阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺的制作方法

专利名称：阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗生素选育领域，尤其是阿佛曼链霉菌种的选育。
背景技术：
阿维菌素是阿佛曼链霉菌经液体发酵后，提取的代谢产物，为十六元大环内酯类抗生素。其制剂可以作为农药、兽药，具有广谱、高效、低毒、无残留、不易产生抗药性等特点。 在农药方面，阿维菌素是一种农用抗生素类杀虫剂、杀螨剂，属昆虫神经毒剂，主要干扰害虫神经生理活动，使其麻痹中毒而死亡。无内吸性，但有较强的渗透作用，并能在植物体内横向传导，杀虫、杀螨活性高，比常用农药高5 50倍，用药量仅为常用农药的1% 2%。该药剂对抗药性害虫有较好的防效，与有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药无交叉互抗性，对天敌较安全。 阿维菌素是当今最受关注的生物杀虫杀螨剂之一，被农业部作为推荐使用的高效低毒的农药产品。阿维菌素由阿佛曼链霉素经液体发酵加工而成的抗生素类生物农、兽药。与传统的农、兽药相比，具有高效、广谱、有效期长，不易产生抗药性，易降解，无残留等特点，且不易产生耐药性，与其他杀虫药无交叉抗性。在土壤中降解快，光解迅速，对作物安全，不易产生药害。阿维菌素是世界上第21大畅销农药，第4大畅销杀虫剂，销售额高达16亿美元。由于阿维菌素是一种新型抗生素类，具有结构新颖、农畜两用的特点，因此，随着人们生活水平的提高以及对绿色食品的呼唤，这类生物农药在当前农药市场备受青睐，阿维菌素也成为当前生物农药市场中最受欢迎和最具竞争力的新产品。 天然阿维菌素中含有8个组分，主要有4种即Ala、 A2a、 Bla和B2a，其总含量》80% ;对应的4个比例较小的同系物是Alb、A2b、Blb和B2b，其总含量《20%。目前市售阿维菌素农药是以abamectin为主要杀虫成分(AvermectinBla+Blb，其中Bla不低于90%、Blb不超过5% )，以Bla的含量来标定。
AVMBla分子式C48H72014 (R = C2H5)
AVMBla分子量872
2. 3阿维菌素的物化性质 阿维菌素为白色或淡黄色结晶物，熔点为157_162°C ， a (CHC13) = +55. 7在237、245、254nm处均有吸收峰，A max = 244±2nm，阿维菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶剂，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度极低(10i!g/l)，本品应在干燥、
密闭、阴凉遮光下保存。本品分子中无酸性或碱性官能团，在一般条件下稳定，在ra5-9时
不会水解，无腐蚀性，对环境安全。 影响中国抗生素行业发展的主要因素有菌种发酵效价提升缓慢，甚至长期都得不到突破性的进展。 目前，国际国内抗生素菌种诱变手段多见化学诱变方法和普通射线、低能离子的诱变，但都没有得到理想的发酵效价，阿维菌素发酵效价只在4000 g/ml 。近年来随着中国航天事业的发展，出现了太空育种的手段。但条件有限不易实现。该项目采用重离子束辐照的物理诱变方法，具有可控、可调、可多次重复的特点，显著改善了其它辐照手段的随机性和不可控性。 我们采用中能重离子束对阿维菌素菌株进行辐照处理，为找出适宜阿维菌素菌株诱变的最佳参数，对辐照物理参数的计算进行了多次优化调整，经过4次辐照处理、确定了对阿维菌素菌种的最佳辐照剂量及半致死剂量。然后在试验室进行反复筛选后，得到生产性能优良、稳定性好的菌株，再通过优化发酵培养基，使其发酵效价达到了 5800i！ g/ml以上。这些技术成果已记录在"阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种培养方法"中，并进行了专利申请。 微生物发酵一般分为发酵与提取两个阶段，包括孢子制备、斜面培养、摇瓶培养、种子瓶培养、发酵瓶发酵和醪液提取。微生物发酵的整个工艺流程中，最关键的一步就是发酵阶段，发酵受到许多因素的影响，我们必须密切注意才能取得预期的效果， 一些影响发酵的主要因素有杂菌和噬菌体的污染、添加营养物的补料工艺、最佳产抗pH的全程有效监控、温度的全程有效监控、通气、搅拌以及泡沫控制等，这些决定发酵成败的关键条件对不同诱变得到的菌种是不同的，作为一个由重离子辐照诱变得到的菌种也有其专属的工艺条件，因此我们必须在前段试验的基础上作进一步的探索，以便获得最佳的选育工艺条件。

发明内容
本发明的目的为提供阿佛曼链霉菌种经重离子12C+6辐照诱变后的高效价菌种选育工艺，通过该选育工艺，以获得优质菌种和降低生产成本。
实现上述发明目的的工艺条件为 经重离子辐照诱变阿佛曼链霉菌种的正突变菌株的产抗工艺条件为种子培养基PH 7.0-7.2，发酵温度为28士0.6t:、发酵培养基PH 6. 5_7. 5、调节氧溶解度的摇床机转速220-260r/min、接种量4% 。
试验内容 出发菌种S. avermitilis ZJAV-y II 经12(:+6重离子辐照 辐照剂量50-70Gy 试验项目包括斜面培养、摇瓶发酵、测定发酵温度、接种种龄、ra值、接种量和控
制溶解氧的摇床机搅拌速度。
1.温度 在发酵温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期縮短，产
量降低。主要考察了 24t:、26t:、28t:三个温度条件的发酵，跟踪比较了营养物的消耗、pH
的变化及效价增幅的差异。 在24t:下发酵代谢明显异常，糖耗偏低，菌丝生长速度过缓，pH—直保持在很高
水平，不象其他两个温度下出现很强的下降趋势，这也反映出24t:代谢不活跃。另外，24t:
下，氨基氮一直偏高，这也影响菌体生长。菌体代谢极大异常，导致效价大幅降低，明显看出
4低温对发酵的负面影响较大。 在26t:下，糖耗开始快于28t:，但菌丝生长差异并不明显，主要是由于初级代谢
的各条途径的流量发生变化。在前期，2『C和26t:下效价增幅差异并不明显，说明单从阿维菌素的生物合成来说，两温度并不产生显著差异；但到了后期，26t:下效价增幅不如28°C大，而两个温度发酵的糖水平相当，因此，两个温度下后期产抗的差异可能与菌体的质量有关，故前期糖耗不宜过快，否则会导致菌体产抗持续时间縮短。 另外，2『C时菌团较紧密，而26t:下菌团稍显松散，由于松散的菌团在罐里使发酵
液粘度过高进而影响产抗。因此，试验结果28t: 士o.6t:为最佳温度段。 2.溶解氧 氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，这样可以提高氧在发酵液中的溶解度。阿维菌素发酵过程中，溶氧常成为限制因素。供氧不足导致菌体生长不良和抗生素产量下降，但其菌丝对剪切很敏感。因此在发酵中，若控制不当很容易菌丝发散、断裂、导致粘度过高，一旦出现这种不正常的现象，将不可能得到很高的效价。一般来说，发酵的前期由于菌形尚未定型，菌丝也较娇嫩，当受到强烈的剪切时容易发糊；可以说剪切是发糊的直接原因。 通过调整旋转摇床机进行强力搅拌(220-260r/min)，提高氧在发酵液中的溶解度即增加溶氧。经过多次试验结果表明在阿维菌素发酵瓶10-11天培养中，不能停下来摇床，不断观察发酵瓶颜色、粘稠度、气味。停下摇床会降低发酵瓶溶氧量，影响阿维菌素Bla的含量，降低阿维菌素的产抗能力。最适转速为250r/min。
3.转种种龄 接入种子摇瓶中的种子，随着培养时间的延长，菌丝量增加，但由于基质的消耗、代谢产物的积累及菌丝体的死亡，菌丝量不再增加，而逐渐趋于老化。因此选择由种子瓶转发酵瓶的适当的接种龄显得的十分重要。选择接种龄的菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还为达到最高峰时，进行接种为最佳，种龄从24小时变化到26小时，ra急剧下降；选择24小时为种子瓶转发酵瓶最佳时间。种龄从22小时到24小时低
孢子接种量的情况下，ra缓慢上升，ra下降期延后，而高孢子接种量下，ra值明显下降，说明高孢子接种量下，ra下降期提前。 在斜面低孢子量接种种子瓶的情况下，选择26小时为种子瓶转发酵瓶最佳时间。在斜面高孢子量接种种子瓶的情况下，选择22小时为种子瓶转发酵瓶最佳时间。
4.接种量 接种量的大小取决于生产菌种在发酵摇瓶中生长繁殖的速度。采用较大的接种量可以縮短发酵摇瓶中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。这是由于种子量多，同时种子液中含有大量体外水解酶类，有利于对基质的利用和产物的合成，并且生产菌素迅速占据了整个培养环境减少了杂菌生长的机会。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。而接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还会引起其他不正常情况，有时候会出现大量菌丝团。因此要按发酵液比例，将接种量控制在4_5%左右为最佳。
5. pH
在微生物的生长过程中必须保持一定的pH值，但发酵过程往往pH有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。此外，PH还会影响培养基中营养物质的分解等。因此，应控制发酵液的pH，试验结果表明pH 6. 0-7. 5最佳，过高或过低，都会减低发酵的能力。斜面ra调至7.5±0. 1，种子培养基ra调至7. 2±0. 1，发酵培养基ra调至7. 5±0. 1为佳。 综上所述，在发酵过程中，严格控制温度，使其温度在28°C ±0. 6t:范围内；调pH
在6. 0-7. 5范围内；在恒温间培养时要以220-260r/min的转速来调节氧在发酵液中的溶解
度以250r/min为最佳；接种量在4_5%。通过这些发酵条件的严格控制以及优化工艺，使
菌种的生产能力充分表达。 AVMBla高浓度累积代谢调控的试验 微生物在正常生长条件下，可以通过自我调节使机体内的代谢途径与代谢类型互相协调与平衡，通常不会过量积累初级代谢产物。但在人为条件的控制下，可以使微生物过量产生各种初级代谢产物和次级代谢产物。 各种营养物质对微生物生长代谢及产物合成都很重要，但在为微生物提供营养物质时，必须严格掌握各种营养物质的浓度和比例，这不仅仅是为了维持正常的渗透压，或是节约原材料，还在于营养物质的浓度和比例直接影响菌体的繁殖和产物的积累。
微生物生长所需的营养主要是碳源和氮源两大类，他们都是从发酵培养基中获得的。阿佛曼链霉菌发酵培养基的碳源一般为淀粉类物质；有机氮源大多是花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆以及蛋白胨等。由于发酵培养基荷重很大，要消耗大量粮食，增加生产成本，有可能就要寻找代用品。为了延长微生物的生长期，增加产品的产量，我们在前人的基础上，结合甘肃的作物资源优势，最终优选确定了合适阿维菌素高浓度累积的碳源与氮源。
1.营养物质的配方 发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。 对正突变株生长的代谢曲线和产抗曲线进行反复摸索与试验研究，根据菌种的营养代谢特性，结合作物资源优势，得到了如下发酵培养配方，使突变株能够很好地积累阿维菌素目的产物。 1. 1发酵培养基配方淀粉110g、糊精20g、豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉10g、氯化钴0. 01g、豆油5g、酵母膏5g。 配置顺序(l)先量取自来水600ml倒入1号烧杯中煮沸，秤取110g淀粉打成糊状淀粉倒入沸水中充分糊化；(2)用万分之一天平准确称取氯化钴0. Olg加入2号烧杯，加水300ml，置磁力搅拌器上搅拌溶解，待氯化钴充分溶解后再秤取豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉10g、糊精20g加入2号烧杯，待充分混匀后移入1号烧杯；(3)用3号小烧杯准确称量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒搅拌溶解，溶解完全后加入1号烧杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不断搅拌，所用物质都混合均匀；(4)用酸度计调ra至7.5，用电炉加热煮沸，用磁力搅拌器边搅拌边分装到种子瓶中，每个种子瓶滴加豆油3-4滴，包扎后高压灭菌(121°C 22min)。 分瓶称量配制并分别调ra的传统配置方法，优点是每个发酵瓶营养物质均匀，但费时费力。但每瓶之间的营养物质、K1误差较大。本发明的方法用磁力搅拌器边搅拌边分
6装克服了营养物质沉淀分装不均匀的缺点，同时各瓶营养物质更准确、统一，ra值均一，省时省力。 1. 2种子瓶培养基配方糊精10g、淀粉15g、豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉6g、酵母膏5g、氯化钴0. 01g、豆油5g。 配置顺序(1)先量取自来水600ml倒入1号烧杯中煮沸，秤取15g淀粉打成糊状淀粉倒入沸水中充分糊化；(2)用万分之一天平准确称取氯化钴0. Olg加入2号烧杯，加水300ml，置磁力搅拌器上搅拌溶解，待氯化钴充分溶解后再秤取豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉6g、糊精10g加入2号烧杯，待充分混匀后移入1号烧杯；(3)用3号小烧杯准确称量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒搅拌溶解，溶解完全后加入1号烧杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不断搅拌，所用物质都混合均匀；(4)用酸度计调K1至7.2，用电炉加热煮沸，用磁力搅拌器边搅拌边分装到种子瓶中，每个种子瓶滴加豆油3-4滴，封口后高压灭菌(121°C 22min)。与原来配制方法相比，营养物质统一配制，统一调ra值后，分装种子瓶，避免以往
分瓶配制营养物质，调PH值，各瓶之间营养物质和PH值的差异问题，且省时省力。
2.营养物中的微量元素为了使ra值恒定在符合微生物生长或微生物累积次级代谢产物的需要，必须在
培养基内加入可以供微生物利用的微量元素，而又能使培养基ra值相对保持的缓冲体系。
试验证明硫酸铵在营养物中是很好的微量元素的供应物，硫酸铵在培养过程中分解为氨和
硫酸，氨可以利用，硫酸又可以降ra值。在上述培养基的配方中硫酸铵添加量为o.o2g。 在阿佛曼链霉菌正突变菌株发酵培养过程中，对上述营养物反复的试验与验证，
发现突变菌株的最佳产抗ra等生理生化特性与原出发菌种相比较产生了一定的变化，能
促使诱导产物累积，使突变株生产能力得到很好的表达。 3.消泡剂 在阿佛曼链霉菌发酵过程中，要对培养基通气搅拌、阿维的代谢过程及培养基中
某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。虽然在发酵过程中产生一定数量的泡沫是正常现象，但过多的持久性泡沫对发酵是不利的。因为泡沫会占据发酵罐的容积，影响通气和搅拌的正常进行，甚至导致代谢异常，必须消除泡沫。 因此，在配制种子、发酵培养基时要加入消除泡沫的辅料。
4.前体诱导物 某些化合物被加入培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大变化，却能提高产物的产量，这类小分子物质被称为前体物质。
在培养基优化过程中，经过试验验证，在突变株发酵培养基配方中加入一定量的丙酸钠等前体物质能诱导产物累积，使突变株生产能力得以很好的表达。
本发明的有益效果如下 1.阿佛曼链霉菌种经12C+6重离子辐照诱变后再经本发明提供的选育工艺选育出了高产稳定的生产菌种，使阿维菌素发酵效价稳定地达到5800i！ g/ml以上的高度，创造了目前国内外业界的最高水平。 2.本发明工艺具有可控、可调、可多次重复的特点。 3.结合当地的资源特点，提供的培养基成本低，资源丰富，具有显著的社会效益和
7经济效益。
具体实施例方式
—、配制培养基 1.发酵瓶培养基 (1)先量取自来水600ml倒入1号烧杯中煮沸，秤取15g淀粉打成糊状淀粉倒入沸水中充分糊化； (2)用万分之一天平准确称取氯钴0. Olg加入2号烧杯，加水300ml，置磁力搅拌器上搅拌溶解，待氯化钴充分溶解后再秤取豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉6g、糊精10g加入2号烧杯，待充分混匀后移入1号烧杯； (3)用3号小烧杯准确称量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒搅拌溶解，溶解完全后加入1号烧杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不断搅拌，所用物质都混合均匀；
(4)用酸度计调ra至7. 5，用电炉加热煮沸，用磁力搅拌器边搅拌边分装到250ml烧杯(40ml/瓶)，每个种子瓶滴加豆油3-4滴，封口后高压灭菌(121°C 22min)。
2.种子瓶培养基 (1)先量取自来水600ml倒入1号烧杯中煮沸，秤取110g淀粉打成糊状淀粉倒入沸水中充分糊化； (2)用万分之一天平准确称取氯钴0. Olg加入2号烧杯，加水300ml，置磁力搅拌器上搅拌溶解，待氯化钴充分溶解后再秤取豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉10g、糊精20g加入2号烧杯，待充分混匀后移入1号烧杯； (3)用3号小烧杯准确称量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒搅拌溶解，溶解完全后加入1号烧杯，并多次用水冲洗小烧杯将冲洗液倒入大烧杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不断搅拌，所用物质都混合均匀； (4)用酸度计调ra至7. 2，用电炉加热煮沸，用磁力搅拌器边搅拌边分装到250ml烧杯(40ml/瓶)，每个种子瓶滴加豆油3-4滴，封口后高压灭菌(121°C 22min)。
二、发酵选育 1.经12C+6重离子辐照诱变的阿佛曼链霉菌种，辐照剂量为50Gy，进行发酵选育，发酵温度(28-0. 6) °C ，发酵液5，摇瓶机转速220r/min，接种种龄22小时，接种量4% 。
2.经12C+6重离子辐照诱变的阿佛曼链霉菌种，辐照剂量为50Gy，进行发酵选育，发酵温度28°C ，发酵液0，摇瓶机转速250r/min，接种种龄24小时，接种量4. 5% 。
3.经12C+6重离子辐照诱变的阿佛曼链霉菌种，辐照剂量为70Gy，进行发酵选育，发酵温度(28+0. 6) °C ，发酵液PH7. 5，摇瓶机转速260r/min，接种种龄26小时，接种量5% 。
在上述三种实施例中，培养基加入硫酸铵0. 02g，并视泡沫量加入消泡剂泡敌和前体诱导物丙酸钠。 以上实施例，均能达到本发明的目的。
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权利要求
阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺，其特征为菌种在发酵培养基中发酵温度为28±0.6℃，种子培养基PH 7.0-7.2发酵培养基PH 6.5-7.5，调节氧溶解度的摇床机转速220-260r/min、接种种龄22-26小时，发酵液中的接种量4-5％。
2. 根据权利要求1所述的阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺，其特征为摇瓶机转速为250r/min。
3. 根据权利要求1所述的阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺，其特征为发酵培养基含有下列物质淀粉、糊精、豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、酵母膏、氯化钴、豆油、水。
4. 根据权利要求1所述的阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺，其特征为发酵瓶发酵培养基的配方为淀粉110g、糊精20g、豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉10g、氯化钴0. 01g、豆油5g、水1000ml。
5. 根据权利要求1所述的阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺，其特征为种子瓶发酵培养基的配方为淀粉15g、糊精10g、豆饼粉12g、花生饼粉8g、酵母粉6g、酵母膏5g、氯化钴0. 01g、豆油5g、水1000ml。
全文摘要
本发明为阿佛曼链霉菌种经重离子辐照诱变后的高效价菌种的选育工艺，涉及抗生素选育领域，本发明是对重离子辐照后的进一步选育研究，以获得最佳选育工艺，本发明提供的工艺为发酵温度(28±0.6)℃，发酵培养基pH6.5-7.5，摇瓶机转速220-260r/min，接种种龄22-26小时，接种量4-5％，发酵培养基的组份为淀粉、糊精、豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、酵母膏、氯化钴、豆油和水，本发明具有发酵效价高，6000μg/ml以上，工艺可靠、可控、可调、稳定，培养基资源丰富，成本低的有益效果。
文档编号C12N15/01GK101768586SQ20081018796
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者刘敬, 李文建, 王曙阳, 陈积红, 颉红梅 申请人:中国科学院近代物理研究所