3mm的微胶囊。(3)微胶囊颗粒内活菌数测定将上述ImL菌液制得的微胶囊颗粒加入到9mL 0. 2mol/L柠檬酸钠溶液振荡溶解微胶囊颗粒，采用MPN法进行活菌计数。按上述方法制得的酪酸菌微胶囊颗粒的活菌数> 5X108CFU/mL。实施例3 酪酸菌微胶囊颗粒的制备方法(三) (1)菌种活化及扩大培养，同实施例1。(2)微胶囊化包埋制备重量百分比浓度为2. 0%的海藻酸钠，0. 5%的乳酸钠，1. 0% 的明胶，0. 5%的膨润土，混合制得微胶囊壁材，所使用的溶剂均为去离子水。配制重量百分比浓度为2. 5%的氯化钙去离子水溶液，灭菌待用。按体积比为菌液壁材=1:5配制成壁材与菌液的混合胶液，充分搅勻后，利用高压静电成囊装置，将混合液喷雾至磁力搅拌的已灭菌的浓度为2. 5%的氯化钙去离子水溶
液中，形成2 3mm的微胶囊，静置固化22 Mh，每ml菌液可制得300粒2 3mm的微胶 ；
(3)微胶囊颗粒内活菌数测定将上述ImL菌液制得的微胶囊颗粒加入到9mL 0. 2mol/L柠檬酸钠溶液振荡溶解微胶囊颗粒，采用MPN法进行活菌计数，所制得的酪酸菌微胶囊颗粒的活菌数彡5X108CFU/mL。实施例4 酪酸菌微胶囊颗粒的增殖
取实施例1中制备的酪酸菌微胶囊颗粒按其制备所需的混合胶液与酪酸菌发酵培养基体积比0. 5%-5%接入酪酸菌发酵培养基中，发酵罐不通空气，搅拌转速0 80r/min，37°C 培养18 Mh。0. 2mol/L柠檬酸钠溶液里振荡溶解酪酸菌微胶囊颗粒后，采用MPN法进行活菌计数。同时取酪酸菌微胶囊颗粒增殖前的活菌数计数作为对照，结果如表1所示。表1酪酸菌微胶囊颗粒增殖前后活菌数的比较
权利要求
1.一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法，其特征在于出发菌株为酪酸梭状芽孢杆菌(C/osirii/i toi^ricw )JSIM-MCB20040312,保藏号 CGMCC No. 1647 ；由酪酸菌种子活化、酪酸菌微胶囊化包埋、微胶囊颗粒增殖、活菌计数、和酪酸菌菌粉制备工序制得；酪酸菌种子活化培养基由下述原料及重量配比组成酵母膏0. 3% 0. 5%，牛肉膏0. 5% 2. 0%，蛋白胨0. 5% 2. 0%,葡萄糖0. 5% 1. 0%, 可溶性淀粉0. 1% 0. 2%，氯化钠0. 5%，乙酸钠0. 3% 0. 5%，盐酸半胱氨酸0. 05% 0. 1%， CaCO3 0. 3%，用去离子水配制，pH 6. 0 7. 5 ；酪酸菌发酵培养基由下述原料及重量配比组成葡萄糖0. 1% 1. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,酵母膏0. 1% 1. 0%, NaCl 0. 5%,乙酸钠 0. 3% 0. 5%, CaCO3 0. 1% 0. 7%,自来水配制，pH6. 0 7. 5 ； (1)菌种活化无菌开启冻干保藏菌种CGMCC No. 1647，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养，30 37°C培养18 Mh，然后以体积比1% 10%的接种量转接于新鲜活化培养基， 30 37°C培养20 Mh，镜检，超过90%菌体形成芽孢时，即成熟，反复活化2 3次，种子菌悬液以体积比1% 10%接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为体积比 80% 90%，30 37 °C恒温培养箱中静置培养20 Mh ；(2)酪酸菌微胶囊化包埋a.包埋剂的制备制备含有重量百分比浓度为2. 0% 5. 0%的海藻酸钠，0.洲 0. 5%的乳酸钠，0 3. 0% 的明胶，再含有0. 1% 1. 0%的可溶性淀粉或0. 1% 1. 0%纤维素或0. 1% 1. 0%膨润土三者之一，所使用的溶剂为去离子水，混合制得包埋剂微胶囊壁材；b.交联剂的制备配制重量百分比浓度为2. 0% 3. 0%的氯化钙去离子水溶液，灭菌待用；c.微胶囊颗粒的制备按体积比为菌液包埋剂=1:3 5配制成菌液与壁材的混合胶液，充分搅勻后，将混合胶液喷雾至磁力搅拌的已灭菌的浓度为2. 0% 3. 0%的氯化钙去离子水溶液中，形成 2 3mm的微胶囊，静置固化12 Mh，即得酪酸菌微胶囊颗粒，每mL菌液可制得200-300 粒2 3mm的微胶囊；(3)微胶囊颗粒增殖将酪酸菌微胶囊颗粒以其制备所需的混合胶液与酪酸菌发酵培养基体积比0. 5%-5%接入酪酸菌发酵培养基中进行培养，在不通空气的条件下，搅拌转速 0 80r/min，30 37°C增殖培养18 24h ；(4)增殖培养后的微胶囊颗粒内活菌数测定0.2mol/L柠檬酸钠溶液振荡溶解微胶囊颗粒后，采用MPN法进行活菌计数；(5)酪酸菌菌粉的制备将步骤C3)所得增殖培养液高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2 10 进行混合，在30 50°C下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0. 9mm筛，获得酪酸菌菌粉制剂，酪酸菌菌粉制剂的菌粉浓度不低于1. OX IO11个/克。
2.用权利要求1方法制备的酪酸菌菌粉的应用，其特征在于用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1. 0 1. 5mg -kg"1的酪酸菌菌粉制剂。
全文摘要
一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法及其应用，属于微生物制剂技术领域。本发明出发菌株为酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312,保藏号CGMCCNo.1647；由酪酸菌种子活化、酪酸菌微胶囊化包埋、微胶囊颗粒增殖、活菌计数、和酪酸菌菌粉制备工序制得，获得的菌粉浓度不低于1.0×1011个/克。酪酸菌经微胶囊化包埋后，活菌增殖能力增强，无需采用氮气或二氧化碳等惰性气体或石蜡液封来营造严格的厌氧环境，在常规的发酵罐中不通入空气进行培养即能获得高浓度的菌体，生产成本低，能满足饲用微生物添加剂对活菌数的要求；还具有良好的耐热性、耐酸性及肠溶性好的特点，适宜用作动物肠道益生菌，有效预防鸡、猪等畜禽渔养殖动物的肠道疾病，促进养殖动物生长。
文档编号C12N11/04GK102199590SQ201110083328
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者何义进, 匡群, 史济筠, 孙梅, 张维娜, 施大林, 谢骏, 邹益东, 陈秋红 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 宜兴市天石饲料有限公司, 江苏省苏微微生物研究有限公司