基于磁珠法提取淤泥微生物基因组dna的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于磁珠法提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，属于生物技术 领域。 技术背景
[0002] 淤泥中蕴含着丰富的微生物，不同的微生物有着不同的价值，研究表明在淤泥中， 微生物群落共同合作将分子量更大、结构更复杂的有机化合物分解成醋酸盐的形式。然后， Geobacters微生物菌种就将电子从醋酸盐中转移至产生电能的电极。一些Geobacter能够 将有毒的有机物如甲苯等转化为带电，然而更深入地了解微生物发电的原理，以及其他微 生物的作用，需要利用基因组学对其进行研究。
[0003] 传统的分离培养微生物的方法是淤泥微生物多样性研究最早运用的方法。但是， 能够在培养基上生长的细菌仅占不到环境微生物总量的1 %。近10年来日益成熟的分子生 物学技术突破了传统技术手段的局限，给淤泥微生物研究带来了新的希望。建立高效可靠 的淤泥微生物总DNA提取方法，是进行微生物分子生态学研究的基础。
[0004] 为了更好地进行淤泥微生物基因组学的相关研究，研发一种方便、快捷的淤泥微 生物基因组DNA提取试剂盒才能满足日益发展的淤泥微生物基因组学的发展。
【发明内容】
： 本发明提供一种基于磁珠法提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，该试剂盒与常规的 淤泥微生物基因组DNA提取方法相比更加方便、快捷。本试剂盒主要是利用硅基磁珠特异 性吸附基因组DNA的原理研发而成的，能够大规模的提取淤泥微生物基因组DNA，具有一定 的经济价值。
[0006] -种基于磁珠法提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，包括淤泥微生物细胞的破 碎、杂蛋白的抽除，磁珠法回收微生物基因组，具体步骤如下： 淤泥微生物细胞的破碎：称取l_2g淤泥样品于IOml离心管中，加入4-6ml Buffer A 溶液，震荡3-5min混匀，加入溶菌酶至终浓度为3-10mg/ml，震荡5-10min混匀。37°C， 225-300r/min摇床上震荡1-2h，加入600-800 μ I Buffer B溶液，震荡5-10min混匀后 60-70°C水浴l_2h，期间每10-20min震荡混匀l-2min， 杂蛋白的抽除：往溶液中加入4-5ml Buffer C，振荡器震荡30-60s后， 12000-13000rpm/min离心10_20min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的Buffer D， 12000-13000rpm/min离心10_20min，将上清移至新的离心管中。
[0007] 磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的Buffer E。震荡10-20s。室温放置 5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸 去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入l_2ml Buffer F，打匀后室温静止5-10min， 将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保 留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入50-100 μ I Buffer G，将离心管放在磁力架上，进行磁 珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为淤泥微生物基因组DNA。 于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0008] 所述的磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum。购买自温州安科纳米科技有限公司，产 品编号：AK1-G1000。
[0009] 所述的Buffer A :0· 1-0. 2mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，0· 1-0. 2mol/L 乙二胺 四乙酸（EDTA)，0· 1-0. 2mol/L磷酸钠，I. 5-2mol/L氯化钠（Nacl)，1-2%十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB)，PH = 7. 0-9. 0。
[0010] 所述的Buffer B:20-30%质量体积比的十二烷基硫酸钠（SDS)。
[0011] 所述的Buffer C:酸：氯仿：异戊醇的体积体积比为25:24:1。
[0012] 所述的Buffer D:氯仿：异戊醇的体积体积比为24:1。
[0013] 所述的Buffer E :异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比配置。
[0014] 所述的 Buffer F :4· 3-21. 4mmol/L 三轻甲基氨基甲烧（Tris)，2. 1-4. 2mmol/L 乙 二胺四乙酸（EDTA) ,42. 9-85. 7mmol/L Nacl，60-80%无水乙醇。
[0015] 所述的 Buffer G ：8~1 Ommol /], Tris 三轻甲基氨基甲烧（Tris)，PH = 8. 0-9. 0。
[0016] 本发明的显著优点： 一种基于磁珠法提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，该试剂盒与常规的淤泥微生物 基因组DNA提取方法相比更加方便、快捷。本试剂盒主要是利用硅基磁珠特异性吸附基因 组DNA的原理研发而成的，操作简便，大大缩短常规淤泥微生物基因组DNA提取流程。能够 大规模的提取淤泥微生物基因组DNA，该试剂盒具有一定的经济价值。
【附图说明】： 图1为利用试剂盒提取的淤泥微生物基因组的电泳检测图。 具体实施例
[0018] 图1中，泳道1，2是利用本试剂盒提取到的淤泥微生物基因组，泳道3为TAKARA 公司的 DL4500Marker。
[0019] -种基于磁珠法提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，具体步骤如下： (1) 淤泥微生物细胞的破碎：称取I. 5g淤泥样品于IOml离心管中，加入4ml Buffer A 溶液，震荡5min混匀，加入溶菌酶至终浓度为3mg/ml，震荡5min混匀。37°C，225r/min摇 床上震荡lh，加入600 μ I Buffer B溶液，震荡5min混匀后65°C水浴2h，期间每IOmin震 荡混勾lmin， (2) 杂蛋白的抽除：往溶液中加入4ml Buffer C，振荡器震荡30-60s后， 12000-13000rpm/min离心10_20min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的Buffer D， 12000-13000rpm/min离心10_20min，将上清移至新的离心管中。
[0020] (3)磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的Buffer E。震荡10-20s。室温放置 5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸 去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入l_2ml Buffer F，打