专利名称：：阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法
技术领域：
：本发明涉及微生物菌种选育的领域，尤其是采用重离子12C+6辐照诱变。
背景技术：
：优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。目前常用的发酵微生物菌种选育技术，一种是常规的诱变育种方法，另一种是分子育种方法。常规的诱变育种方法采用物理诱变因子如紫外线等进行诱变育种，或者采用化学诱变因子如硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍、氯化锂、香豆素等进行诱变育种，或者采用物理因子和化学因子的复合诱变育种。常规育种具有盲目性强，工作量大、成功率低，而且现有的生产菌种对以往常用的物理和化学方法均表现出不同的抗性。分子育种方法是采用原生质体融合技术和DNA重组技术等一系方法选育菌种，该方法操作难度大，而且由于发酵工业生产规模大，基因工程菌经反扩大培养很容易引起质粒失活甚至丢失，造成基因表达困难。因此寻找新的诱变育种方法是迫切要解决的问题。阿维菌素是当今最受关注的生物杀虫杀螨剂之一，是被推荐使用的高效低毒农药，阿维菌素(Avermectin)是由阿佛曼链霉素经液体发酵加工而成，与传统农、兽药相比，具有高效、广谱、剂量小、适口性好、有效期长、不易产生抗药性，易降解，无残留等特点，且不易产生耐药性，与其他杀虫药无交叉抗性。在土壤降解快、光解迅速。对作物安全，不易产生药害。目前影响其发展的主要原因为作为菌种的阿佛曼链霉菌发酵效价提升缓慢，甚至长期得不到突破性进展。天然阿维菌素中含有8个组分，主要有4种即Ala、A2a、Bla和B2a，其总含量》80%;对应的4个比例较小的同系物是Alb、A2b、Blb和B2b，其总含量《20%。目前市售阿维菌素农药是以abamectin为主要杀虫成分(AvermectinBla+Blb，其中Bla不低于90%、Blb不超过5%)，以Bla的含量来标定。AVMBla分子式C48H72014(R=C2H5)AVMBla分子量872阿维菌素为白色或淡黄色结晶物，熔点为157_162°C，a(CHC13)=+55.7在237、245、254nm处均有吸收峰，Amax=244±2nm，阿维菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶剂，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度极低(10i!g/l)，本品应在干燥、密闭、阴凉遮光下保存。分子中无酸性或碱性官能团，在一般条件下稳定，在ra5-9时不会水解，无腐蚀性，对环境安全。阿佛曼链霉菌菌种的选育时，经紫外线和亚硝基胍反复处理，菌种的发酵效价得到了显著的提高，从野生菌种发酵效价的10微克/毫升提高到了目前的4000微克/毫升，但是再提高已经非常困难，严重影响了生产规模，生产成本居高不下。业内人士目前面临的主要问题是寻求一种能提高菌种选育技术水平的好方法，以便得到一种对阿维菌素深层培养的高产优质菌种和达到大幅度降低生产成本的目的。
发明内容本发明的目的为提供一种正突变变率高，发酵效价高、诱变条件可控可调可多次重复的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法。菌种的中能重离子束辐照诱变是一种新近发现的独特的物理诱变方法，因为重离子束具有参数多样，LET大，RBE高等特性，利用它可提高突变率，拓宽突变谱，縮短育种周期，是近年来辐射育种的一种新方法。实现上述发明目的的技术方案为阿佛曼链霉素菌种用12C+6重离子束辐照进行诱变，辐照剂量范围为40-70Gy，优选剂量为50Gy。阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法的具体步骤(1)阿佛曼链霉素菌种孢子悬液用12C+6重离子束辐照进行诱变；(2)将辐照诱变后的孢子悬液和出发菌种的孢子悬液分别进行梯度稀释，用生理盐水稀释至10—4_10—5倍；(3)将稀释的悬液准确转到分离平板培养基上，涂抹均匀，分离单个菌落，测定最佳正突变率最佳诱变剂量；(4)对突变明显的菌落，用接种环取菌落孢子接种在斜面培养基上；(5)将(3)的平板培养基与(4)的斜面培养基包扎后置于28t:恒温箱中培养6天，再置于2-4t:冰箱中等待菌种接种；(6)对比辐照诱变菌种与出发菌种的平板培养结果和斜面培养结果，得出最佳正突变率、最佳诱变剂量，测出致死率和菌落态，得到高效价菌种。斜面培养基及分离平板培养基配方可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化钠0.5g、硫酸铵2g、硫酸镁lg、磷酸氢二钾3g、轻质碳酸钙3g、琼脂粉20g。斜面培养基及分离平板培养基的制备方法如下(1)准确称量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾依次加入烧杯中，搅拌均匀后调节ra值至7.50;(2)加入琼脂粉搅拌均匀，加热煮沸，待琼脂充分溶解，加入轻质碳酸钙搅拌均匀，定溶质1000ml，再煮沸，趁热分别分装在试管中和三角瓶中；(3)加棉塞包扎试管和三角瓶后，进行120_123°C，22分钟的高压灭菌；(4)斜面培养基的制备灭菌结束后，待培养基温度降至50-6(TC培养基在试管中制备成斜面，待琼脂凝固后，置37t:的恒温箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存等待菌种接种；分离平板培养基的制备待三角瓶中的分离培养基温度降至50-6(TC时，趁热在平皿上制备平板培养基，待琼脂凝固后包扎，置37t:的恒温箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存，等待菌种接种。本技术方案的实验情况如下1实验材料和仪器1.1出发菌种阿佛曼菌种系列的除虫链霉菌S.avermitilisZJAV-A1。1.2仪器及试剂41.2.1"HIFRL"型中能重离子加速器，中科院兰州近代物理研究所提供。1.2.2美国瓦里安Prostar210型高效液相色谱仪，瓦里安Prostar325型紫外_可见检测器1.2.3超净工作台1.2.4旋转摇瓶机，型号X-X1.2.5离心机AnkeTDL81.2.6隔水式电热恒温培养箱WGP-6001.2.7pH计pHS-3C型，上海雷磁仪器厂1.2.8电子精密天平FA2004ElectronicBalanceAccuracy:0.lmg1.2.9生物显微镜CX21BIM1.2.10高压蒸汽灭菌器1.2.11SB超声波清洗器上海Branson公司1.2.12生理盐水，无水甲醇(分析纯)，无水甲醇(HPLC纯)，双蒸馏水。2.实验步骤及方法2.1菌种的活化取已知效价且生产性能优良的除虫链霉菌S.avermitilisZJAV-A1菌种一支，放置在恒温缓冲间(28°C士0.6t:，30min)，使其活化。2.212C+6离子束穿透诱变对出发菌株S.avermitilisZJAV-A1分批设计多点的不同辐照剂量，以重离子加速器提供的12C+6离子束对阿维菌素菌种孢子悬浮液二个样品进行第一次辐照诱变，对突变菌株进行筛选、检测，掌握辐照剂量与正突变菌株产生之间的规律和趋势。在第一次的基础上，调整剂量再进行第二次辐照诱变。处理4次，然后将处理过的孢子悬液梯度稀释，准确吸取一个样品的孢子悬液O.2ml/板，倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落，以追求最佳正突变率及最佳诱变剂量。同时，以出发菌种另一个样品孢子悬液同法以普通分离平板培养基分离对照，以便进行菌落形态对比和致死率统计。待分离平板培养基在28°C士0.6t:培养6-7天生长成熟，于冰箱中2-4t:保存备用。研究重离子束12C+6离子对出发菌种诱变剂量的选择，诱变剂量对菌种的致死率，菌种致死率与诱变后筛选出高产菌株的趋势。2.3正突变菌株的筛选2.3.1单个菌落的挑选在超净工作台，从分离好的平板上仔细挑选孢子灰白色、丰满的单菌落，以及菌落形态有一定变异的单菌落，在记录好菌落详细形态及大小后转接于斜面培养基上，于恒温箱内培养，培养温度为28°C±0.6t:、培养时间为6-7天后冷藏备用。2.3.2致死率统计分别对每个剂量经过挑选转接后的分离平板和出发菌种对照平板进行菌落计数，然后按剂量分别计算出诱变前后的平均孢子浓度，统计出每个剂量的致死率。诱变前孢子浓度(个/ml)-诱变后孢子浓度(个/ml)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2.3.3摇瓶初筛2.3.3.1—级摇瓶发酵取出已生长成熟的转接斜面菌种进行观察，将长好的孢子挖取一定量转接于种子培养基进行扩大培养，以220-260r/min旋转摇瓶机，恒温、恒湿条件下进行一级发酵。2.3.3.2二级摇瓶发酵取培养好的种子液以一定的接种量转接于发酵培养基(60ml/500ml三角瓶)进行二级发酵，以220-260r/min旋转摇瓶机，恒温、恒湿条件下培养9-10天后进行效价检测。2.3.4发酵观察发酵过程中仔细观察发酵液的颜色、气味的变化，以及进行涂片镜检仔细观察菌丝的形态以及自溶现象等。2.4效价测定2.4.1菌丝溶媒萃取取发酵液3ml于具塞离心管中，4000r/min离心10min，弃上清。加入甲醇至9ml，于旋涡式混合器上振荡lh，4000r/min离心10min，取上清液稀释10倍，O.5ym样品滤膜过滤器过滤、待测。2.4.2HPLC-UV法测定效价采用C18反相柱，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，颗粒大小5iim，柱长250mm，内径4.6mm不锈钢柱，流动相为无水甲醇水(85:15)，流速lml/min，进样量20u1/次(样品管20ul)，检测波长245nm，AVMBla和AVMBlb的分离度应符合规定(>1.5)。准确吸取20ul样品进样，根据样品、对照品AVMBla的峰面积，以及样品的稀释倍数计算发酵液AVMB^含量。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>3结果3.1辐照剂量与致死率结果列于表1。表1辐照剂量与阿佛曼链霉菌致死率结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>辐照剂量与阿佛曼链霉菌致死率趋势示于附图13.2辐照剂量与正突变率辐照剂量与阿佛曼链霉菌正突变率趋势示于附图212C+6对阿维菌素菌种正突变的最佳辐照剂量范围40-70Gy，在50Gy该剂量范围内得到的最高正突变率为34%。3.3菌落形态分析出发菌种S.avermitilisPAN-A1与正突变菌株S.avermitilisPAN-YII的生长及形态分别存在以下特征PAN-Al与PAN-YII在基本培养基上都能迅速生长，28。C培养6_7d，PAN-A1菌落直径可达12mm，孢子区直径为约为1mm;而PAN-YII的菌落直径可达24mm，孢子区直径约2-3mm，且PAN-Al的孢子为灰白色，色较深，泛黄；而PAN-YII的孢子为灰白色，色较淡，有朦胧感。菌悬液经12C+6离子束处理后，所培养形成的菌落形态变化很大，但主要表现为以下三种形态1.光秃型不产抗；2.馒头型产抗能力较差；3.草帽型产抗能力最好。3.4摇瓶效价分析采用12C+6离子束贯穿诱变对出发菌种S.avermitilisPAN-A1进行处理，经初筛、复筛后，得到的高产除虫链霉菌突变株，对此高产除虫链霉菌突变株进行斜面培养，摇瓶发酵，发酵观察以及提取工艺。对经诱变处理获得的菌株及出发菌株进行效价测定，测定结果如图3所示。通过图谱分析可以得知，这次经过诱变处理后所得到的除虫链霉菌突变株，与出发菌种相比，杂质比例明显降低，主要活性成分AVMBla在产物中的所占比例明显提高，效价可达5500微克/毫升以上。此高效价菌株连续传代三次，阿维菌素生产能力基本稳定保持不变.4结论通过重离子辐照阿维菌素菌种，剂量效应研究，得出如下结论。半致死剂量为23Gy左右，正突变率为4%;正突变的最佳辐照剂量范围40-70Gy;97%致死剂量为50Gy，正突变率最高为34%。基础菌株用重离子加速器诱变处理后，挑选出了突变形态典型的单菌株850株，通过摇瓶发酵培养测试效价后，得到29株正突变的菌株，发酵效价提高了802000微克采用重离子加速器第一次诱变处理后，阿维菌素菌种的正突变率为3.41%，菌种Fl代的发酵效价比基础菌株4000微克/毫升提高到6000微克/毫升左右，提高幅度约50%，由此可见，用重离子加速器进行诱变育种使抗生素生产菌种提高发酵效价，具有非常广阔的应用前景。本发明具有以下有益效果(1)变异稳定可靠、快，可以大大縮短育种周期；(2)突变容易控制，方法简便易行；(3)变异谱宽，能产生新的菌种类型；(4)变异频率高，比自然变异率高1000倍以上。图1为本发明辐照剂量与阿佛曼链霉菌致死率趋势图图2为辐照剂量与阿佛曼链霉菌正突变率趋势图图3为诱变处理获得的菌株及出发菌株的效价测定结果图图4为阿维菌素的结构图具体实施例方式1、用重离子加速器提供的"C+e离子束对出发菌株S.avermitilisPAN-A1两个试样的孢子悬浮液进行辐照诱变，设计剂量为0、0.25、0.5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80Gy，进行第一次辐照诱变，研究辐照剂量与发生正突变菌株的规律，调整辐照剂量，再进行第二次辐照诱变。2、对上述处理过的孢子悬浮液进行梯度稀释，准确吸取一个试样的孢子悬浮液0.2ml/板，倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落，获得高效价，并得出最佳正突变率和诱变剂量。3、将发出菌种另一个试样孢子悬浮液用上述同样的方法以普通分离培养基分离对照，进行菌落形态对比和致死率统计。以上斜面培养基及分离平板培养基的配方为可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化钠0.5g、硫酸铵2g、硫酸镁lg、磷酸氢二钾3g、轻质碳酸钙3g、琼脂粉20g。斜面培养基及分离平板培养基的制备方法如下(1)准确称量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾依次加入i号烧杯中，搅拌均匀后调节ra值至7.50;(2)加入琼脂粉搅拌均匀，加热煮沸，待琼脂充分溶解，加入轻质碳酸钙搅拌均匀，定溶质1000ml，再煮沸，趁热分装；(3)每支15X150mm的试管中分装5ml，每支250ml三角瓶分装200ml加棉塞包扎试管和三角瓶后，进行120°C，20分钟的高压灭菌；(4)斜面的制备灭菌结束后，待培养基温度降至55t:培养基在试管中制备成斜面，待琼脂凝固后，置37t:的恒温箱中空培7天，置入3t:冰箱保存等待接种菌种；分离平板培养基的制备待三角瓶中的分离培养基温度降至6(TC时，趁热在平皿上制备平板，在每个90mm的无菌平皿中加入培养基15ml，待琼脂凝固后包扎，置37t:的恒温箱中空培7天，置入2t:冰箱保存等待接种菌种。权利要求阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为(1)阿佛曼链霉素菌种孢子悬液用12C+6重离子束辐照进行诱变，辐照剂量范围为40-70Gy；(2)将辐照诱变后的孢子悬液和出发菌种的孢子悬液分别进行梯度稀释，用生理盐水稀释至10-4-10-5；(3)将稀释的悬液准确转到分离平板培养基上，涂抹均匀，分离单个菌落，测定最佳正突变率最佳诱变剂量；(4)对突变明显的菌落，用接种环取菌落孢子接种在斜面培养基上；(5)将(3)的平板培养基与(4)的斜面培养基包扎后置于28℃恒温箱中培养6天，再置于2-4℃冰箱中等待菌种接种；(6)对比辐照诱变菌种与出发菌种的平板培养结果和斜面培养结果，得出最佳正突变率、最佳诱变剂量，测出致死率、观察菌落形态，得到正突变的菌株。2.根据权利要求1所述的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为12C+6重离子束辐照进行诱变的剂量为50Gy。3.根据权利要求1或2所述的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为斜面培养基及分离平板培养基配方可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化钠0.5g、硫酸铵2g、硫酸镁lg、磷酸氢二钾3g、轻质碳酸钙3g、琼脂粉20g，加水定容至1000ml。4.根据权利要求3所述的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为斜面培养基及分离平板培养基的制备方法如下(1)准确称量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾依次加入烧杯中，搅拌均匀后调节ra值至7.50;(2)加入琼脂粉搅拌均匀，加热煮沸，待琼脂充分溶解，加入轻质碳酸钙搅拌均匀，加水定溶至1000ml，再煮沸，趁热分别分装在试管中和三角瓶中；(3)加棉塞包扎试管和三角瓶后，进行120-123°C，20分钟的高压灭菌；(4)斜面培养基的制备灭菌结束后，待培养基温度降至50-6(TC培养基在试管中制备成斜面，待琼脂凝固后，置37°C的恒温箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存等待菌种接种；分离平板培养基的制备待三角瓶中的分离培养基温度降至50-60°C时，趁热在平皿上制备平板培养基，待琼脂凝固后包扎，置37°C的恒温箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存，等待菌种接种。全文摘要本发明为阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变方法及辐照菌种的培养，涉及微生物菌种选育的领域，阿佛曼链霉菌种用现有的诱变方法发酵效价达到4000微克/毫升，再提高已非常困难，为此本发明采用12C+6重离子束辐照进行诱变，辐照剂量40-70Gy，优选辐照剂量50Gy，进行平板培养基及斜面培养基的正突变菌株筛选，发酵效价可达到6000微克/毫升，得到高效价菌种，本发明具有变异稳定、快速、突变容易控制、方法简便易行的有益效果。文档编号C12N15/01GK101768585SQ20081018796公开日2010年7月7日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者刘敬,李文建,王曙阳,陈积红,颉红梅申请人:中国科学院近代物理研究所