利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，首先取赤霉菌菌株用无菌水制成108~109个/mL的原生质体悬浮液；将原生质体悬浮液涂布到培养皿中风干；将氮离子束脉冲注入到风干后的原生质体内，诱发菌体变异；将诱变后的原生质体加入山梨醇溶液冰浴，悬浮后涂布于PDAS再生培养基平板中培养；将生长良好的单菌株接种于盛装液体发酵培养基的摇瓶中进行振荡培养，即可获得赤霉酸高产菌株。本发明的优点在于利用氮离子束脉冲注入的方式对赤霉菌进行诱变，可选育出高产的赤霉菌突变株，采用本发明方法，突变株正突变率可达10%~40%，发酵效价比出发菌株提高30~90%。
【专利说明】利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物诱变技术，尤其是涉及一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉 酸高产菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 赤霉酸（gibberellic acid)是一种属于双廠类化合物的植物生长调节剂，具有促 进种子发芽和植物生长、提早开花结果等作用，对农作物、蔬菜的产量和品质都有明显的促 进作用，在农业生产和酿造业中有着广泛应用。随着农业技术的推广和蔬菜水果种植业的 扩大，赤霉酸的需求量提高很快，生产量满足不了市场实际需求量。
[0003] 赤霉酸主要依靠藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi)发酵生产。赤霉酸的生产 至今已半个世纪的历史，菌种的改良主要依靠 UV、X射线、同位素6tlCo照射和化学法诱变 等传统的育种方法，一般的诱变剂效果并不明显，未能取得较满意的结果。另一方面，抗性 筛选菌株因具有代谢定向特性而受到重视，但是存在着目标不明确，费时费力而且收效不 明显的问题。如：李武军等对菌体原生质体进行诱变，原生质体融合重组选育；构建携带血 红蛋白基因的藤仓赤霉菌工程株等；张金儿等应用氯霉素抗性筛选法，获得赤霉素产量高 于出发菌20%的阳性氯霉素抗性突变株；王卫等采用制霉菌素抗性筛选获得产赤霉素能力 提1? 16. 8%的菌株等。目如国内外赤霉素的生广效价呈现出徘徊不如的状态，而且有的生 产菌种出现退化。国内外大规模商业化的赤霉酸生产均通过赤霉菌经液态深层发酵后对发 酵液的提取而获得，赤霉酸的发酵水平也参差不齐，约在I. 2~2g/L之间。因此，提高赤霉酸 的发酵效价，从现有菌种出发，通过诱变筛选出更加高产的菌株，进一步提高赤霉酸的发酵 水平十分必要。
[0004] 近些年来，离子束作为一种新的诱变源，在微生物诱变育种方面因其独特的诱变 机理和生物学效应而发展迅速。与传统诱变源相比，低能离子束注入是一种集物理与化学 诱变特性为一体的综合诱变技术，它能够在低剂量注入的情况下，引起染色体的畸变，导致 DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因或分子水平上发生改变或缺失，明显提高 变异的频率，获得对生物体生理损伤小、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变效果。
[0005] 离子注入技术被应用于微生物优良菌株的选育和改良研究中，已选育出一些在工 业上具有较大应用前景的生物新品种，并取得了显著的经济和社会效益。而把低能离子束 注入法用于赤霉酸生产菌株的选育，则还未见有相关专利和文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方 法，该方法可有效提高赤霉酸的产量。
[0007] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，包括下述步骤： 第一步，原生质体的制备： 取赤霉菌菌株用无菌水制成108~109个/mL的原生质体悬浮液； 第二步，氮离子注入诱变： 将第一步得到的原生质体悬浮液涂布到培养皿中，无菌状态下风干；将能量IOlOkeV 的氮离子束脉冲注入到风干后的原生质体内，诱发菌体变异； 第二步，1?广菌株的筛选和获得： 将第二步诱变后的原生质体加入浓度lmol/L的山梨醇溶液冰浴，悬浮后涂布于PDAS 再生培养基平板中培养；将培养出的生长良好、直径2~4_的单菌株接种于盛装液体发酵 培养基的摇瓶中进行振荡培养，即可获得发酵效价I. 8~2. lg/L的赤霉酸高产菌株。
[0008] 第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl, pH7. 5 ;50mmol/L的 CaCl2。所用的PDAS固体再生培养基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3. 59Γ4. 1%，琼脂 1. 5%?2%，ρΗ6· 0?6· 5。
[0009] 本发明的优点在于利用氮离子束脉冲注入的方式对赤霉菌进行诱变，可选育出高 产的赤霉菌突变株，采用本发明方法，突变株正突变率可达1〇%~40%，发酵效价比出发菌株 提高3(Γ90%。与其他传统的物理化学诱变方法相比，本发明的优点体现在如下几点： 1、 由于离子束注入诱变是一种集物理和化学诱变特征于一体的综合诱变，具有对生物 细胞损伤小的特点，因此采用该方法诱变的菌株正突变率高，诱变效果好； 2、 采用本发明方法选育出的高产赤霉酸菌株，具有高产性状稳定，不易丢失的优点，经 过10代以上转接，效价仍能保持筛选后的水平，产赤霉酸量在I. 9~2. 3g/L之间。
[0010] 3、采用本发明诱变筛选的高产赤霉酸菌株，经过3m3发酵罐试验，效价仍能保持较 高水平，产赤霉酸量在1.8~2. lg/L。见下表1。证明本发明方法筛选出的菌株有利于大规 模工业化生产。
[0011] 表1本发明选育的高产菌株与出发菌株的产量比较
【权利要求】
1. 一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，其特征在于：包括下述 步骤： 第一步，原生质体的制备： 取赤霉菌菌株用无菌水制成108~109个/mL的原生质体悬浮液； 第二步，氮离子注入诱变： 将第一步得到的原生质体悬浮液涂布到培养皿中，无菌状态下风干；将能量KT20keV 的氮离子束脉冲注入到风干后的原生质体内，诱发菌体变异； 第二步，1?广菌株的筛选和获得： 将第二步诱变后的原生质体加入浓度lmol/L的山梨醇溶液冰浴，悬浮后涂布于PDAS 再生培养基平板中培养；将培养出的生长良好、直径2~4mm的单菌株接种于盛装液体发酵 培养基的摇瓶中进行振荡培养，即可获得发酵效价1. 8~2. lg/L的赤霉酸高产菌株。
2. 根据权利要求1所述的利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，其 特征在于：第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mm〇l/L的Tris-Cl, pH7. 5 ;50mmol/L的 CaCl2。
3. 根据权利要求1所述的利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法， 其特征在于：第三步中所用的PDAS固体再生培养基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3. 5%?4. 1%，琼脂 1. 5%?2%，pH6. 0?6. 5。
【文档编号】C12N15/01GK104388418SQ201410671197
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】张一折, 张书杰, 朱朝印, 马轩, 刘建华, 方业忠 申请人:郑州大学, 孟州农达生化制品有限公司