专利名称：一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭状芽孢杆菌微生态制剂的生产方法。
背景技术：
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌，是梭状芽孢杆菌属的一个种，主要存在于奶酪、天然酸奶、动物的粪便、某些土壤等环境中。一直以来，丁酸梭菌作为具有强烈整肠作用的益生菌制剂，被广泛用于以改善腹部症状为目的的医药品及饲料中。同时，由于丁酸梭菌能激活免疫系统，也有人将其作为抗肿瘤免疫激活剂使用。此外，丁酸梭菌还可以当作微生物肥料使用，能起到促长、防病的作用。
作为微生态制剂，丁酸梭菌特点和作用机理是1)调节肠道菌群平衡，促进肠道内有益菌群的增殖和发育，抑制有害菌的生长繁殖，降低有毒物质在肠道内的积累。2)丁酸梭菌能激活免疫系统，促进免疫功能，预防肿瘤的发生。3)在肠道内产生多种有益产物，如维生素B、维生素K、淀粉酶等，具有良好的保健作用。主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。4)丁酸梭菌是厌氧芽孢杆菌，产生内生芽孢，能耐酸、耐热、耐胆汁，耐多种抗牛素，在体内不受胃酸、胆汁酸等影响，因而通过消化道不失活，在体外室温下可稳定保藏。
下述专利US5.292 523(1994)、US4.892 731(1990)、JP63-146825(1986)、JP61-6625(1984)、JP06-166825(1994)、JP05-227898(1993)、CN1144873C、CN1184308C涉及丁酸梭菌活菌剂的制备和用途，这些专利中存在下述状况1、丁酸梭菌种的培养均是采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；2、培养基主要采用的氮源为牛肉膏、蛋白胨、或酵母膏及其酶解产物，成本较高；3、所得到的发酵菌数为10-15×108cfu/ml菌液；4、培养物是以芽孢形成率为成熟指标，而不是以更能反映产品质量的芽孢形成率加上芽孢成熟脱落率为成熟指标，使产品质量受到一定影响。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述不足而提供一种生产成本低廉，操作简单，活菌数较高，且产品质量更为稳定的丁酸梭菌活菌剂的生产方法。
本发明的技术方案是所述一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法，包括下述步骤1)、准备培养基；2)、溶解上罐的培养基，装上pH电极并调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；3)、对发酵罐中的培养基加温灭菌；4)、接种丁酸梭菌种子在发酵罐降温后加入无机盐溶液，然后加入液体石蜡及接入丁酸梭菌种子；5)、控温发酵控制pH值，在保温的的状态下发酵；6)、芽孢完全脱落后放罐并测定发酵液菌数；7)、用植物纤维粉吸附发酵液，经干燥后粉碎，即获得粉状制剂。
本发明的技术效果是1、直接利用普通通气和搅拌发酵罐即可进行生产，且操作简单、质量稳定、能耗小、成本低。
2、无需通入二氧化碳、氮气等气体隔绝空气，用于隔绝空气的液体石蜡等液体可以反复多次利用。其他专利要么用厌氧罐、要么通二氧化碳、氮气等气体隔绝空气。
3、添加无机盐，显著提高芽孢成熟率，使芽孢成熟率接近100％，产品质量更为稳定。现有技术仅指出以形成梭状芽孢为特征的芽孢形成率高于90％，未指出芽孢是否完全成熟。
4、发酵液菌数达到15～20亿个/ml菌液，而现有技术的发酵液菌数约为10-15亿个/ml菌液。
5、后处理过程中以植物纤维粉如玉米芯粉、麸皮粉、稻草粉等直接吸附菌液后晾干(发酵液粘性较强)，与现有技术所用离心机处理相比，本发明则降低了成本，提高了产品质量。
本发明的更进一步的技术方案是上述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为100-121℃，时间为10-30分钟；所述的接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至35-45℃后先加入无机盐合计0.7-1.5g/1000ml基料，无机盐选自MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O及CaCl2两种或三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1-2cm，接入丁酸梭菌液体种子为5-20ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值6.0-7.5，在30-42℃保温的的状态下发酵45-70小时。
上述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为115℃，时间为20分钟；接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至38℃后先加入无机盐合计1.1g/1000ml基料，无机盐选为MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三种，然后加入液体石蜡厚度为1.5cm，接入丁酸梭菌液体种子为10ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值6.4，在38℃保温的的状态下发酵60小时。
上述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为100℃，时间为30分钟；接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至35℃后先加入无机盐合计0.7g/1000ml基料，无机盐选为MgSO4·7H2O和CaCl2两种，然后加入液体石蜡厚度为1cm，接入丁酸梭菌液体种子为5ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值6.0，在30℃保温的的状态下发酵70小时。
上述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为121℃，时间为10分钟；接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至45℃后先加入无机盐合计1.5g/1000ml基料，无机盐选为MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三种，然后加入液体石蜡厚度为2cm，接入丁酸梭菌液体种子为20ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值7.5，在42℃保温的的状态下发酵45小时。
上述的用于吸附发酵液的植物纤维粉选自植物茎杆粉，或谷糠粉，麸皮，玉米芯粉，或其组合，优选麸皮粉；所述的植物茎杆选自麦子、稻子、高梁、玉米茎杆，优选稻杆。
本发明的发酵液其取样计菌数为15-25亿个/ml菌液。
为了进一步降低生产成本，以大豆饼粉、即发酵豆粕作为主要氮源，比现有技术用大豆粉或其酶解产物作为主要氮源更经济，且是充分利用自然资源，因此，本发明方法中所用的培养基可以是常规的培养基，优选的培养基所包括的原料及重量份为大豆饼粉、即发酵豆粕40-50，玉米淀粉6-8，葡萄糖18-22，酵母浸膏粉1-3，胰蛋白胨3-6，牛肉浸膏0.3-1，NaHCO31-3、K2HPO41-3，原料当以克计、蒸馏水相应以ml计的份数为800-1000。
上述培养基的原料及重量选为大豆饼粉、即发酵豆粕40g，玉米淀粉6g，葡萄糖18g，酵母浸膏粉1g，胰蛋白胨3g，牛肉浸膏0.3g，NaHCO31g、K2HPO41g，蒸馏水800ml。
上述培养基的原料及重量选为大豆饼粉、即发酵豆粕50g，玉米淀粉8g，葡萄糖22g，酵母浸膏粉3g，胰蛋白胨6g，牛肉浸膏1g，NaHCO33g，K2HPO43g，蒸馏水1000ml。
上述培养基的优选方案其原料及重量为大豆饼粉、即发酵豆粕45g，玉米淀粉7g，葡萄糖20g，酵母浸膏粉2g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏0.5g，NaHCO31.5g，K2HPO42g，CaCl22克，蒸馏水900ml。
本发明丁酸梭菌活菌剂的生产方法所述的在发酵罐中接入的丁酸梭菌菌种，可以是公知的任何丁酸梭菌菌种。
具体实施例方式
实施例1本发明一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法1、准备培养基下述培养基为优选的一种培养基，但不限于这种培养基，其原料及重量份为大豆饼粉、即发酵豆粕40-50，玉米淀粉6-8，葡萄糖18-22，酵母浸膏粉1-3，胰蛋白胨3-6，牛肉浸膏0.3-1，NaHCO31-3，K2HPO41-3，原料当以克计、蒸馏水相应以ml计的份数为800-1000；具体配料是大豆饼粉45g，玉米淀粉7g，葡萄糖20g，酵母浸膏粉2g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏0.5g，NaHCO31.5g，K2HPO42g，CaCO32g，蒸馏水900ml；2、按常规对培养罐及过滤器、取样器等设备、工具进行消毒杀菌，校正pH电极，溶解上罐的培养基，装上pH电极，调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；溶解过程中培养基的pH值在7.0-7.5范围内调整，本例调整pH值为7.2；3、对发酵罐中的培养基加温灭菌；灭菌的温度在100-121℃、时间为10-30分钟范围内调，本例培养基加温到115℃灭菌，保持时间为20分钟；
4、接种丁酸梭菌种子在发酵罐降温至35-45℃后，先加入灭菌无机盐溶液合计0.7-1.5g/1000mL基料，无机盐选自MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2两种或三种；为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1-2cm，接入丁酸梭菌液体种子为5-20ml/1000ml；具体是在发酵罐降温至38℃后，加入三种无机盐合计1.1g/1000ml基料，加入秩序是先加入MgSO4·7H2O 0.7g/1000ml基料，MnSO4·H2O 0.2g/1000ml基料，搅均后再加入CaCl20.2g/1000ml基料，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡，厚度为1.5cm，再接入丁酸梭菌液体种子为10ml/1000ml基料，选用的丁酸梭菌菌种保藏编号为CCAM 080040，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，位于中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏时间为2005年9月20日，(相同的另一份丁酸梭菌保藏在同一城区的华中农业大学农业微生物国家重点实验室)，但不限于该保藏编号的丁酸梭菌菌种；5、控温发酵控制pH值6.0-7.5，在30-42℃保温的的状态下发酵45-70小时，具体控制pH值6.4，在38℃保温的的状态下发酵60小时；6、芽孢完全脱落后放罐并测定发酵液菌数，取样所测菌数能实现15-25亿个/ml菌液，本例发酵液取样计菌数为20亿个/ml菌液；7、用植物纤维粉吸附发酵液，经干燥后粉碎即获得粉状制剂；用于吸附发酵液的植物纤维粉选自植物茎杆粉，选自麦子、稻子、高梁、玉米茎杆粉，或谷糠粉，麸皮粉，玉米芯粉，或其组合；本例用于吸附发酵液的原料选自麦子的麸皮粉。
本实施例丁酸梭菌活菌剂芽孢形成率达到100％，芽孢成熟率接近100％。
实施例2与上述实施例1不同的是1、准备培养基大豆饼粉40克，玉米淀粉6克，葡萄糖18克，酵母浸膏粉1克，胰蛋白胨3克，牛肉浸膏0.3克，NaHCO31克，K2HPO41克，蒸馏水800ml；2、溶解过程中培养基的pH值调整为7.1；3、对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为100℃，时间为30分钟；4、接种丁酸梭菌种子在发酵罐降温至35℃后先加入无机盐合计0.7g/1000mL基料，无机盐选自MgSO4·7H2O及CaCl2两种，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1cm，接入丁酸梭菌液体种子为5ml/1000ml基料，选用的丁酸梭菌菌种保藏编号为CCAM 080039，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，位于中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏时间为2005年9月20日，但不限于该保藏编号的丁酸梭菌菌种；5、控温发酵控制pH值6.0，在30℃保温的的状态下发酵70小时；6、对发酵液取样计菌数为15亿个/ml菌液；7、用于吸附发酵液的原料选自稻草粉。
实施例3与上述实施例1不同的是1、准备培养基大豆饼粉50g，玉米淀粉8g，葡萄糖22g，酵母浸膏粉3g，胰蛋白胨6g，牛肉浸膏1g，NaHCO33g，K2HPO43g，蒸馏水1000ml；2、溶解过程中培养基的pH值调整为7.4；3、对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为121℃，时间为10分钟；4、接种丁酸梭菌种子在发酵罐降温至45℃后，先加入无机盐合计1.5g/1000ml，无机盐为MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三种，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为2.0cm，接入丁酸梭菌液体种子为20ml/1000ml，选用的丁酸梭菌菌种保藏编号为CCAM 080040，但不限于该保藏编号的丁酸梭菌菌种；5、控温发酵控制pH值7.5，在42℃保温的的状态下发酵45小时；6、对发酵液取样计菌数为25亿个/ml菌液；7、用于吸附发酵液的原料选自稻草粉。
上述实施例中的培养基若选为现有技术所用的大豆粉作主要原料，也是可行的，但效果没有上述大豆饼粉好，且加大了原料成本。
本发明保护范围不局限于上述实施例。
权利要求
1.一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法，其特征在于，它包括下述步骤1)、准备培养基；2)、溶解上罐的培养基，装上pH电极并调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；3)、对发酵罐中的培养基加温灭菌；4)、接种丁酸梭菌种子；在发酵罐降温后加入无机盐溶液，然后加入液体石蜡及接入丁酸梭菌种子；5)、控温发酵控制pH值，在保温的的状态下发酵；6)、芽孢完全脱落后放罐并测定发酵液菌数；7)、用植物纤维粉吸附发酵液，经于燥后粉碎，即获得粉状制剂。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为100-121℃，时间为10-30分钟；所述的接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至35-45℃后先加入无机盐合计0.7-1.5g/1000ml基料，无机盐选自MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O及CaCl2两种或三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为2cm，接入丁酸梭菌液体种子为5-20ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值6.0-7.5，在30-42℃保温的的状态下发酵45-70小时。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为115℃，时间为20分钟；接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至38℃后先加入无机盐合计1.1g/1000ml基料，无机盐选为MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三种，然后加入液体石蜡厚度为1.5cm，接入丁酸梭菌液体种子为10ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值6.4，在38℃保温的的状态下发酵60小时。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为100℃，时间为30分钟；接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至35℃后先加入无机盐合计0.7g/1000ml基料，无机盐选为MgSO4·7H2O和CaCl2两种，然后加入液体石蜡厚度为1cm，接入丁酸梭菌液体种子为5ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值6.0，在30℃保温的的状态下发酵70小时。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的对发酵罐中的培养基加温灭菌的温度为121℃，时间为10分钟；接种丁酸梭菌种子是在发酵罐降温至45℃后先加入无机盐合计1.5g/1000ml基料，无机盐选为MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三种，然后加入液体石蜡厚度为2cm，接入丁酸梭菌液体种子为20ml/1000ml基料；所述的控温发酵是控制pH值7.5，在42℃保温的的状态下发酵45小时。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用于吸附发酵液的植物纤维粉选自植物茎杆粉，或谷糠粉，麸皮粉，玉米芯粉，或其组合，优选麸皮粉；所述的植物茎杆选自麦子、稻子、高梁、玉米茎杆。
7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的丁酸梭菌的培养基包括的原料及重量份为大豆饼粉、即发酵豆粕40-50，玉米淀粉6-8，葡萄糖18-22，酵母浸膏粉1-3，胰蛋白胨3-6，牛肉浸膏0.3-1，NaHCO31-3，K2HPO41-3；原料当以克计、蒸馏水相应以ml计的份数为800-1000。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，培养基的原料及重量选为大豆饼粉、即发酵豆粕40g，玉米淀粉6g，葡萄糖18g，酵母浸膏粉1g，胰蛋白胨3g，牛肉浸膏0.3g，NaHCO31g、 K2HPO41g，蒸馏水800ml。
9.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，培养基的原料及重量选为大豆饼粉、即发酵豆粕50g，玉米淀粉8g，葡萄糖22g，酵母浸膏粉3g，胰蛋白胨6g，牛肉浸膏1g，NaHCO33g ，K2HPO43g，蒸馏水1000ml。
10.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，所包括的原料及重量为大豆饼粉、即发酵豆粕45g，玉米淀粉7g，葡萄糖20g，酵母浸膏粉2g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏0.5g，NaHCO3，1.5g，K2HPO42g，CaCl22克，蒸馏水900ml。
全文摘要
本发明涉及一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭状芽孢杆菌微生态制剂的生产方法。它包括下述步骤准备培养基；溶解上罐的培养基，调整pH值，装入发酵罐中；对发酵罐中的培养基加温灭菌；接种丁酸梭菌种子；控温发酵；放罐并测定发酵液菌数；用植物纤维粉吸附发酵液，经干燥后粉碎，即获得粉状制剂。优点是用普通发酵罐生产，操作简单、效果稳定、能耗小；芽孢成熟率高，产品质量更为稳定；不用离心机等处理，从而降低了成本，提高了产品质量。
文档编号C12N1/20GK1995330SQ20061012558
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者谢树贵, 赵述淼, 戴青, 梁运祥, 葛向阳, 陈正军, 胡咏梅, 王绩, 梅余霞, 田焕章 申请人:华中农业大学