μ I 反应体系，包括 25 μ I 2XGoldStar TaqMan Mixture(With ROX)，I μ I Forward Primer, 10 μΜ (终浓度 0.2 μ Μ), I μ I Reverse Primer, 10μΜ (终浓度 0.2 μΜ), I μ I Probe, 10 μΜ (终浓度 0.2 μΜ)，2 μ I Template DNA,up to50 μ I with RNase-Free Water0
[0079]PCR反应条件为:步骤1:预变性，温度95°C，时间10 min ;步骤2:变性，温度95°C，时间15s ;步骤3:退火/延伸，温度60°C，时间I min ;重复上述40个循环。
[0080]利用SDS2.3 软件(Applied B1systems)分析数据。
[0081]实验结果表明，所述介导植物生育力的构建体(包含完整的T-DNA区)己经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且获得了具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株Msl-1 (转化pMCS0101)、Msl-3 (转化pMCSO 103)和转基因玉米植株Msl_4(转化 pMCSO 104)。
[0082]、雄性不育保持系和不育系的鉴定和繁殖
使所述转基因玉米植株Msl-1 (T。)自交，收获自交T1种子Msl-1 (T1)0如图12-8所示，50%的所述自交T1种子Msl-1 (T1)表皮为红色，在荧光下观察呈现红色荧光，所述红色焚光种子标记为Msl-1 ( + );另50%的所述自交T1种子Msl-1 (T1)表皮为黄色或乳白色，荧光下观察无红色荧光，所述无红色荧光种子标记为Msl-1 (_)。
[0083]种植上述Msl-1 ( + )和Msl-1 (_)种子直至长到3叶期，用3mg/L除草剂喷洒所述Msl-1 ( + )和Msl-1 (_)植株，根据在除草剂处理后第5天观察到的叶子损伤情况来确定植株是否损伤。实验表明，所述Msl-1 ( + )植株基本上没有显示出叶子损伤，所述Msl-1(-)植株则有明显的叶子损伤。
[0084]上述荧光观察结果和除草剂抗性结果表明所述介导植物生育力构建体以预计频率传递给了后代，即Msl-1 ( + )为包含所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株(保持系植株)。Msl-1 (-)为msl纯合隐性的不含所述构建体的植株(不育系植株)。
[0085]、转基因植株花粉育性的分析
为确定转基因植株中抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒的表达效果，我们以具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株(图15)加以评估，以该转基因植株做父本，非转基因玉米对照植株Hi I1-A做母本进行测交分析。10.78万粒杂交的种子在荧光显微镜下观察，没有发现具有红色荧光的种子。表明所授的花粉是不含转基因成分的，这也说明所述表达盒已起到抑制雄配子细胞正常发育的作用。
[0086]相关参考文献
1.Allen, R.L.and Lonsdale, D.Μ.(1993).Molecular characterizat1n of oneof the maize polygalacturonase gene family members which are expressed duringlate pollen development.Plant J.3, 261-271. 2.Brooks, J.Ε.，R.M.Blumenthalj and Τ.R.Gingeras.(1983).Theisolat1n and characterizat1n of the Escherichia coli DNA adenine methylase(dam) gene.Nucleic Acids Res.11，837-851.3.An, G., Mitraj A., Choi, H.K., Costa, M.A., An, K., Thornburg, R.ff.,Ryan, C.A.(1989)， Funct1nal analysis of the 3’ control reg1n of the potatowound-1nducible proteinase inhibitor II gene.Plant Cell 1， 115-122.4.Franck A，Guilley H，Jonard G，Richards K，Hirth L.(1980).Nucleotidesequence of cauliflower mosaic virus DNA.Cell 21， 285-294.5.Kalla, R.，Shimamotoj K.，Potter, R.，Nielsen, P.S.，Linnestadj C.，and Olsen, 0.A.(1994).The promoter of the barley aleurone-specific geneencoding a putative 7 kDa lipid transfer protein confers aleurone cell-specificexpress1n in transgenic rice.Plant J.6， 849-860.6.An, G.(1987).Binary Ti vectors for plant transformat1n and promoteranalysis.Meth Enzymo1.153，29-305.7.Hood, E.E.，Gelvinj S.B.，Melchersj S.，Hoekemaj A.(1993).NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research2:208-218.
【主权项】
1.一种介导玉米雄性生育力的多控不育构建体，其特征在于，包含四种类型基因表达盒:第一种表达盒，为雄性不育玉米育性恢复基因的表达盒；第二种表达盒，为抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒；第三种表达盒，为标记玉米种皮颜色的表达盒；第四种表达盒，为除草剂抗性基因表达盒。2.根据权利要求1所述的雄性不育玉米育性恢复基因的表达盒，其特征在于:雄性不育玉米育性恢复基因的表达盒由启动子、雄性不育玉米育性恢复基因和终止子可操作地相连。3.根据权利要求2所述的启动子选自玉米Ubiquitin基因、5126或基因的的启动子。4.根据权利要求2所述的雄性不育玉米育性恢复基因为基因，其对于玉米的雄性生育力是关键的。5.根据权利要求2所述的终止子选自农杆菌章鱼碱合酶(Ocs)基因的终止子。6.根据权利要求1所述的构建体，可以包含I个或2个抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒。7.根据权利要求1所述的抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒，其特征在于:抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达盒由启动子、抑制玉米雄配子体的形成或功能的基因和终止子可操作地相连。8.根据权利要求7所述的启动子可以为聚半乳糖醛酸酶47(PG47)基因的调控序列、 基因的调控序列。9.根据权利要求7所述的抑制玉米雄配子体的形成或功能的基因可以为淀粉酶基因、DAM甲基化酶基因或细胞毒素基因。10.根据权利要求7所述的终止子是玉米基因的终止子或马铃薯蛋白酶抑制剂II (Pin II)的终止子。11.根据权利要求1所述的标记玉米种皮颜色的表达盒，其特征在于:标记玉米种皮颜色的表达盒由启动子、玉米种皮颜色标记基因和终止子可操作地相连。12.根据权利要求11所述的启动子是玉米种皮特异表达的启动子。13.根据权利要求11所述的玉米种皮颜色标记基因，其特征在于:玉米种皮颜色标记基因可以为但不限于红色荧光基因、绿色荧光基因。14.根据权利要求11所述的终止子是胭脂碱合成酶基因(Afes.)、章鱼碱合成酶基因(Ocs)的终止子。15.根据权利要求1所述的除草剂抗性基因的表达盒，其特征在于:除草剂抗性基因的表达盒由启动子、除草剂抗性基因和终止子可操作地相连。16.根据权利要求15所述的启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。17.根据权利要求15所述的除草剂抗性基因可以为但不限于EPSPS基因、基因或BAR基因。18.根据权利要求15所述的终止子是来自花椰菜花叶病毒的35SpolyA终止子。19.一种包含权利要求1所述构建体的重组载体。20.一种包含权利要求1所述构建体的植物细胞，所述植物为玉米。21.—种方法，用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括: (a)提供第一植株，其包含基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；(b)创制第二植株，所述第二植株是向上述第一植株中引入权利要求1所述构建体，且所述构建体只存在于同源染色体的其中一条染色体上，即所述构建体为半合子状态；所述第二植株包含基因的纯合隐性等位基因；(c)用所述第二植株的雄性配子给所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代。22.—种方法，用于繁殖含有所述构建体的玉米多控不育保持系种子和不含任何转基因元件的不育系种子；所述方法包括:(a)通过权利要求21所述的第二植株自花受精；(b)产生50%的含有所述构建体的种子；(c)产生50%的正常不育系种子。23.根据权利要求22所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的种子的方法，其特征在于，所述鉴定具有所述构建体种子的方法具体为:将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体(父本)，与其它正常育性植株(作为母本)杂交，所获得Fl种子全部是正常颜色种子(非焚光种子)。24.根据权利要求22所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的种子的方法，其特征在于，所述鉴定具有所述构建体的种子具体为:将所述第二植株的种子在荧光显微镜下观察，含有所述构建体的种子具有红色荧光。25.根据权利要求22所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的植株的方法，其特征在于，所述鉴定具有所述构建体的植株具体为:种植所述第二植株自交后产生的种子；使所述种子长成待鉴定植株；用除草剂喷洒所述待鉴定植株，具有所述构建体的植株与不含所述构建体的植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。
【专利摘要】本发明涉及生物技术中的基因工程领域，公开了一种能恢复玉米雄性不育植株育性的多控不育构建体及其应用。该构建体包含四种类型基因表达盒：第一种表达盒为玉米雄性不育的育性恢复基因表达盒；第二种表达盒的作用为抑制玉米的雄配子体的形成或功能；第三种表达盒为标记玉米种皮颜色的表达盒；第四种表达盒为除草剂抗性基因的表达盒。将所述构建体导入玉米细胞、愈伤组织或器官中,可用于介导恢复雄性不育玉米的雄性生育力，用于保持雄性不育系的雄性不育等位基因的纯合隐性状态并获得非转基因的玉米多控不育系种子，以及含有所述构建体的植株通过自交来繁殖获得多控不育保持系种子。本发明应用于玉米不育化杂交育种和杂交制种，具有巨大的农业生产应用价值。CGMCC No.1044420150127
【IPC分类】C12N15/11, C12N5/10, C12N15/82, A01H1/02
【公开号】CN105018475
【申请号】CN201510298173
【发明人】万向元, 吴锁伟, 谢科, 安学丽, 李金萍, 张丹凤, 肖中华, 刘慎思
【申请人】北京首佳利华科技有限公司, 北京普华博奥生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月3日